羅杰，廖師師，潘銳，陳榕，孟慶濤

武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢430060

缺血再灌注（IR）損傷常見于圍手術(shù)期，如嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、腸梗阻、腸系膜動(dòng)脈栓塞、腹主動(dòng)脈瘤手術(shù)、體外循環(huán)手術(shù)、肝腎移植等，其發(fā)病率和病死率較高［1］。IR亦可造成腸道局部損傷，改變腸黏膜屏障功能，導(dǎo)致腸內(nèi)細(xì)菌的內(nèi)毒素和自由基遷移至腸外器官，從而引發(fā)多器官功能障礙甚至衰竭［2-3］。目前，IR發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其病理機(jī)制主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體自噬、自身免疫反應(yīng)、細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡等［4］。近來研究發(fā)現(xiàn)，Sestrin2是一種新型的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，已被證明具有兩個(gè)重要功能：C末端結(jié)構(gòu)域抑制雷帕霉素復(fù)合物1（mTORC1），N末端結(jié)構(gòu)域抑制氧化應(yīng)激，這兩種功能對于預(yù)防和治療心血管疾病至關(guān)重要，包括IR損傷和心肌細(xì)胞肥大［5］。Sestrin2表達(dá)在炎癥反應(yīng)期間明顯增加，以預(yù)防氧化應(yīng)激并限制進(jìn)行性器官損傷。Sestrin2基因的敲除，會(huì)導(dǎo)致一系列氧化應(yīng)激損傷、更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和疾病惡化［6］。越來越多的證據(jù)表明，Sestrin2在疾病發(fā)病中起重要作用［7-8］。Sestrin2是一種保守的抗氧化劑、代謝調(diào)節(jié)因子，可被多種損傷所誘導(dǎo)，包括氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、DNA損傷、缺氧等。在哺乳動(dòng)物中，Sestrin2廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，如神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。Sestrin2增強(qiáng)表達(dá)主要通過多種轉(zhuǎn)錄因子激活介導(dǎo)，包括p53、活化轉(zhuǎn)錄因子4 （ATF4）、激活蛋白1 （AP-1）和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）。Sestrin2 在N端結(jié)構(gòu)域的一個(gè)小區(qū)域，是一種活性烷基氫過氧化物還原酶，此功能與一個(gè)由反應(yīng)性Cys125和質(zhì)子解離系統(tǒng)組成的螺旋-旋轉(zhuǎn)-螺旋基序有關(guān)［9］。Sestrin2和GATOR2間的相互作用依賴于DD基序，該基序由環(huán)中兩個(gè)相鄰的Asp406和Asp407殘基組成［9］?，F(xiàn)就Sestrin2在IR損傷中作用的研究進(jìn)展綜述如下。

