問 靜，石春蘭，韓達(dá)斌，劉海青，劉安平，李維業(yè)，徐文勝，鄒存生，劉學(xué)良△

（1.青海省藥品審評(píng)核查中心，青海 西寧 810007； 2.青海省西寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，青海 西寧 810007； 3.三普藥業(yè)有限公司，青海 西寧 810016）

扁蕾顆粒是藏藥濕生萹蕾用水煎煮、濃縮后，取浸膏加輔料制粒干燥而成的單方制劑，具有清熱燥濕、利濕干黃水功效，臨床主要用于治療小兒腹瀉和腸胃炎［1］。濕生扁蕾Gentianopsis paludosa（Mum.）Ma 為龍膽科植物濕生扁蕾的全草，1 年或2 年生草本，花盛期采集，全草入藥，產(chǎn)于西藏、青海、四川、云南等地，具有清溫?zé)?、利膽、止瀉功效，臨床主要用于黃疸型肝炎、肝膽病引起的發(fā)燒、感冒、小兒腹瀉等疾病的治療［2-5］。目前，扁蕾顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》［1］，僅有性狀及檢查項(xiàng)（顆粒劑制劑通則項(xiàng)目），不能有效控制藥品質(zhì)量。參考文獻(xiàn)［6 - 12］，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定制劑濕生扁蕾中有效成分馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的含量，旨在為扁蕾顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步研究提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），配有Waters 2998 PDA detector 型二極管陣列檢測(cè)器；ME204 型電子天平（精度為0.1 mg），XS105DU 型超越系列專業(yè)型XS分析天平（精度為0.01 mg），均購于瑞士Mettler Toledo 公司；SB25 - 12DT 型新芝超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為600 W，頻率為50 kHz）；Milli-Q2355型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

馬錢苷酸對(duì)照品（批號(hào)為111865-202005，純度為97.5%），當(dāng)藥苷對(duì)照品（批號(hào)為111742-200501，純度為99.27%），芒果苷（批號(hào)為111607 - 201704，純度為98.1%），木犀草素對(duì)照品（批號(hào)為111720-202111，純度為99.1%），均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮對(duì)照品（中科院西北高原生物研究所孫洪發(fā)研究員提供，純度不低于96%）；甲醇（色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司，批號(hào)為11163207138）；磷酸（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，批號(hào)為Z0510032）；水為超純水；扁蕾顆粒（三普藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為190702，190703，190704，191002，191003，規(guī)格為每瓶12 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［8-12］

色譜柱：Waters SunFire ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min 時(shí)20%A →25%A，5～7 min 時(shí)25%A，7～30 min 時(shí)25%A →55%A，30～35 min 時(shí)55%A →90%A，35～40 min 時(shí)90%A，40～45 min 時(shí)90%A →20%A，45～50 min 時(shí)20%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羥基- 3，8 - 二甲氧基酮色譜峰與樣品中其他成分分色譜峰離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于5 000。色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

分別取馬錢苷酸對(duì)照品10.56 mg，當(dāng)藥苷對(duì)照品8.10 mg，芒果苷對(duì)照品8.15 mg，木犀草素對(duì)照品5.71 mg，1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮對(duì)照品7.81 mg，精密稱定，分別置50，10，100，10，50 mL容量瓶中，加甲醇超聲使溶解并定容，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；分別取上述對(duì)照品貯備液2，5，2，2，2 mL，置20 mL 容量瓶中，加甲醇超聲使溶解并定容，搖勻，即得馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮質(zhì)量濃度分別為0.020 6，0.201 0，0.008 0，0.056 6，0.015 0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

