鄭薇 ，郎靜 ，黃西鳳 ，肖銳 ，白荷 ，賈濟 #（.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院麻醉科，廣州 5050；.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科，成都 60083）

巨噬細(xì)胞過度激活與多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括川崎病、自身免疫性肝病、腎病和心肌疾病等[1—3]。巨噬細(xì)胞過度激活后，可釋放多種促炎性細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）和IL-6等。上述促炎性細(xì)胞因子可通過血液循環(huán)損傷體內(nèi)多個臟器，繼而造成臟器功能受損，甚至危及生命[4]。因此，可通過抑制巨噬細(xì)胞的過度激活，降低炎癥反應(yīng)水平，進而控制相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。

綠原酸是富含于中藥金銀花中的一種苯丙素類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗過敏和利膽等藥理作用[6]。目前，關(guān)于綠原酸的相關(guān)研究多聚焦在抑制炎癥反應(yīng)方面。有研究報道，綠原酸的抗炎機制包括抑制巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞激活和調(diào)節(jié)p38分裂原激活的蛋白激酶/Toll樣受體等細(xì)胞信號通路[7]，但其詳細(xì)抑炎機制尚不明確。骨髓細(xì)胞2表達的觸發(fā)受體（triggering receptors expressed on myeloid cells-2，TREM2）是表達于巨噬細(xì)胞上的一種蛋白，可調(diào)控巨噬細(xì)胞激活程度，抑制炎癥反應(yīng)[8]。本研究使用經(jīng)典致炎物質(zhì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，模擬巨噬細(xì)胞激活[9]，觀察綠原酸對LPS所致巨噬細(xì)胞激活的影響和TREM2在其中的作用，為闡明綠原酸的抗炎機制提供實驗室證據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

Series 2型細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Infinite 200型酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司；Criterion型電泳儀和GelDoc Go型凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司；FV10i型共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 主要藥品與試劑

綠原酸原料藥（批號327-97-9，純度＞95%）、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（批號D5796）、胎牛血清（批號9014-87-7）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批號67-68-5）和MTT（批號298-93-1）均購自美國Sigma-Aldrich公司；TNF-α、IL-1β和IL-6促炎性細(xì)胞因子檢測試劑盒（批號分別為20220314、20220517、20220418）均購自中國南京建成生物工程研究所；兔抗小鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）（批號ab178945）、核因子κB p65（nuclear factor κB p65，NF-κB p65）（批號ab32536）一抗和山羊抗兔IgG預(yù)吸附二抗（批號ab7090）均購自英國Abcam公司；TREM2小干擾RNA（TREM2-small interfering RNA，TREM2-siRNA）（批號HU079401）、亂序-siRNA（SC-siRNA，批號SIC001）和轉(zhuǎn)染液（批號L3287）均購自瑞士Qiagen公司；Cy3標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗（批號A0516）和青鏈霉素混合溶液（批號C0223）均購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞系

實驗用小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系獲贈于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。RAW264.7巨噬細(xì)胞在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基含10%胎牛血清、10 U/mL的青霉素和10 μg/mL的鏈霉素。培養(yǎng)箱內(nèi)空氣含95%O2和5%CO2，溫度為37 ℃，濕度為100%。每2～3 d更換培養(yǎng)基1次，每周以1∶4的比例傳代2次。取對數(shù)生長期細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 LPS造模濃度的篩選

2.1.1 細(xì)胞分組及處理

為確定適宜的LPS刺激強度，將細(xì)胞分為Control組和不同質(zhì)量濃度（1、10、100 ng/mL，參考預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置）LPS處理組。細(xì)胞在含有上述藥物的培養(yǎng)基/空白培養(yǎng)基內(nèi)孵育24 h后，進行以下各項檢測。

2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6水平的檢測

將細(xì)胞接種于24孔板中，密度為5×105個/孔，24 h細(xì)胞貼壁后，按“2.1.1”項下方法分組（每組8個復(fù)孔）、給藥、培養(yǎng)細(xì)胞，然后提取各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液200 μL置于離心管內(nèi)，于4 ℃下5 000 r/min離心30 min。離心結(jié)束后，吸棄上清液150 μL，根據(jù)IL-6試劑盒說明書檢測IL-6水平。