1 Sestrin2參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一，參與一系列細(xì)胞的生理功能，錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的積累引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）反應(yīng)，稱為未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）［10］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要通過蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）介導(dǎo)的C/EBP同源蛋白（CHOP）途徑、JNK途徑，活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）這3種跨ER膜蛋白開啟信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所介導(dǎo)。研究表明，PERK是ERS的主要整合者，并且PERK活性的特定調(diào)節(jié)可影響ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［4］。已有研究表明，腸IR損傷會(huì)在小腸細(xì)胞中誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子蛋白（葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78，GRP78）、PERK及與ERS相關(guān)的凋亡分子CHOP表達(dá)上調(diào)及其下游BcL-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)［11］。研究發(fā)現(xiàn)，Sestrin2是由ERS激活的轉(zhuǎn)錄因子CCAAT-增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β誘導(dǎo)的。一旦誘導(dǎo)，Sestrin2通過抑制雷帕霉素復(fù)合物1（mTORC1）的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)而停止蛋白質(zhì)合成，從而減弱ERS［12］。另外，在小鼠膿毒血癥模型中，研究發(fā)現(xiàn)Sestrin2能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激（ERS）相關(guān)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）介導(dǎo)的ASC pyroposome形成和Caspase-1（CASP-1）活化，減少脾DCs的gasdermin D依賴性焦燒。此外，Sestrin2缺陷通過加劇PERK-ATF4-CHOP信號通路誘導(dǎo)NLRP3/ASC/CASP-1依賴性焦燒和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致膿毒癥小鼠病死率增加，抑制ERS可逆轉(zhuǎn)這一趨勢［13］。在白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞（NP細(xì)胞）衰老和凋亡，從而導(dǎo)致椎間盤退行性變（IVDD）的模型中，研究發(fā)現(xiàn)，Eif2ak3/Eif2ak4-eIF2α-Atf4信號通路激活了Sestrin2，Atf4是Sestrin2的上游分子，Atf4基因的沉默可降低Sestrin2的mRNA水平和Sestrin2蛋白表達(dá)，Sestrin2的沉默降低了煙酰胺核苷對NP細(xì)胞的保護(hù)作用［14］。目前沒有Sestrin2在腸IR損傷的相關(guān)研究。Sestrin2在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在，其表達(dá)變化與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過激活Sestrin2及其下游信號通路，影響細(xì)胞骨架和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，從而導(dǎo)致一系列生理病理改變。因此，研究Sestrin2及其下游信號通路在ERS發(fā)生過程中的作用有重要意義。隨著對Sestrin2功能認(rèn)識(shí)的加深，將會(huì)為其在各種疾病中的作用提供新的見解，進(jìn)而開發(fā)出具有治療作用的藥物。

2 Sestrin2促進(jìn)線粒體自噬

