李彤輝, 馮 峰, 申一鳴, 張 峰*

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所,北京 100176; 2.河南省食品和鹽業(yè)檢驗技術(shù)研究院,國家市場監(jiān)管重點實驗室(食品安全快速檢測與智慧監(jiān)管技術(shù)),河南 鄭州 450000)

當(dāng)前,隨著健康意識的增強,人們更傾向通過飲食來達到降血壓的目的,許多聲稱具有降血壓功能的保健食品也不斷涌向市場[1-3]。然而,為了追求利益,部分不法生產(chǎn)者會在一些保健食品中非法添加β-受體阻滯劑類藥物以吸引消費者而獲利。不當(dāng)食用含有β-受體阻滯劑類藥物的食品將會導(dǎo)致心肌耗氧量和血管阻力增加,氧自由基和心肌細胞凋亡[4,5],對人體帶來嚴重的健康風(fēng)險。因此,開發(fā)一種保健食品中β-受體阻滯劑類藥物的檢測方法,并對市售的相關(guān)產(chǎn)品展開風(fēng)險監(jiān)測,以確保市場流通保健食品的質(zhì)量安全成為當(dāng)務(wù)之急。

當(dāng)前,對于β-受體阻滯劑的檢測,報道的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6-8]、毛細管電泳法[9,10]、熒光光譜法[11]、酶聯(lián)免疫法[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[13-18]、高效液相色譜法(HPLC)[19,20]、解吸附電暈束離子源耦合離子阱質(zhì)譜法(DCBI-MS)[21]等,這些方法覆蓋的β-受體阻滯劑范圍較少,且在應(yīng)用于食品樣品檢測時都面臨著基質(zhì)干擾無法有效消除的難題。近年來,高分辨質(zhì)譜作為一種食品中非法添加物篩查的有效手段,已在食品檢測中廣泛使用,但目前還少有報道使用高分辨質(zhì)譜進行保健食品中β-受體阻滯劑檢測的方法,難以滿足實際檢測的需要。

本研究通過優(yōu)化色譜及質(zhì)譜條件,建立了一種超高效液相色譜-四極桿/靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜快速測定食品中13種β-受體阻滯劑的分析方法,并成功應(yīng)用于實際樣品的測定,方法快速便捷,準(zhǔn)確率高,為監(jiān)管部門對保健食品中非法添加的分析檢測提供了重要支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q Exactive四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜系統(tǒng)及Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司);分析天平XP 105 (瑞士Mettler公司); Milli-Q Advantage A10超純水機(美國Millipore公司)。

13種β-受體阻滯劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):阿替洛爾(atenolol,CAS號29122-68-7)、醋丁洛爾(acebutolol,CAS號37517-30-9)、普萘洛爾(propranolol,CAS號318-98-9)、納多洛爾(nadolol,CAS號42200-33-9)、拉貝洛爾(labetalol,CAS號36894-69-6)、比索洛爾(bisoprolol,CAS號66722-44-9)、塞利洛爾(celiprolol,CAS號56980-93-9)、卡維地洛(celiprolol,CAS號72956-09-3)、阿羅洛爾(arotinolol,CAS號68377-92-4)、艾司洛爾(esmolol,CAS號81147-92-4)、美托洛爾(metoprolol,CAS號37350-58-6)、奈必洛爾(nebivolol,CAS號99200-09-6)、貝凡洛爾(bevantolol,CAS號59170-23-9),純度均大于99%,均購自天津阿爾塔科技有限公司;甲醇、乙腈(LC-MS級,德國Merck公司);甲酸(LC-MS級,賽默飛世爾科技有限公司)。

30批食品樣品:2022年7月分別從電商及實體店鋪購買,其中10批次為固態(tài)片劑食品,20批次為液態(tài)口服液類樣品。

1.2 實驗條件

1.2.1溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取/移取13種β-受體阻滯劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,-18 ℃避光保存。

