楊 帥，劉 慧，周家華，周祖英，朱 迪，鞏仔鵬，李月婷，鄭 林，黃 勇△

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001）

金骨蓮膠囊源于經(jīng)典苗藥組方，該組方在《本草圖經(jīng)》《滇南本草》中均有記載［1］。其是以透骨香等5 味中藥材組方的復(fù)方中藥制劑，具有除濕、消腫、止痛、祛風(fēng)等功效［2］，臨床主要用于鎮(zhèn)痛、改善組織腫脹等［3-4］。目前，已被收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編：腦系經(jīng)絡(luò)肢體》［5］和《國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)、工傷保險(xiǎn)和生育保險(xiǎn)藥品目錄（2022 年）》［6］?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)大血藤、透骨香、金鐵鎖進(jìn)行薄層色譜鑒別和對(duì)漢桃葉中富馬酸進(jìn)行含量限定（不低于0.01%）［7］，難以全面控制該制劑的質(zhì)量。課題組在前期研究中建立了同時(shí)測(cè)定金骨蓮膠囊中9種成分含量的高效液相色譜（HPLC）法及指紋圖譜法［7-8］，但單一的化學(xué)分析方法無(wú)法全面控制金骨蓮膠囊的質(zhì)量，無(wú)法保障其臨床安全性與有效性［9］。目前，生物活性測(cè)定已成為中藥質(zhì)量控制發(fā)展的重要方向［10-11］，2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》中已增加9015中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則（以下簡(jiǎn)稱指導(dǎo)原則）［12］。為進(jìn)一步完善金骨蓮膠囊的質(zhì)量控制方法，有必要開展生物活性檢測(cè)研究。優(yōu)選和建立與藥效相關(guān)且符合藥品檢定要求的中藥生物活性測(cè)定方法是實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量生物控制的前提和關(guān)鍵［13］。參考指導(dǎo)原則，本研究中基于鎮(zhèn)痛功效［2-3］建立了金骨蓮膠囊的生物活性測(cè)定方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：1 mL 一次性注射器；EL - 240 型電子天平（梅特勒- 托利多儀器有限公司，精度為0.1 mg）；KQ - 500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；WP - UP -IV - 20 型超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；12號(hào)灌胃針。

試藥：阿司匹林腸溶片（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為2010281，規(guī)格為每片25 mg）；金骨蓮膠囊（貴州益佰制藥股份有限公司，批號(hào)分別為190816，191001，191010，191102，191108，200607，200711，201021，201101，201205，規(guī)格為每粒0.25 g）；冰醋酸（重慶川東化工＜集團(tuán)＞有限公司，批號(hào)為20191001）；生理鹽水（貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)為E121051506）；羧甲基纖維素鈉（CMC - Na，大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)為J0826A）。

動(dòng)物：SPF 級(jí)昆明小鼠50 只，雌雄兼用，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（湘）2019 - 0014。動(dòng)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，雌雄分開飼養(yǎng)，每籠20 只，光照充足，通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備良好，室溫20～24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

取阿司匹林腸溶片和金骨蓮膠囊內(nèi)容物各適量，分別置容量瓶中，精密稱定，加0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液定容，搖勻，即得。

2.2 分組、給藥與建模

將50 只昆明小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（等量0.5%CMC - Na），金骨蓮膠囊低、中、高劑量組（113.75，227.50，455.00 mg/kg），陽(yáng)性藥對(duì)照組（阿司匹林36.40 mg/ kg），各10 只。分別按每1 kg 體質(zhì)量灌胃10 mL藥物，每日1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥前12 h，禁食、自由飲水。末次給藥1 h 后，按每1 kg 體質(zhì)量小鼠腹腔注射10 mL 1%醋酸溶液，以誘導(dǎo)扭體反應(yīng)。

2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

記錄腹腔注射醋酸后20 min 內(nèi)各組小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)，評(píng)價(jià)指標(biāo)為小鼠的腹部是否內(nèi)凹、臀部是否抬高、后肢是否伸展。根據(jù)扭體次數(shù)計(jì)算各給藥組的鎮(zhèn)痛率［14］，鎮(zhèn)痛率（%）=（扭體次數(shù)空白組-扭體次數(shù)給藥組）/扭體次數(shù)空白組×100%。

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)用LSD-t法進(jìn)行比較，方差不齊時(shí)用Dunnett T3法進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 限值劑量確定

由表1 可知，與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥對(duì)照組及金骨蓮膠囊低、中、高劑量組小鼠20 min 內(nèi)的扭體次數(shù)均顯著減少（P＜0.01）；與金骨蓮膠囊低劑量組比較，金骨蓮膠囊高劑量組小鼠20 min 內(nèi)的扭體次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。為增加實(shí)驗(yàn)的可靠性與重復(fù)性，選擇455.00 mg/kg（相當(dāng)于臨床等效劑量的2 倍）作為限值劑量。

表1 不同劑量金骨蓮膠囊對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛率的影響（n=10）Tab.1 Effect of different doses of Jingulian Capsules on the analgesic rate of mice（n=10）