線粒體通過氧化磷酸化在細(xì)胞供能中起核心作用。線粒體的其他功能包括脂質(zhì)合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣穩(wěn)態(tài)維持。然而，線粒體也是活性氧（ROS）的主要來源，并通過釋放促凋亡因子細(xì)胞色素C來觸發(fā)細(xì)胞凋亡。線粒體自噬，即通過選擇性形式降解，是一種從酵母到人類保守的基本機(jī)制，參與了線粒體的質(zhì)量和數(shù)量控制。線粒體自噬通過特定的線粒體外膜受體與線粒體表面蛋白質(zhì)結(jié)合的泛素分子促進(jìn)，導(dǎo)致線粒體周圍自噬小體的形成。線粒體自噬介導(dǎo)的消除在早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、炎癥和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。功能失調(diào)的線粒體，能產(chǎn)生ROS和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，將被自噬識(shí)別和清除。自噬通常是由各種壓力因素導(dǎo)致，如營養(yǎng)不足、缺氧、細(xì)胞內(nèi)ROS、氧化應(yīng)激和化學(xué)藥物等［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，在人骨肉瘤細(xì)胞模型小鼠中，Sestrin2通過PERK-eIF2α-CHOP途徑抑制mTOR來激活自噬，并通過Bcl-2抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡，Sestrin2低表達(dá)可有效降低化療后人骨肉瘤細(xì)胞的自噬，增加p-mTOR表達(dá)，降低Bcl-2表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，減緩腫瘤進(jìn)展［15］。另外，有研究發(fā)現(xiàn)Sestrin2作為一個(gè)新的p53靶基因，參與誘導(dǎo)自噬。在不同的自噬誘導(dǎo)劑處理下，Sestrin2在p53充足的細(xì)胞中表達(dá)增加，而在p53缺乏的細(xì)胞中則無增加，而敲除Sestrin2可減少由營養(yǎng)耗盡、雷帕霉素、鋰或毒胡蘿卜素引起的自噬。Sestrin2缺失不能影響p53缺陷細(xì)胞的自噬，也不能調(diào)節(jié)重新引入p53缺陷細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)p53突變體對自噬的抑制。在p53充足的細(xì)胞系中，Sestrin2可作為自噬的積極調(diào)節(jié)因子［16］。近來，在魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病模型中，Sestrin2 mRNA和蛋白水平以p53依賴的方式顯著上調(diào)，沉默Sestrin2抑制自噬，同時(shí)增加自噬底物的積累，表現(xiàn)為輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）的下調(diào)、p62積累的加劇和AMPK磷酸化的抑制。相反，過表達(dá)Sestrin2可增強(qiáng)自噬活性，這可通過增強(qiáng)AMPK和p62的磷酸化或α-synuclein的降解來證明，從而保護(hù)細(xì)胞免受魚藤酮細(xì)胞毒性損傷。這些結(jié)果表明Sestrin2促進(jìn)線粒體自噬，其機(jī)制可能與AMPK磷酸化密切相關(guān)［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，Unc-51-like protein kinase 1 （ULK1）和p62是Sestrin2新的結(jié)合伙伴，且Sestrin2與ULK1的C端結(jié)構(gòu)域存在物理聯(lián)系，從而激活其功能。此外，Sestrin2可與ULK1-Atg13-FIP200復(fù)合物相互作用，促進(jìn)p62磷酸化，從而消除功能失調(diào)的線粒體和泛素化蛋白，調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2通路。因此，誘導(dǎo)自噬可增強(qiáng)Sestrin2表達(dá)，并與多種自噬相關(guān)蛋白相互作用調(diào)節(jié)自噬活性［18］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)NP細(xì)胞衰老和凋亡，從而導(dǎo)致IVDD的模型中，Sestrin2可作為椎間盤退行性病變中線粒體未展開蛋白反應(yīng)（UPRmt）和線粒體自噬之間的調(diào)節(jié)因子。UPRmt通過eIF2α-Atf4-Sestrin2信號通路誘導(dǎo)線粒體自噬，減少細(xì)胞凋亡，改善NP細(xì)胞代謝，從而減輕椎間盤退變。UPRmt和線粒體自噬調(diào)節(jié)機(jī)制的紊亂可能是IVDD的危險(xiǎn)因素。UPRmt激動(dòng)劑煙酰胺核苷具有成為IVDD治療藥物的潛力［14］。Sestrin2與線粒體自噬關(guān)系密切，其在慢性炎癥引起的衰老和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，但我們對Sestrin2在IR損傷所致線粒體自噬的機(jī)制知之甚少，隨著對Sestrin2功能的深入研究，有望為IR損傷相關(guān)的疾病提供新的治療策略。

