張群 ,程曉玲 ,劉明,謝佳鑫,彭建,余波,晏奎*,辜云杰,楊漢波

1.成都興綠林業(yè)科技發(fā)展有限公司，四川 溫江 611100；2.布拖林業(yè)和草原局，四川 布拖 616350；3.四川省林業(yè)科學(xué)研究院森林與濕地生態(tài)恢復(fù)與保育四川省重點實驗室，四川 成都 610081；4.長江上游林業(yè)生態(tài)工程四川省重點實驗室，長江上游森林資源保育與生態(tài)安全國家林業(yè)和草原局重點實驗室，華西雨屏區(qū)人工林生態(tài)系統(tǒng)研究長期科研基地，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 成都 611130；5.四川省林業(yè)和草原宣傳中心，四川 成都 610081

林木種質(zhì)資源是育種工作的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是決定育種效果的關(guān)鍵，世界各國都非常關(guān)注對種質(zhì)資源的調(diào)查、搜集、評價、保存和利用[1-2]。但是，隨著林木種質(zhì)資源收集、保存數(shù)量的不斷增加，給保存、評價和利用帶來了巨大困難。Frankel 等[3]在種質(zhì)資源庫的基礎(chǔ)上提出了核心種質(zhì)的概念，其目的是以最少數(shù)量的種質(zhì)資源最大限度地保存整個群體的遺傳多樣性，從而解決種質(zhì)資源規(guī)模過大難以管理和利用的難題。核心種質(zhì)的提出為種質(zhì)資源的有效保護與深入研究、利用開辟了新的途徑，目前已有大量的植物構(gòu)建了核心種質(zhì)，但主要以作物為主[2]。相較于農(nóng)作物，林木核心種質(zhì)的構(gòu)建起步較晚，涉及的樹種也有限，近10 年國內(nèi)相關(guān)研究主要涉及的樹種有核桃[4]、毛白楊[5]、木荷[2]、馬尾松[6]等。目前構(gòu)建核心種質(zhì)主要是基于形態(tài)和分子標記兩類數(shù)據(jù)，對于多年生、樹體高大的木本植物，表型數(shù)據(jù)獲取需要較長的年限；而以DNA 多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標記不受植物生長期影響，較形態(tài)標記更適合林木核心種質(zhì)構(gòu)建[7]。例如在SSR 標記遺傳多樣性基礎(chǔ)上，采用逐步聚類法以17.2%的入選率構(gòu)建了包含164 份種質(zhì)的三葉木通核心種質(zhì)[8]；根據(jù)以等位基因最大化為標準，從272 份金縷梅種質(zhì)資源中提取了51 份核心種質(zhì)，能夠代表原種質(zhì)95%的等位基因數(shù)。總的來說，核心種質(zhì)是種質(zhì)資源的重復(fù)子集，有助于資源長期保存和長效利用，可以幫助研究者快速捕捉到具有目標性狀的種質(zhì)，提高育種效率[9]。

楠木（Phoebe zhennan）是我國特有的珍貴用材樹種，其優(yōu)質(zhì)大徑級木材因呈現(xiàn)金黃色絹絲狀而被稱為“金絲楠”，是“金絲楠木”的最優(yōu)來源樹種之一，但由于其生長緩慢，加之歷代無節(jié)制采伐，楠木資源趨于枯竭，楠木現(xiàn)存資源多為人工栽培群體[10-11]。人為活動的干擾可能會導(dǎo)致降低其遺傳多樣性水平，大量優(yōu)良基因缺失，群體趨于純化，遺傳基礎(chǔ)變窄[12]。而珍貴用材是林木資源戰(zhàn)略儲備的重要組成部分，因此，加強對珍貴樹種楠木的恢復(fù)性培育尤為重要，并應(yīng)作為長期堅持的任務(wù)。為了保護楠木的優(yōu)良種質(zhì)資源和維持其可持續(xù)性遺傳改良，亟需開展楠木核心種質(zhì)的構(gòu)建。鑒于此，我們以楠木第一輪育種群體（102 份種質(zhì)資源）為研究對象，利用SSR 引物進行基因分型，通過比較和分析不同抽樣策略下構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳參數(shù)評價，確定楠木核心種質(zhì)構(gòu)建的最適取樣策略和比例，期望用最少的種質(zhì)最大程度保存楠木遺傳多樣性，同時為楠木種質(zhì)資源的深入研究和加強利用、發(fā)掘優(yōu)異基因資源提供理論依據(jù)和核心材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2012 年，在四川、重慶、湖南、湖北和貴州省等楠木產(chǎn)區(qū)根據(jù)樹高、胸徑和環(huán)境適應(yīng)性選擇優(yōu)樹102 株，基本涵蓋了楠木天然分布區(qū)，分單株采集優(yōu)樹種子，沙藏；2013 年春季分家系育苗；2014 年在瀘州市玉蟾山國家林草長期科研基地建立楠木種質(zhì)資源基因庫（105.387529°E,29.137715°N,海拔553 m）。2022 年6 月，對102 個家系采集新鮮嫩葉，將其放入硅膠中保存，帶回實驗室置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA 提取與SSR 擴增