2.5 方法學(xué)考察

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為191001，劑量為455.00 mg/kg）進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，考察方法重復(fù)性。結(jié)果6 次試驗(yàn)均能顯著減少小鼠的20 min 內(nèi)扭體次數(shù)（P＜0.01），平 均鎮(zhèn)痛率（47.43 ± 2.30）%，RSD為4.85%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。詳見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=10）Tab.2 Results of the repeatability test（n=10）

日間精密度試驗(yàn)：由同實(shí)驗(yàn)室不同人員采用455.00 mg/kg的金骨蓮膠囊連續(xù)灌胃給藥7 d后，測(cè)得各組小鼠的平均鎮(zhèn)痛率為（46.63 ± 2.51）%，RSD為5.39%（n=3），與正常對(duì)照組比較，各給藥組小鼠的扭體次數(shù)均顯著減少（P＜0.01），表明儀器日間精密度良好。詳見表3。

表3 日間精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=10）Tab.3 Results of the intra-day precision test（n=10）

方法適用性試驗(yàn)：測(cè)定10批金骨蓮膠囊，通過(guò)與空白對(duì)照組和金骨蓮膠囊高劑量組間比較，考察方法適用性。結(jié)果10批給藥后小鼠的鎮(zhèn)痛率均大于40.00%，平均鎮(zhèn)痛率為（47.44±3.61）%，RSD為7.61%（n=10）；與空白對(duì)照組比較，金骨蓮膠囊高劑量組小鼠20 min 內(nèi)的扭體次數(shù)均顯著減少（P＜0.01），表明方法適用性良好，不同批次金骨蓮膠囊質(zhì)量均一。詳見表4。

3 討論

中藥材因其來(lái)源廣泛、制備工藝煩雜，難以控制其質(zhì)量，且中藥多成分，多活性，藥理作用較多，單一成分難以控制其質(zhì)量和反映中藥的療效［15］。為更好地保證中藥的安全性和有效性，有必要將質(zhì)量控制和療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相結(jié)合，以更好地保證每批藥品用于臨床的安全性和有效性［16］。生物活性測(cè)定方法可作為常規(guī)理化測(cè)定方法的補(bǔ)充，可進(jìn)一步完善金骨蓮膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

目前，對(duì)于鎮(zhèn)痛藥物藥效的篩選，常用的經(jīng)典模型有物理致痛模型（如熱、電及機(jī)械刺激）和化學(xué)致痛模型（如甲醛、冰醋酸等）［14，17］。本研究中采用化學(xué)致痛模型，向小鼠腹部注入一定量冰醋酸，刺激臟層和壁層腹膜，引起腹部較大面積、較長(zhǎng)時(shí)間的炎性疼痛，導(dǎo)致小鼠在一段時(shí)間后出現(xiàn)扭體反應(yīng)（表現(xiàn)為腹部?jī)?nèi)凹、伸展后肢、抬高臀部、蠕行等）［18］，此模型能直觀地通過(guò)小鼠的扭體情況來(lái)反映小鼠的內(nèi)臟疼痛，其疼痛程度可通過(guò)扭體次數(shù)和扭體潛伏期時(shí)長(zhǎng)等觀察指標(biāo)進(jìn)行量化，簡(jiǎn)單易行，對(duì)藥物的鎮(zhèn)痛作用較敏感，重復(fù)性好，是目前公認(rèn)的篩選鎮(zhèn)痛藥物的經(jīng)典模型之一［17］。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱板實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)重復(fù)性較差，結(jié)果不穩(wěn)定。考慮到實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及穩(wěn)定性，本研究中選用化學(xué)致痛冰醋酸誘導(dǎo)小鼠的疼痛反應(yīng)作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合本品功能主治鎮(zhèn)痛藥效成分，選擇經(jīng)典的小鼠醋酸扭體模型，以建立其鎮(zhèn)痛生物活性檢測(cè)方法，以具有鎮(zhèn)痛功效的阿司匹林作為陽(yáng)性對(duì)照藥。由表1 可知，與空白對(duì)照組比較，金骨蓮膠囊低、中、高劑量組小鼠20 min 內(nèi)的扭體次數(shù)均顯著減少（P＜0.01）；與金骨蓮膠囊低劑量組比較，金骨蓮膠囊高劑量組小鼠20 min內(nèi)的扭體次數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。為增加實(shí)驗(yàn)的可靠性和重復(fù)性，選擇高劑量（455.00 mg/kg）進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性、精密度及方法適用性均良好，且操作簡(jiǎn)單，經(jīng)驗(yàn)證可用于揭示金骨蓮膠囊的生物活性信息，以及全面評(píng)價(jià)藥品品質(zhì)。另外，建議采用該方法時(shí)，第1次結(jié)果若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則可判定為合格；第1 次結(jié)果若無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則可增加樣本量進(jìn)行1 次復(fù)試，復(fù)試時(shí)應(yīng)增設(shè)陽(yáng)性藥對(duì)照組，復(fù)試結(jié)果若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則判定為合格，否則為不合格。