2.1.3 細(xì)胞中iNOS蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法檢測細(xì)胞中iNOS蛋白的表達水平。將細(xì)胞接種于6孔板中，密度為1×106個/孔，24 h細(xì)胞貼壁后，按“2.1.1”項下方法分組（每組4個復(fù)孔）、給藥、培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄上層培養(yǎng)基，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3次（5 min/次），然后每孔加入細(xì)胞裂解液500 μL，在4 ℃下裂解5 min，采用細(xì)胞刮將細(xì)胞收集至清潔的離心管內(nèi)，在4 ℃下以12 000 r/min離心30 min后，收集上清液，采用Bradford法進行蛋白定量。取蛋白進行高溫變性后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓120 V，電泳時間2 h），并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上（轉(zhuǎn)膜電流200 mA，轉(zhuǎn)膜時間2 h），加入5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，4 ℃孵育過夜；加入稀釋的iNOS、GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000），在37 ℃下孵育4 h；洗膜后加入山羊抗兔IgG預(yù)吸附二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育60 min；使用化學(xué)發(fā)光法顯色后，采用凝膠成像系統(tǒng)成像，使用Image Lab軟件分析各條帶的灰度值，以iNOS蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值表示iNOS蛋白的表達水平。

2.2 綠原酸給藥濃度的篩選

2.2.1 細(xì)胞分組及處理

參考相關(guān)文獻中的綠原酸濃度[10]，將細(xì)胞分為Control組、LPS處理組（10 ng/mL，按“2.1”項下結(jié)果設(shè)置，下同）和不同濃度綠原酸干預(yù)組（培養(yǎng)基分別含0.01、0.1、1 μmol/L 綠原酸和10 ng/mL LPS），每組8個復(fù)孔。將細(xì)胞在含有上述藥物的培養(yǎng)基/空白培養(yǎng)基中常規(guī)孵育24 h后，進行以下各項檢測。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β水平的檢測

按“2.1.2”項下方法接種細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按“2.2.1”項下方法進行細(xì)胞分組、給藥與培養(yǎng)，然后根據(jù)TNF-α和IL-1β試劑盒說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β水平。

2.2.3 細(xì)胞中iNOS、TREM2蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法檢測細(xì)胞中iNOS、TREM2蛋白的表達水平。按“2.1.3”項下方法接種細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按“2.2.1”項下方法進行細(xì)胞分組（每組4個復(fù)孔）、給藥、培養(yǎng)，按“2.1.3”項下方法進行指標(biāo)檢測。本實驗中iNOS、GAPDH、TREM2、β-actin一抗的稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000、1∶200、1∶1 000。以iNOS蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值表示iNOS蛋白的表達水平，以TREM2蛋白與β-actin蛋白的灰度值比值表示TREM2蛋白的表達水平。

2.2.4 細(xì)胞活力的檢測

采用MTT法檢測細(xì)胞活力。將細(xì)胞接種于96孔板中，密度為1×105個/孔，待細(xì)胞貼壁后，按“2.2.1”項下方法進行細(xì)胞分組（每組8個復(fù)孔）、給藥和培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37 ℃孵育4 h后；吸棄上層培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩15 min，待甲瓚完全溶解后，取空白孔加150 μL蒸餾水作為空白組，在490 nm波長處使用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度，計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）＝（實驗組吸光度-空白組吸光度）/（Control組吸光度-空白組吸光度）×100%。

2.3 TREM2在綠原酸抑制巨噬細(xì)胞激活中的作用考察

2.3.1 轉(zhuǎn)染TREM2-siRNA對巨噬細(xì)胞中TREM2蛋白表達水平的影響

將細(xì)胞接種于6孔板中，密度為1×106個/孔。接種24 h后，吸棄上層培養(yǎng)基，每孔加入含90 pmol的TREM2-siRNA轉(zhuǎn)染液1 mL，37 ℃孵育6 h后，吸棄上層轉(zhuǎn)染液；PBS常溫清洗3次，每孔加入細(xì)胞裂解液200 μL，裂解30 min后，收集細(xì)胞；按“2.2.3”項下方法檢測細(xì)胞中TREM2蛋白的表達水平。實驗重復(fù)4次。