本研究采用改良CTAB 法快速提取楠木基因組DNA。選用14 對條帶清晰、多態(tài)性強的SSR 引物進行PCR 擴增（見表1），SSR 引物由生工生物（上海）股份有限公司合成熒光引物，擴增產(chǎn)物經(jīng)Fragment Analyzer 全自動毛細管電泳分析儀進行檢測[13]。

表1 用于楠木核心種質(zhì)構(gòu)建的SSR 引物基本信息Tab.1 Base information of SSR primers used in core collection construction of Phoebe zhennan

1.3 核心種質(zhì)構(gòu)建策略

（1）M 策略：以核心種質(zhì)中標記位點最大化為標準的核心種質(zhì)構(gòu)建方法[14]。通過Core Finder 軟件以等位基因最大化為原則抽取核心種質(zhì)[15]。

（2）隨機取樣法：依據(jù)張春雨等[16]隨機取樣策略，以10%、20%、40%和50%為取樣比例，分別構(gòu)建核心種質(zhì)。

（3）以核心種質(zhì)保留等位基因或遺傳多樣性最大化分別構(gòu)建核心種質(zhì)，抽樣比例為10%、20%、40%和50%，借助PowerMarker version 3.25 軟件進行核心種質(zhì)的抽取[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Genemarker 2.2.0 軟件分析毛細管電泳數(shù)據(jù)。Cervus 3.0.7 軟件計算多態(tài)信息含量（PIC）[18]。利用GeneAlEx 6.5 軟件[19]計算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測雜合度及Shannon’s 信息指數(shù)，用這些指標來評價核心種質(zhì)、原有種質(zhì)與保留種質(zhì)的遺傳多樣性，并通過t檢驗對核心種質(zhì)與原有種質(zhì)各遺傳多樣性指標進行差異顯著性分析[2]。同時，運用主坐標分析法對構(gòu)建的核心種質(zhì)進行確認。最后，將SSR-PCR 產(chǎn)物毛細管電泳譜帶轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋圖譜，以此構(gòu)建楠木核心種質(zhì)的分子身份信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 楠木種質(zhì)資源SSR 遺傳多樣性參數(shù)

利用14 對SSR 引物對102 份楠木種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析（見表2）。結(jié)果顯示，14 對SSR引物共檢測到166 個等位基因，每對SSR 引物檢測到等位基因數(shù)的范圍在2（PZmf07、CL20730-Contig1、PZmf05 和PZmf02）～37（MN-g3）之間，平均為12。有效等位基因數(shù)平均為4.875，各引物檢測到的有效等位基因數(shù)在1.021（PZmf02）～3.125（MN-g3）之間。期望雜合度與觀測雜合度分別在0.117（PZmf07）～0.943（MN-g3）和0.000（PZmf07、PZmf05、PZmf06 和PZmf02）～0.978（MN-g3）之間，平均分別為0.561 和0.373。Shannon’s 信息指數(shù)最高的為引物MN-g3（3.125），其次為引物MN-g5（3.029），最低為引物PZmf02（0.057），楠木種質(zhì)資源平均Shannon’s 信息指數(shù)為1.297。以上結(jié)果表明楠木種質(zhì)資源具有較為豐富的遺傳多樣性。

表2 楠木102 份種質(zhì)資源遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 The genetic diversity parameters of P.zhennan germplasm resources

