吳躍開(kāi),劉童童,李繼業(yè)

(1.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院,貴州貴陽(yáng) 550005;2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

蕭氏松莖象(HylobitelusxiaoiZhang)屬鞘翅目(Coleptera)象甲科(Curculionidae)松莖象屬(Hylobitelus),能夠危害濕地松、火炬松、馬尾松、華山松、黑松等松屬植物,在江西、湖南、湖北、廣西、廣東、貴州和福建等省(區(qū))均普遍發(fā)生,已造成樹(shù)木死亡,被確定為我國(guó)林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物種類(lèi)之一[1]。目前,生產(chǎn)實(shí)踐中大多采取營(yíng)林措施、人工捕捉、引誘器誘殺、化學(xué)防治等方法對(duì)該害蟲(chóng)進(jìn)行防治,但由于蕭氏松莖象具有不同于其他森林害蟲(chóng)的危害特點(diǎn)及生活習(xí)性,如幼蟲(chóng)蛀食干基韌皮部并排出大量松脂,成蟲(chóng)活動(dòng)隱蔽、不善飛翔等,這些常規(guī)防治方法均具有明顯的局限性,存在操作及推廣難度大 、效率低、成本高和污染環(huán)境等問(wèn)題,導(dǎo)致蕭氏松莖象的危害持續(xù)發(fā)生并不斷擴(kuò)散蔓延,情勢(shì)愈來(lái)愈嚴(yán)重。尋找一條經(jīng)濟(jì)、安全、持續(xù)有效的途徑來(lái)控制蕭氏松莖象的發(fā)生危害已成為當(dāng)前林業(yè)生產(chǎn)上亟待解決的重大問(wèn)題。

研究表明,昆蟲(chóng)病原真菌是自然界控制害蟲(chóng)群體的主要因素。在自然界,由真菌致死的昆蟲(chóng)約占全部病原微生物致病死亡的60%。多年的研究和生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)踐表明,昆蟲(chóng)病原真菌具有很多優(yōu)點(diǎn):多數(shù)種類(lèi)專(zhuān)化性不強(qiáng),寄主范圍較廣,能防治多種害蟲(chóng);不需要非得從消化道侵入蟲(chóng)體,體壁、氣孔均可入侵,增加感染害蟲(chóng)的機(jī)會(huì);真菌孢子具有較強(qiáng)的抗逆性,有的可在環(huán)境中存活幾年,有的在缺乏寄主時(shí)可營(yíng)腐生生活,有利于種群的建立和延續(xù);容易人工培養(yǎng),可進(jìn)行大量生產(chǎn)乃至工廠化生產(chǎn);對(duì)人及天敵無(wú)害,不污染環(huán)境;在自然環(huán)境可不斷增殖,能長(zhǎng)期控制蟲(chóng)害且不易使其產(chǎn)生抗性[2-3]。研究表明,蕭氏松莖象的發(fā)生與森林環(huán)境中的光照、溫度、濕度等關(guān)系密切,具體而言,其喜歡光照、氣溫均相對(duì)較低,空氣及土壤溫度相對(duì)較高的林分環(huán)境[4-5],這與許多重要昆蟲(chóng)病原真菌如白僵菌和綠僵菌對(duì)溫濕度及光照的要求非常接近,為昆蟲(chóng)病原真菌的應(yīng)用提供了極為有利的前提條件。

基于上述優(yōu)點(diǎn),昆蟲(chóng)病原真菌的開(kāi)發(fā)利用已成為解決蕭氏松莖象科學(xué)防控這一問(wèn)題的重要途徑。鑒于此,筆者通過(guò)開(kāi)展野外調(diào)查,結(jié)合人工誘集措施,收集蕭氏松莖象感病蟲(chóng)體并進(jìn)行病原菌的分離與鑒定,并對(duì)所分離到的菌種或菌株進(jìn)行初步的致病性測(cè)試,以期為蕭氏松莖象的生物防治提供物質(zhì)基礎(chǔ)及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原真菌的調(diào)查采集

1.1.1自然采集。調(diào)查地點(diǎn)選擇在貴州省貴陽(yáng)市和安順市等地區(qū),在蕭氏松莖象發(fā)生危害的典型林分進(jìn)行常年野外調(diào)查,采集野外自然感病僵死的害蟲(chóng)個(gè)體,帶回室內(nèi)進(jìn)行鏡檢及分離培養(yǎng)。分離時(shí),如蟲(chóng)體上生長(zhǎng)明顯的菌絲層,則挑取菌絲進(jìn)行分離;若體表菌絲層不明顯,則保濕恒溫培養(yǎng)(28 ℃、80%～100%)直至菌絲長(zhǎng)出,再挑取菌絲進(jìn)行培養(yǎng)純化,或?qū)οx(chóng)體表面進(jìn)行消毒后進(jìn)行組織分離培養(yǎng)。培養(yǎng)基均選擇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