2.3.2 細(xì)胞分組及處理

為觀察TREM2在綠原酸抑制巨噬細(xì)胞激活中的作用，將細(xì)胞分為Control組、LPS處理組（10 ng/mL LPS）、綠原酸+LPS組[培養(yǎng)基含1 μmol/L綠原酸（按“2.2”項下結(jié)果設(shè)置）和10 ng/mL LPS]、TREM2-siRNA+綠原酸+LPS組（細(xì)胞經(jīng)TREM2-siRNA處理后，再經(jīng)1 μmol/L綠原酸和10 ng/mL LPS處理）和SC-siRNA+綠原酸+LPS組（細(xì)胞經(jīng)SC-siRNA處理后，再經(jīng)1 μmol/L綠原酸和10 ng/mL LPS處理），每組8個復(fù)孔。在含有上述藥物的培養(yǎng)基/空白培養(yǎng)基中孵育24 h后，進行以下各項檢測。

2.3.3 干擾TREM2表達后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β水平的檢測

按“2.1.2”項下方法接種細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按“2.3.2”項下方法進行細(xì)胞分組、給藥，根據(jù)TNF-α、IL-1β試劑盒說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β水平。

2.3.4 干擾TREM2表達后細(xì)胞中iNOS蛋白染色情況的檢測

將細(xì)胞接種于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中，密度為1×105個/孔。接種24 h后，按“2.3.2”項下方法分組處理，吸去上層培養(yǎng)基，每孔加入4%多聚甲醛溶液1 mL固定，30 min后，PBS清洗3次，5 min/次；隨后，每孔加入1%牛血清白蛋白1 mL包被非特異性抗原，30 min后，PBS清洗1次；每孔加入iNOS一抗（稀釋比例為1∶100），在4 ℃下孵育12 h后，PBS清洗3次，5 min/次；每孔加入Cy3標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗（稀釋比例為1∶100）200 μL，常溫避光孵育90 min；隨后，每孔加入100 μL的DAPI染液標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色），常溫避光孵育5 min后，PBS避光清洗3次，5 min/次；采用共聚焦顯微鏡在532 nm波長處進行觀測，并隨機選取視野拍照。

2.3.5 干擾TREM2表達后細(xì)胞中TREM2、iNOS和NFκB p65蛋白表達水平的檢測

按“2.1.3”項下方法接種細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按“2.3.2”項下方法分組、處理，每組4個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，按“2.1.3”項下方法操作檢測TREM2、iNOS和NF-κB p65蛋白表達水平，iNOS、GAPDH、TREM2、βactin、NF-κB p65一抗的稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000、1∶200、1∶1 000、1∶200。以iNOS蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值表示iNOS蛋白的表達水平，以TREM2、NFκB p65蛋白與β-actin蛋白的灰度值比值分別表示TREM2、NF-κB p65蛋白的表達水平。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行分析處理。所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，組間差異采用單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗進行分析。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 LPS造模濃度的篩選結(jié)果

與Control組[（7.25±2.22） pg/mL]比較，10、100 ng/mL LPS處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6水平[（121.80±8.85）、（126.30±8.65） pg/mL]均顯著升高（P＜0.05）。與Control組（0.12±0.02）比較，10、100 ng/mL LPS處理組細(xì)胞中iNOS蛋白表達水平（0.84±0.06、0.86±0.04）均顯著升高（P＜0.05），且10、100 ng/mL LPS處理組間細(xì)胞中iNOS蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此，本研究選擇質(zhì)量濃度為10 ng/mL的LPS進行后續(xù)實驗。iNOS蛋白表達的電泳圖見圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度LPS作用下巨噬細(xì)胞中iNOS蛋白表達的電泳圖

3.2 綠原酸給藥濃度的篩選結(jié)果

結(jié)果（圖2）顯示，與Control組比較，LPS處理組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS處理組比較，0.01、0.1、1 μmol/L綠原酸干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β水平均顯著降低（P＜0.05）。與Control組比較，LPS處理組細(xì)胞中iNOS蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS處理組比較，0.1 μmol/L綠原酸干預(yù)組細(xì)胞中iNOS蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與0.1 μmol/L綠原酸干預(yù)組比較，1 μmol/L綠原酸干預(yù)組細(xì)胞中iNOS表達水平顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見圖3A。與LPS處理組比較，0.1 μmol/L綠原酸干預(yù)組細(xì)胞中TREM2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見圖3B。此外，上述各處理組間細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見圖4。以上結(jié)果表明，0.1 μmol/L綠原酸可顯著抑制LPS對巨噬細(xì)胞的激活，并提高TREM2蛋白表達水平，且未對細(xì)胞增殖產(chǎn)生顯著影響，故本研究選擇濃度為0.1 μmol/L的綠原酸進行后續(xù)實驗。