取樣品適量，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ蕿?50 W，頻率為50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羥基- 3，8 - 二甲氧基酮質(zhì)量濃度分別為0.020 6，0.201 0，0.008 0，0.056 6，0.015 0 mg/mL）1，2，5，10，15，20 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以各待測(cè)成分的進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1，表明各待測(cè)成分在各自進(jìn)樣量范圍內(nèi)分別與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n=6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羥 基- 3，8 - 二 甲氧 基酮峰面積的RSD分別為0.63%，0.26%，0.14%，0.16%，0.27%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為190702）適量，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件于0，2，4，8，16，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羥基-3，8 - 二甲 氧 基酮峰面積的RSD分別為0.96%，0.22%，0.13%，0.04%，0.79%（n=6），表明供試品溶液中上述成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為190702）6 份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7 - 二羥基- 3，8 - 二甲氧基酮的平均含量分別為0.54，8.30，0.23，1.06，0.74 mg/ g，RSD分別為0.72%，1.06%，0.59%，0.42%，0.92%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為190702）6 份，每份0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別加入適量馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7- 二羥基- 3，8- 二甲氧基酮對(duì)照品，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的平均回收率分別為96.24%，98.16%，96.67%，98.06%，97.84%，RSD分別為0.84%，0.89%，1.06%，0.92%，1.57%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品（批號(hào)分別為190702，190703，190704，191002，191003）0.5 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算各批次樣品中馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7 - 二羥基- 3，8 - 二甲氧基酮的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of the content determination of five components in samples

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分與色譜條件選擇

曾選擇扁蕾顆粒中其他成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果含量較低，且無法有效分離，不建議作為扁蕾顆粒的定量檢測(cè)指標(biāo)。扁蕾顆粒臨床用于小兒腹瀉、胃腸炎的治療，且療效明確［13-15］。其主要有效成分馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7- 二羥基- 3，8- 二甲氧基酮具有抗炎、抗氧化、止瀉、抑菌、抗腫瘤、保肝等多種藥理學(xué)作用［16-24］，且分離度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均較好，故選擇上述5種成分作為扁蕾顆粒的指標(biāo)性成分。

對(duì)馬錢苷酸、當(dāng)藥苷、芒果苷、木犀草素、1，7 - 二羥基-3，8-二甲氧基酮5種物質(zhì)的甲醇溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，于254 nm和365 nm波長(zhǎng)處均有較強(qiáng)吸收，故選擇254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。參考文獻(xiàn)［8 - 11］，選擇甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸、甲醇-水-磷酸等流動(dòng)相系統(tǒng)及流動(dòng)相梯度洗脫程序進(jìn)行多次試驗(yàn)，最終選擇甲醇-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

3.2 樣品制備方法考察

對(duì)不同極性提取溶劑（水、乙醇、50%乙醇、甲醇、50%甲醇），不同提取方法（回流、超聲、冷浸），不同提取時(shí)間（15，30，45，60 min）進(jìn)行考察，從混合對(duì)照品溶液和供試品溶液中被測(cè)成分的分離情況、基線的穩(wěn)定性及分析時(shí)間、含量、成本等方面綜合分析，最終確定提取方法，即取樣品0.5 g，以甲醇25 mL 為溶劑，超聲30 min處理。曾以水為溶劑加熱回流2 h（模擬扁蕾顆粒生產(chǎn)工藝）、甲醇為溶劑超聲30 min 2 種方法提取濕生扁蕾藥材得到的溶液進(jìn)行比較，但水回流提取法的供試品溶液色譜行為與甲醇提取的供試品溶液差異較大。前者部分色譜峰較小，如已確認(rèn)的木犀草素、當(dāng)藥醇苷等；個(gè)別色譜峰缺失，但不能確認(rèn)具體成分。究其原因，主要與部分化合物在水、甲醇的溶解性差異較大有關(guān)；可能與化合物的熱穩(wěn)定性有關(guān)，如生產(chǎn)工藝規(guī)定第1次加10倍量水煎煮2 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，加熱時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)造成個(gè)別不穩(wěn)定化合物的含量降低。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便、高效，結(jié)果準(zhǔn)確，能為扁蕾顆粒的質(zhì)量控制提供參考。