1.1.2土壤誘集。病菌誘集所用的土壤重點(diǎn)考慮采自森林環(huán)境,這是由于森林生態(tài)系統(tǒng)相對(duì)復(fù)雜,林地土壤所受的外界干擾作用也較小,土壤中的微生物多樣性較高、保存較好。從不同林分采集不同的森林腐殖層土壤樣品,分別置于廣口玻璃瓶中,然后將新鮮健康的蕭氏松莖象幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)各10頭分別半埋于土壤樣品中;用紗網(wǎng)綁緊瓶口后將玻璃瓶置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為溫度28 ℃、 80%～100%RH,誘集過(guò)程中要給誘源昆蟲(chóng)提供必要的食物(華山松小段嫩枝),保證其在感病之前具有正?；盍?同時(shí)要特別注意控制好溫、濕、光、氧氣等條件,保證誘源蟲(chóng)體不出現(xiàn)異常死亡。定期觀測(cè),以蟲(chóng)體表面生長(zhǎng)有肉眼可見(jiàn)的白色菌絲為感病標(biāo)準(zhǔn)。挑取菌絲進(jìn)行分離純化培養(yǎng),培養(yǎng)基均選擇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

1.2 病原真菌的分類(lèi)鑒定

1.2.1形態(tài)鑒定。將各病原真菌菌株的純培養(yǎng)物置于光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)其顯微形態(tài)特征,包括菌落的形態(tài)、質(zhì)地、顏色等,以及分生孢子梗、分生孢子大小和形狀及其著生方式等。 參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-11],對(duì)各菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2分子鑒定。采用真菌DNA提取試劑盒對(duì)各病菌的總DNA進(jìn)行提取,并以通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化切膠回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)得的序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.3 病原真菌的生物測(cè)定對(duì)采集到的代表菌株進(jìn)行生物測(cè)定。首先,用0.1 %吐溫-80的無(wú)菌水將不同菌株配制成濃度相接近的孢子懸浮液(不同菌株的濃度控制在8.5×106～1.2×107個(gè)/mL)。其次,準(zhǔn)備足夠數(shù)量的新鮮健康的蕭氏松莖象幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)。每一種菌液分別對(duì)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)進(jìn)行致病性測(cè)試;每1種菌液作1個(gè)處理,每處理3個(gè)重復(fù),每重復(fù)中幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)各10頭。

在消毒的培養(yǎng)皿底部放置雙層濾紙,將測(cè)試蟲(chóng)放置濾紙上,然后用配制好的菌液均勻噴霧至害蟲(chóng)體上,使害蟲(chóng)全體及濾紙均完全濕潤(rùn)(避免培養(yǎng)皿底部有過(guò)多積水以免將測(cè)試蟲(chóng)淹死)。以噴無(wú)菌水作為對(duì)照。蓋上皿蓋后將培養(yǎng)皿置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為28 ℃、 80%～100% RH,當(dāng)發(fā)現(xiàn)濾紙干燥時(shí)滴加無(wú)菌水以維持皿內(nèi)濕度。分別于第5天、第10天、第15天檢測(cè)蟲(chóng)體感病狀況,統(tǒng)計(jì)感病率。由于病菌入侵定殖前期階段無(wú)明顯外在表現(xiàn),不易判斷,以害蟲(chóng)體表生長(zhǎng)出比較明顯的白色菌絲為其感病的唯一判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 采集菌種情況2019—2020年共采集到蕭氏松莖象病原真菌的有效菌種(菌株)12個(gè),其中自然感染菌株7個(gè)(寄主均為成蟲(chóng)),土壤誘導(dǎo)感染菌株5個(gè)(寄主均為幼蟲(chóng))(表1)。

表1 蕭氏松莖象病原真菌調(diào)查采集結(jié)果Table 1 Investigation and collection results of pathogenic fungi of Hylobitelus xiaoi Zhang

調(diào)查結(jié)果表明,自然條件下蕭氏松莖象成蟲(chóng)感染病原真菌的現(xiàn)象比較普遍;相比之下蕭氏松莖象幼蟲(chóng)在自然條件下一般不感染真菌病害,究其原因,可能是由于幼蟲(chóng)階段為蛀食性,且其蛀道內(nèi)塞滿大量脂質(zhì)物,隱蔽性極強(qiáng),外界病原物難以接觸并完成侵染過(guò)程。