圖2 不同濃度綠原酸對巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β水平的影響（±s，n＝8）

圖3 不同濃度綠原酸對巨噬細(xì)胞中iNOS、TREM2蛋白表達水平的影響（±s，n＝4）

圖4 不同濃度綠原酸對巨噬細(xì)胞活力的影響（±s，

3.3 TREM2在綠原酸抑制巨噬細(xì)胞激活中的作用

3.3.1 轉(zhuǎn)染TREM2-siRNA對巨噬細(xì)胞中TREM2蛋白表達水平的影響

結(jié)果（圖5）顯示，TREM2-siRNA可顯著降低細(xì)胞TREM2蛋白表達水平（P＜0.05），表明TREM2-siRNA的干擾有效，可用于后續(xù)實驗。

圖5 轉(zhuǎn)染TREM2-siRNA干擾細(xì)胞TREM2蛋白表達效果驗證的電泳圖

3.3.2 干擾TREM2表達后對TNF-α、IL-1β水平的影響

與Control組比較，LPS處理組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與LPS處理組比較，綠原酸+LPS組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β水平均顯著降低（P＜0.05）；與綠原酸+LPS組比較，TREM2-siRNA+綠原酸+LPS組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05），而SC-siRNA未對綠原酸抑制TNF-α和IL-1β釋放的作用產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。結(jié)果見圖6。

圖6 干擾TREM2表達對TNF-α、IL-1β水平的影響（±s，n＝8）

3.3.3 干擾TREM2表達對iNOS蛋白染色情況的影響

結(jié)果（圖7）顯示，LPS可明顯增加巨噬細(xì)胞中iNOS蛋白表達水平（紅色），綠原酸可明顯降低iNOS蛋白表達水平，TREM2-siRNA顯著逆轉(zhuǎn)了綠原酸對iNOS蛋白表達水平的抑制作用，而SC-siRNA未對iNOS的蛋白表達水平產(chǎn)生明顯影響。

圖7 干擾TREM2表達對iNOS蛋白表達影響的免疫熒光染色圖

3.3.4 干擾TREM2表達對TREM2、NF-κB p65和iNOS蛋白表達水平的影響

與Control組比較，LPS處理組細(xì)胞中iNOS和NFκB p65蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與LPS處理組比較，綠原酸+LPS組細(xì)胞中iNOS和NF-κB p65蛋白表達水平均顯著降低、TREM2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與綠原酸+LPS組比較，TREM2-siRNA+綠原酸+LPS組細(xì)胞中iNOS和NF-κB p65蛋白表達水平均顯著升高、TREM2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），TREM2-siRNA明顯逆轉(zhuǎn)了綠原酸的上述作用；而SCsiRNA未對綠原酸產(chǎn)生的上述作用造成影響。以上結(jié)果表明，綠原酸可通過巨噬細(xì)胞TREM2介導(dǎo)，降低LPS引起的巨噬細(xì)胞激活。結(jié)果見圖8、圖9。