分別準(zhǔn)確吸取13種標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量,用甲醇定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,-18 ℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:根據(jù)需要吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇稀釋成所需濃度,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2樣品制備

對于固態(tài)片劑樣品,取適量混勻研磨后,精密稱取1 g(精確至0.001 g),置于50 mL具塞離心管中,加入甲醇10 mL,渦旋1 min使其混合均勻,在25 ℃下通過超聲波(40 kHz,250 W)提取30 min,放冷至室溫。提取后,混合物以8 000 r/min離心5 min,收集上清液至20 mL容量瓶中,用上述方法重復(fù)提取一次,合并2次提取液,定容至刻度,搖勻。過0.22 μm有機濾膜后上機測定。

對于液態(tài)樣品,經(jīng)充分混勻后準(zhǔn)確吸取1.0 mL置于50 mL具塞離心管中,加甲醇40 mL,在25 ℃下超聲(40 kHz,250 W)提取15 min,放冷至室溫。用甲醇定容,過0.22 μm有機濾膜后上機測定。

1.2.3色譜條件

色譜柱:Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)-乙腈(B);流速0.2 mL/min,進樣體積3 μL,柱溫35 ℃。梯度洗脫程序:0～3.0 min,98%B; 3.0～10.0 min,98%B～5%B; 10.0～15.0 min,5%B; 15.0～20.0 min,5%B～98%B。

1.2.4質(zhì)譜條件

離子源:加熱電噴霧離子源(HESI),正離子模式;噴霧電壓:3.0 kV;毛細管溫度:320 ℃;加熱器溫度:50 ℃;鞘氣:氮氣,流速為40 arb;輔助氣:氮氣,流速為5 arb;掃描模式:一級母離子全掃描和數(shù)據(jù)依賴的二級子離子掃描(Full MS/dd-MS2)模式。一級母離子全掃描分辨率:7×104半峰寬(FWHM);質(zhì)譜掃描范圍:m/z100～1 200;自動增益控制(AGG)及最大注入時間(IT)分別為1×106、100 ms。數(shù)據(jù)依賴二級子離子掃描分辨率:1.75×104FWHM;觸發(fā)閾值:1×105;歸一化碰撞能量設(shè)定為15%、30%、45%。13種β-受體阻滯劑的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 13種β-受體阻滯劑的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究采用Q Exactive高分辨質(zhì)譜的Full MS/dd-MS2模式進行13種β-受體阻滯劑的分析,這些化合物的一級離子及二級碎片離子信息見表1。通過使用目標(biāo)化合物的精確分子離子質(zhì)量數(shù),結(jié)合二級碎片離子譜的分析,能夠?qū)崿F(xiàn)在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,對樣品中有無上述13種β-受體阻滯劑類化合物進行快速篩查。使用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜對13種β-受體阻滯劑的分子離子提取色譜圖見圖1。

圖1 13種β-受體阻滯劑的提取離子色譜圖

2.2 流動相及提取溶劑的選擇

實驗考察了0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇、0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、0.02 mol/L乙酸銨溶液-乙腈、0.02 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%(v/v)甲酸)-乙腈等流動相體系在最優(yōu)的分離條件下各化合物的峰形及分離情況,發(fā)現(xiàn)0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作為流動相,梯度洗脫后13種化合物在10 min內(nèi)能夠得到較好的分離。

參考已有相關(guān)文獻[22-24]報道,實驗考察了以甲醇、乙腈、80%(v/v)甲醇水溶液、1%(v/v)乙酸甲醇、1%(v/v)乙酸乙腈為提取溶劑時空白加標(biāo)樣品中13種β-受體阻滯劑類的加標(biāo)回收率,如圖2所示。結(jié)果表明,甲醇作為提取溶劑時樣品中13種β-受體阻滯劑的回收率在80.4%～116.4%范圍內(nèi),提取效果整體較優(yōu),故本實驗選擇甲醇為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對13種β-受體阻滯劑回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)考察