森林腐殖層土壤中也含有大量的蕭氏松莖象病原真菌。竹林下腐殖土誘導(dǎo)感染率60%,闊葉混交林下腐殖土誘導(dǎo)感染率100%,馬尾松林下腐殖土誘導(dǎo)感染率90%,華山松林下腐殖土誘導(dǎo)感染率90%。人工土壤誘集處理中,僅發(fā)現(xiàn)幼蟲(chóng)感病而成蟲(chóng)均不見(jiàn)感染,究其原因,因幼蟲(chóng)體壁相對(duì)較薄,被病原真菌入侵感染的概率比成蟲(chóng)大得多。

2.2 病原菌的鑒定通過(guò)對(duì)各菌株形態(tài)特征的觀測(cè),結(jié)合其rDNA ITS序列的測(cè)定與比對(duì)結(jié)果,得到各菌株的分類(lèi)鑒定結(jié)果(表2)。鑒定結(jié)果表明,自然條件下,擬球孢白僵菌(Beauveriapseudobassiana)是蕭氏松莖象最常見(jiàn)的病原菌種類(lèi),采集頻率為57.1%,球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、綠僵菌(Metarhiziumsp.)及Lecanicilliumsp.采集頻率均為14.3%。而在土壤人工誘集方法中,共獲得5個(gè)菌株,其中綠僵菌菌株4個(gè)(占80%)、白僵菌菌株1個(gè)(占20%),說(shuō)明土壤中所含的主要病原真菌種類(lèi)多為綠僵菌屬。

2.3 病原菌的生物測(cè)定生物測(cè)定結(jié)果表明,不同菌種(菌株)對(duì)蕭氏松莖象成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)的致病速度及致病率存在較大差異(表3)。

表3 不同菌株對(duì)蕭氏松莖象幼蟲(chóng)及成蟲(chóng)的室內(nèi)致病性測(cè)試結(jié)果Table 3 Indoor pathogenicity test results of different strains on the larvae and adults of Hylobitelus xiaoi Zhang

從表3可以看出,人工接種后,幼蟲(chóng)在第5天即可發(fā)現(xiàn)被感染者,而成蟲(chóng)在第5天尚未發(fā)現(xiàn)感染者,但第10天檢測(cè)時(shí)已發(fā)現(xiàn)大量感染者。以幼蟲(chóng)第5天感病率或成蟲(chóng)第10天感病率為致病速度指標(biāo),以第15天感病率為最終致病率指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出,擬球孢白僵菌Beauveriapseudobassiana的5個(gè)菌株(ZR100、ZR168、ZR345、ZR349、YJ005)和球孢白僵菌Beauveriabassiana的1個(gè)菌株(ZR225)對(duì)蕭氏松莖象成蟲(chóng)及幼蟲(chóng)均表現(xiàn)出明顯的致病性;其中ZR100菌株的致病性最強(qiáng),其致病速度及最終致病率均最高。幾個(gè)綠僵菌菌株Metarhiziumsp.(ZR208、 YJ001、YJ002、YJ003、YJ004)對(duì)幼蟲(chóng)均有明顯的感染效果(第15天感染率達(dá)53.3%～70.0%),但對(duì)成蟲(chóng)的感染效果不明顯。輪枝菌菌株Lecanicilliumsp.(ZR093)對(duì)幼蟲(chóng)的感染率最差(第15天感染率僅為26.6%),且不易感染成蟲(chóng)。

表4 不同菌株對(duì)蕭氏松莖象幼蟲(chóng)及成蟲(chóng)的致病速度及致病率Table 4 Infection speed and infection rate of different strains on the larvae and adults of Hylobitelus xiaoi Zhang 單位:%

根據(jù)分類(lèi)鑒定結(jié)果,結(jié)合菌種來(lái)源、形態(tài)特征、致病性等,將調(diào)查到的12個(gè)蕭氏松莖象病原真菌菌株劃分為以下5類(lèi)(表5,圖1～5)。

表5 蕭氏松莖象病原真菌菌株的分類(lèi)Table 5 Classification of entomopathogenic fungal of Hylobitelus xiaoi Zhang

注:a.成蟲(chóng)感病狀;b.病原菌的分生孢子梗及分生孢子。Note:a.Symptoms of adult infestation;b.Conidiophores and conidia.圖1 病原菌株(ZR093)Lecanicillium sp.感染癥狀及顯微形態(tài)特征Fig.1 Infection symptoms and microscopic morphological characteristics of Lecanicillium sp.(ZR093)