圖8 干擾TRME2表達對TREM2和NF-κB p65表達的影響（±s，n＝4）

圖9 干擾TRME2表達對iNOS表達的影響（±s，n＝4）

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和心血管保護等作用[10]，但目前其作用機制尚不十分明確，這也大大限制了綠原酸的臨床應(yīng)用。巨噬細(xì)胞是一種分布于人體血液循環(huán)和肺內(nèi)的免疫細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)過程中，巨噬細(xì)胞受到刺激后，可分泌大量促炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等，高濃度的促炎性細(xì)胞因子可增強人體內(nèi)的炎癥反應(yīng)程度，對心、腦、腎、肝等多個臟器造成損傷。若巨噬細(xì)胞的引起的炎癥反應(yīng)得不到有效控制，可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至導(dǎo)致死亡[11]。因此，控制或抑制巨噬細(xì)胞的過度激活，被認(rèn)為是治療炎癥相關(guān)疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞激活后可處于2種狀態(tài)：經(jīng)典激活狀態(tài)（M1狀態(tài)）和選擇性激活狀態(tài)（M2狀態(tài)）。M1狀態(tài)的巨噬細(xì)胞目前認(rèn)為是有害的，而M2狀態(tài)的巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是有益的。因此，將巨噬細(xì)胞調(diào)控至M2狀態(tài)是治療這類炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12—13]。本課題組使用LPS刺激巨噬細(xì)胞，引起細(xì)胞激活，觀察使用綠原酸后對LPS引起巨噬細(xì)胞激活水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠原酸可顯著減弱LPS對巨噬細(xì)胞的激活作用，降低巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)程度。促炎性細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-6）分泌增加和iNOS蛋白表達上調(diào)，表明巨噬細(xì)胞處于M1激活狀態(tài)；而綠原酸降低了巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子分泌和iNOS蛋白表達水平，說明該藥物減少了處于M1激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞數(shù)量，具有明顯的抗炎能力[14]。由于NFκB調(diào)控了很多炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因，且巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子分泌水平的高低，受NF-κB蛋白表達水平調(diào)控[14]，因此，本研究檢測了巨噬細(xì)胞中NF-κB p65的蛋白表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可明顯升高巨噬細(xì)胞中NF-κB p65蛋白表達水平，而綠原酸可明顯抑制LPS引起的NF-κB p65蛋白表達上調(diào)。以上結(jié)果表明，綠原酸可抑制LPS引起的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體（TREM）是在2000年被發(fā)現(xiàn)的一類免疫球蛋白超家族，目前已知TREM家族有3個成員，分別為TREM1、TREM2和TREM3[15]。其中，TREM1和TREM2是目前研究較多的2個TREM家族成員，其結(jié)構(gòu)較為相似，但其功能大有不同——TREM1對炎癥反應(yīng)起著促進和放大的作用，而TREM2對炎癥反應(yīng)起著抑制的作用。研究表明，TREM2表達上調(diào)可抑制免疫細(xì)胞分泌炎癥因子，減輕炎癥損傷[16]。研究表明，TREM2基因敲除肺炎模型小鼠與野生型小鼠相比，前者肺炎的嚴(yán)重程度和死亡率顯著降低，其機制可能是肺泡巨噬細(xì)胞上的TREM2基因敲除后，細(xì)胞吞噬能力顯著增加，清除細(xì)菌等病原微生物的能力增強[17]。另一項研究表明，與巨噬細(xì)胞特性類似的小膠質(zhì)細(xì)胞，其TREM2表達上調(diào)后，可顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，通過改善小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)，即降低M1狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量，增加M2狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量，減輕腦組織缺血后的炎癥反應(yīng)程度[17]。TREM2是調(diào)控炎癥細(xì)胞（包括小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）激活狀態(tài)的重要靶點。早期研究提示，TREM2上調(diào)可抑制免疫細(xì)胞過度激活，從而抑制促炎性細(xì)胞因子分泌，最終降低炎癥反應(yīng)程度[7]。國外也有研究表明，TREM2可通過減輕巨噬細(xì)胞激活，減輕炎癥反應(yīng)[18]。在本研究中，研究者采用TREM2-siRNA干擾巨噬細(xì)胞的TREM2蛋白表達后，綠原酸在巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生的抗炎作用被顯著逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明，綠原酸在LPS刺激下的巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生的抑炎作用，可能是通過細(xì)胞上的TREM2蛋白介導(dǎo)的。

綜上所述，綠原酸可顯著抑制LPS對巨噬細(xì)胞的激活，其抗炎作用可能是通過巨噬細(xì)胞上的TREM2蛋白介導(dǎo)的。但本研究也有一些不足之處：首先，本研究采用巨噬細(xì)胞系作為研究對象，所得結(jié)論并非來源于動物或臨床研究結(jié)果；其次，本研究僅觀察了TREM2蛋白的作用，TREM1或TREM3在綠原酸抑制巨噬細(xì)胞激活中是否發(fā)揮了作用尚不明確。因此在后續(xù)研究中，還應(yīng)采用更多實驗對本研究結(jié)果進行進一步驗證，并探索其更多的作用機制。