3 Sestrin2激活多種信號通路

在缺血缺氧相關(guān)疾病中，缺血缺氧導(dǎo)致氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，ROS過度積累，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。Sestrin2被證實(shí)與多種缺氧相關(guān)疾病有關(guān)，如大腦疾病、心肌疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等［19］。有研究發(fā)現(xiàn)，Sestrin2受p53、缺氧誘導(dǎo)因子-1α和核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）等因素調(diào)控，其可通過促進(jìn)自噬、抑制氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［20］。在這一保護(hù)過程中，激活了多種途徑，如AMPK/mTOR途徑［21］、Nrf2/Keap1途徑［22］、MAPK8/JNK1途徑、ERK1/2途徑。其中，AMPK/mTOR和Nrf2/Keap1是Sestrin2在缺氧條件下參與的關(guān)鍵途徑。HAO等［23］報(bào)道，在夾閉肝動(dòng)脈、門靜脈、部分膽管90 min，再灌注6 h的小鼠肝IR損傷模型中，IR組肝臟出現(xiàn)中重度水腫和廣泛的肝細(xì)胞壞死，血清轉(zhuǎn)氨酶水平和損傷評分均升高，Sestrin2蛋白表達(dá)上調(diào)。使用齊墩果酸（OA）預(yù)處理可降低IR組血清ALT、AST水平。HE染色表明，OA處理后IR組肝組織病理損傷得到改善，對應(yīng)Suzuki′s（肝損傷評分）降低。與此同時(shí)，OA預(yù)處理的肝臟IR，上調(diào)了Sestrin2、PI3K、Akt和血紅素加氧酶-1（HO-1）表達(dá)，而給藥HO-1抑制劑鋅原卟啉（ZnPP）可降低OA對HO-1和Sestrin2表達(dá)的影響及OA對IRI的保護(hù)作用。該研究證明了Sestrin2作為一種抗氧化蛋白，對肝IR損傷的保護(hù)作用，與PI3K/Akt/HO-1信號通路有關(guān)，但未對PI3K/Akt和HO-1之間的關(guān)系進(jìn)一步研究；此外，在肝IR損傷中OA誘導(dǎo)Sestrin2表達(dá)的機(jī)制未完全得到證實(shí)。MIGDALIA等［24］報(bào)道，在阻斷雙腎動(dòng)靜脈15 min，再灌注24 h的急性腎損傷老鼠模型中，急性腎缺血再灌注損傷（AKI）上調(diào)了Sestrin2蛋白表達(dá)，使得腎組織結(jié)構(gòu)和功能惡化，壞死小管百分比和血漿肌酐水平均增加，導(dǎo)致遠(yuǎn)膈臟器的心肌細(xì)胞收縮和舒張功能障礙、心肌細(xì)胞損傷和纖維化及心肌細(xì)胞線粒體功能障礙，而二甲雙胍顯著改善了AKI誘導(dǎo)的心功能障礙，特別是對老齡小鼠心臟的收縮期和舒張期功能、纖維化和細(xì)胞損傷及線粒體功能的改善。而心肌細(xì)胞特異性敲除Sestrin2（cSesn2-/-）的小鼠則不存在此種改變。該研究局限于cSesn2-/-小鼠，Sestrin2基因仍存在于其他類型的細(xì)胞中，如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞等。因此，對全Sestrin2基因敲除的小鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡可能會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果，有待今后進(jìn)一步驗(yàn)證。QUAN等［25］報(bào)道，在冠狀動(dòng)脈左前降支閉塞的心肌缺血再灌注小鼠模型中，心臟Sestrin2蛋白水平隨年齡增長而逐漸降低。與年輕心臟相比，老年心臟的缺血AMPK激活減弱，IR期間，老年心臟AMPK下游葡萄糖攝取和葡萄糖氧化率降低，老齡心肌梗死體積增大。利用Sestrin2 Ab免疫沉淀發(fā)現(xiàn)，心臟Sestrin2在缺血期間與AMPK和上游肝臟激酶B1形成復(fù)合物。與之相同的是，Sestrin2-ko小鼠心臟IR損傷后，心臟損傷指標(biāo)明顯增大，AMPK活化減弱，而通過冠狀動(dòng)脈輸送方法將腺相關(guān)病毒Sestrin2注入老年心臟，顯著挽救了Sestrin2蛋白水平和老年心臟的缺血耐受性。證實(shí)Sestrin2是一種與年齡相關(guān)的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，通過影響AMPK激活和底物代謝，在缺血損傷的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。對Sestrin2-AMPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的進(jìn)一步了解，將會(huì)是開發(fā)抗衰老相關(guān)IR損傷新治療策略的重要成果。