注:a.成蟲(chóng)感病狀;b.培養(yǎng)菌落;c.分生孢子梗;d.分生孢子。Note:a.Symptoms of adult infestation;b.Cultivated colonies;c.Conidiophores;d.Conidia.圖2 病原菌株(ZR100)Beauveria pseudobassiana感染癥狀及顯微形態(tài)特征Fig.2 Infection symptoms and microscopic morphological characteristics of Beauveria pseudopassiana (ZR100)

3 結(jié)論與討論

自然環(huán)境條件下廣泛存在蕭氏松莖象的致病病原真菌,包括白僵菌屬(Beauveria)、綠僵菌屬(Metarhizium)以及輪枝菌屬(Lecanicillium)等屬的真菌。其中白僵菌屬的擬球孢白僵菌Beauveriapseudobassiana和球孢白僵菌Beauveriabassiana對(duì)蕭氏松莖象的成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)均具有較高的感染力,是蕭氏松莖象的2個(gè)主要自然寄生真菌種類(lèi)。相比之下,綠僵菌(Metarhiziumsp.)雖然對(duì)幼蟲(chóng)具有較高的感染率,但成蟲(chóng)感染性較弱(該試驗(yàn)未見(jiàn)感染);表現(xiàn)最差的是輪枝菌(Lecanicilliumsp.),其不但在自然條件下較少發(fā)現(xiàn)感染者,室內(nèi)試驗(yàn)對(duì)幼蟲(chóng)的感染率較差,對(duì)成蟲(chóng)更無(wú)感染。

該研究中發(fā)現(xiàn)的擬球孢白僵菌(Beauveriapseudobassiana)作為蕭氏松莖象的重要病原菌系首次報(bào)道。該菌除具有明顯較高的致病性,也是該調(diào)查中發(fā)現(xiàn)頻率最高的種類(lèi),而且在森林土壤中均有存在,說(shuō)明這個(gè)種類(lèi)是蕭氏松莖象的優(yōu)勢(shì)生防菌。擬球孢白僵菌自身也存在特異性分化的菌株,不同菌株的生長(zhǎng)特性及其對(duì)害蟲(chóng)的致病性可能差異較大,如該研究中的擬球孢白僵菌菌株ZR100,不但有其特殊的菌落特征(菌落淡黃,后期呈醒目的鵝黃色放射狀),而且在室內(nèi)感染試驗(yàn)中還具有比另外幾個(gè)菌株更高的致病速度及最終致病率(即具有最強(qiáng)的致病性),應(yīng)成為蕭氏松莖象生防菌劑的首選菌種。

注:a.成蟲(chóng)感病狀;b.大量的疏松分生孢子頭;c.分生孢子。Note:a.Symptoms of adult infestation;b.A large number of loose conidia balls;c.Conidia.圖4 病原菌株(ZR225)Beauveria bassiana感染癥狀及顯微形態(tài)特征Fig.4 Infection symptoms and microscopic morphological characteristics of Beauveria bassiana(ZR225)

注:a.成蟲(chóng)感病狀;b.幼蟲(chóng)感病狀;c.培養(yǎng)菌落;d.分生孢子。Note:a.Symptoms of adult infestation;b.Larval infestation;c.Cultured colonies;d.Conidia.圖5 病原菌株(ZR208,YJ001,YJ02,YJ003,YJ004)Metarhizium sp.感染癥狀及顯微形態(tài)特征Fig.5 Infection symptoms and microscopic morphological characteristics of Metarhizium sp.(ZR208,YJ001,YJ02,YJ003,YJ004)

要真正實(shí)現(xiàn)該生防菌株的開(kāi)發(fā)及推廣應(yīng)用,還需要解決以下一些關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題:①開(kāi)展該菌株的生物學(xué)特研究,掌握其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的最佳溫、濕、光、營(yíng)養(yǎng)等條件;②研究并掌握大規(guī)模生產(chǎn)所需的最佳營(yíng)養(yǎng)配方及生產(chǎn)工藝優(yōu)化條件等;③研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的真菌病原制劑及其適當(dāng)劑型;④為提高生防菌在林間的長(zhǎng)期高毒力及穩(wěn)定性,可考慮開(kāi)展微菌核菌劑生產(chǎn)研究,甚至可以利用新型基因編輯技術(shù)人為創(chuàng)造出長(zhǎng)期高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因菌株;⑤需要針對(duì)蕭氏松莖象的生物學(xué)特性,結(jié)合各種林分特點(diǎn),通過(guò)試驗(yàn)制定針對(duì)性強(qiáng)的林間菌劑施放技術(shù)規(guī)程。