選擇典型空白樣品基質(zhì),制備質(zhì)量濃度為20 μg/L的空白基質(zhì)加標(biāo)溶液,上機測定,制備同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,通過二者響應(yīng)強度的百分比來確定基質(zhì)效應(yīng)[24]。結(jié)果表明,13種β-受體阻滯劑的基質(zhì)效應(yīng)在87.4%～107.3%范圍內(nèi),空白基質(zhì)對目標(biāo)物定量影響較小。

2.4 靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

以質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,13種β-受體阻滯劑在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均≥0.991 2。向空白樣品中添加逐級稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,經(jīng)前處理后,上機測定,確定有信號檢出的最低含量為該目標(biāo)物的檢出限,為1～10 μg/kg,詳細結(jié)果見表2。

表2 13種β-受體阻滯劑的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

分別稱取空白樣品各1 g,在低、中、高3個水平下分別添加13種β-受體阻滯劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行加標(biāo)回收試驗,每個水平進行6次平行分析,回收率結(jié)果見表3。13種β-受體阻滯劑的平均回收率為75.3%～108.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.9%～10.0%(n=6),其準(zhǔn)確度和精密度能滿足保健食品檢測的要求,表明該分析方法準(zhǔn)確、可靠,適合此類物質(zhì)的定量分析。

表3 13種β-受體阻滯劑的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5 β-受體阻滯劑類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律

β-受體阻滯劑是一類以苯乙醇胺結(jié)構(gòu)為母核、苯環(huán)連接堿性β-輕胺(仲胺)的苯乙胺類藥物。本實驗選用的β-受體阻滯劑為芳氧丙醇胺類化合物,含有以N為中心的堿性基團。

由表1中各化合物的二級碎片離子可見,阿替洛爾、醋丁洛爾、普萘洛爾、比索洛爾、艾司洛爾和美托洛爾均產(chǎn)生了m/z116.107 0和m/z98.096 5的碎片離子,推斷其裂解規(guī)律為這6種化合物在碳氧鍵處斷裂失去其芳香結(jié)構(gòu),形成碎片離子C6H14NO+(m/z116.107 0),再進一步脫水得到碎片離子C6H12N+(m/z98.096 5),以醋丁洛爾為例,其二級質(zhì)譜裂解機理如圖3所示?？ňS地洛和貝凡洛爾因含有電負極性較強的間苯二醚結(jié)構(gòu)極易從中間斷裂,以卡維地洛為例,其二級質(zhì)譜裂解機理如圖4所示。塞利洛爾、納多洛爾、拉貝洛爾、阿羅洛爾及萘必洛爾分子結(jié)構(gòu)式中的特征官能團與其他目標(biāo)物雖然各不相同,但其裂解規(guī)律相似。

圖3 醋丁洛爾二級質(zhì)譜裂解機理

圖4 卡維地洛的二級質(zhì)譜裂解機理

通過研究β-受體阻滯劑的質(zhì)譜裂解規(guī)律,找出其中的特征碎片離子,可以對未知的此類化合物實現(xiàn)非靶標(biāo)篩查,這也有助于監(jiān)管部門及時發(fā)現(xiàn)該類藥物的結(jié)構(gòu)類似物在保健食品中的非法添加。

2.6 實際樣品測定

利用本方法對隨機抽取的30批次市售片劑、口服液類保健食品進行快速篩查檢測,均未檢出上述13種β-受體阻滯劑。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜技術(shù),建立了食品中13種β-受體阻滯劑的快速精準(zhǔn)檢測方法,與目前所報道的方法相比,本方法不僅靈敏度滿足要求,同時抗干擾能力強,速度快,成本低,可應(yīng)用于實際樣品中非法添加β-受體阻滯劑類藥物的快速篩查,為監(jiān)管部門提供了有效的技術(shù)支撐。