4 Sestrin2抑制氧化應(yīng)激

ROS是通過氧化代謝、線粒體的生物學(xué)功能和免疫功能在體內(nèi)不斷產(chǎn)生的。生理上的ROS對細(xì)胞內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。然而，在氧化應(yīng)激下，過載的ROS可結(jié)合并破壞多數(shù)細(xì)胞生物分子（脂質(zhì)、酶、糖、蛋白質(zhì)、核酸和其他小分子）。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是某些細(xì)胞環(huán)境中氧化還原特性的失衡，并在許多疾病發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括糖尿病、肥胖和心肌損傷［26］。抵抗氧化應(yīng)激損傷是Sestrin2的重要功能之一。在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，Sestrin2表達(dá)在mRNA和蛋白水平上受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，包括核因子-κB、AP-1、C/EBPb、叉頭盒O3和p53［27］。Sestrin2被認(rèn)為通過兩種主要的生物功能來維持氧化代謝的平衡。首先，作為一種抗氧化酶，Sestrin2能直接減少ROS的積累。然后，Sestrin2本身的催化抗氧化活性有限。其次，最近研究表明，Sestrin2抑制ROS的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激，主要原因可能是其調(diào)節(jié)了幾個(gè)與氧化應(yīng)激相關(guān)的信號通路：KEAP1/NRF2抗氧化信號通路及AMPK和mTORC1通路。NRF2是一種轉(zhuǎn)錄因子，可與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，促進(jìn)多個(gè)抗氧化分子的表達(dá)，以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在生理?xiàng)l件下，NRF2在細(xì)胞質(zhì)中組成性表達(dá)。在正常情況下，KEAP1與NRF2結(jié)合，阻止NRF2易位到細(xì)胞核，促進(jìn)其泛素化和蛋白酶體降解，并在細(xì)胞質(zhì)中維持低水平的游離NRF2。而在氧化應(yīng)激下，NRF2從KEAP1中分離并易位到細(xì)胞核。NRF2與ARE結(jié)合可激活靶基因PRX、SRX、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶、血紅素加氧酶1和谷胱甘肽過氧化物酶1的轉(zhuǎn)錄［28］。而在細(xì)胞研究中我們發(fā)現(xiàn)，Sestrin2與unc51樣激酶1（ULK1）和p62結(jié)合形成功能復(fù)合物，Sestrin2促進(jìn)p62的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)KEAP1降解和NRF2激活［26］。近來有研究發(fā)現(xiàn)，在砷暴露誘導(dǎo)大鼠和原代肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激模型中，Sestrin2/AMPK/ULK1通路的激活，導(dǎo)致溶酶體損傷，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，其特征為LC3Ⅱ脂化、p62積累及RIPK1和RIPK3的激活。同樣，砷暴露也會(huì)損害原代肝細(xì)胞的溶酶體功能和自噬，NAC處理后溶酶體功能受損，Leu-peptin處理后溶酶體功能受損加重。而p62 siRNA后原代肝細(xì)胞壞死相關(guān)指標(biāo)RIPK1和RIPK3的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)均下降［29］。YANG等［30］報(bào)道，在小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注（MCAO/R）和小鼠原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞缺氧葡萄糖剝奪/再灌注（OGD/R）的腦缺血再灌注損傷模型中，損傷誘導(dǎo)了Sestrin2蛋白和POU域2類轉(zhuǎn)錄因子2（POU2F2）的表達(dá)上調(diào)。慢病毒介導(dǎo)的POU2F2敲除小鼠，進(jìn)一步損傷了MCAO/R誘導(dǎo)的小鼠腦缺血再灌注損傷（CIRI），表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺損增加、腦梗死體積增加和神經(jīng)元損失。在體內(nèi)POU2F2的缺乏可通過下調(diào)Sestrin2蛋白表達(dá)，降低SOD、GSH、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的活性及ROS、脂質(zhì)ROS、4-羥基壬烯醛和MDA的積累來惡化氧化應(yīng)激和鐵死亡。在體外，敲除POU2F2的初級皮層神經(jīng)元細(xì)胞也表現(xiàn)出更嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷、氧化應(yīng)激和鐵死亡，與此同時(shí)降低了Sestrin2表達(dá)，加速了氧化應(yīng)激和鐵死亡，進(jìn)一步加重CIRI。而在小鼠原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞中，予以O(shè)GD/R處理，過表達(dá)Sestrin2可減輕氧化應(yīng)激和下調(diào)POU2F2引起的鐵死亡。因此CIRI誘導(dǎo)了POU2F2和Sestrin2的代償性增加。下調(diào)POU2F2可能是通過降低Sestrin2表達(dá)，加速氧化應(yīng)激和鐵死亡來加重CIRI。在未來，研究出上調(diào)Sestrin2的藥物可能為CIRI的治療機(jī)制提供新思路。

綜上所述，Sestrin2作為一種新型的抗氧化蛋白，在IR損傷病理生理過程中發(fā)揮重要作用，主要通過AMPK/mTOR途徑、Nrf2/Keap1途徑、MAPK8/JNK1途徑、AMPK/PGC-1α途徑、ERK1/2等，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體自噬、缺氧、氧化應(yīng)激、鐵死亡、凋亡、焦亡等，從而發(fā)揮保護(hù)作用。IR損傷時(shí)，上調(diào)或激活 Sestrin2可一定程度減輕或改善組織器官的損傷，而上調(diào)Sestrin2的藥物及其作用療效需進(jìn)一步研究與探索。