2.2 不同取樣策略構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)比較分析

隨取樣比例的增加，不同取樣策略構(gòu)建的候選核心種質(zhì)等位基因數(shù)及其保留率呈逐漸上升的趨勢（見表3）。在取樣比例較低時，各遺傳多樣性參數(shù)值和保留率均處于較低水平。如隨機取樣和遺傳多樣性最大化策略在取樣比例低于20%時，其等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)的保留率均低于60%，表現(xiàn)出明顯的等位基因缺失。當(dāng)取樣比例為50%時，雖然隨機取樣、等位基因最大化和遺傳多樣性最大化法構(gòu)建的候選核心種質(zhì)Shannon’s 信息指數(shù)均略高于原有種質(zhì)，但其余遺傳多樣性參數(shù)，如觀測雜合度、期望雜合度明顯低于原有種質(zhì)。而M 策略以58.8%的取樣比例構(gòu)建的核心種質(zhì)有效等位基因數(shù)、Shannon’s 信息指數(shù)、觀測雜合度以及期望雜合度均明顯高于原有種質(zhì)，等位基因數(shù)保留率100%。不同取樣策略構(gòu)建的候選核心種質(zhì)與原有種質(zhì)遺傳參數(shù)t檢驗結(jié)果顯示，Shannon’s 信息指數(shù)和期望雜合度在各種質(zhì)間無顯著差異，候選核心種質(zhì)與原有種質(zhì)存在顯著差異的遺傳參數(shù)主要集中在等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)和觀測雜合度。10%取樣比例時，隨機取樣、等位基因最大化和遺傳多樣性最大化法構(gòu)建的候選核心種質(zhì)等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)均顯著低于原有種質(zhì)。M 策略構(gòu)建的核心種質(zhì)各遺傳參數(shù)與原有種質(zhì)并無顯著差異。根據(jù)5 個遺傳參數(shù)的綜合考慮，選擇M 策略抽取的60 份（58.8%）種質(zhì)資源構(gòu)建的楠木和新種指能夠以較小的種質(zhì)份數(shù)最大程度地代表整個楠木種質(zhì)資源地遺傳多樣性。利用M 策略構(gòu)建的楠木核心種質(zhì)中包含四川36 份（55.4%）、湖北5 份（45.5%）、湖南11 份（64.7%）、貴州5 份（83.3%）和重慶3 份（100.0%）共計60 份種質(zhì)材料。

表3 不同取樣策略構(gòu)建的候選核心種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)比較Tab.3 Comparisons of genetic diversity parameters of candidates core collection constructed by different tactics

2.3 核心種質(zhì)確認及評價

M 策略構(gòu)建的楠木核心種質(zhì)保留了原有種質(zhì)58.8%的材料，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s 信息指數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度的保留率分別為100.0%、106.9%、105.5%和102.7%（見表4）。t檢驗結(jié)果也表明，利用M 策略構(gòu)建的楠木核心種質(zhì)和原有種質(zhì)的遺傳多樣性參數(shù)間差異不顯著。由此，認為本研究利用M 策略構(gòu)建的核心種質(zhì)具有很高的代表性。采用主坐標分析法（PCoA）對構(gòu)建的核心種質(zhì)進行比較分析，以進一步確定其代表性。結(jié)果顯示，楠木核心種質(zhì)在整個種質(zhì)資源的主坐標圖內(nèi)均勻分布，表明M 策略構(gòu)建的楠木核心種質(zhì)具有很好的代表性（見圖1）。

圖1 核心種質(zhì)與原有種質(zhì)對比的主坐標圖Fig.1 Principal coordinates lots of core collection and original collection

表4 核心種質(zhì)、保留種質(zhì)與原有種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)對比Tab.4 Comparison of genetic diversity parameters among core collection,reserve collection,and original collection

2.4 核心種質(zhì)分子身份信息

利用14 對SSR 引物擴增的全部多態(tài)性譜帶構(gòu)建了60 份楠木核心種質(zhì)的分子身份信息（見表5）。每份核心種質(zhì)材料都有其唯一的分子身份信息，可以通過其專一的分子身份信息將60 份核心種質(zhì)材料相互區(qū)分鑒別出來。

表5 核心種質(zhì)的分子身份信息Tab.5 Molecular ID of core collection

3 討論

種質(zhì)資源收集和保存對于保存物種遺傳多樣性和育種利用具有重要意義，是育種循環(huán)的必不可少的組成部分。所以，采用合適的技術(shù)方法構(gòu)建核心種質(zhì)，對于優(yōu)異種質(zhì)資源的挖掘利用，提高種質(zhì)資源的利用價值和效率具有重要的指導(dǎo)意義[3]。而關(guān)于林木核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，前人已有一些研究。Yang 等[6]認為核心種質(zhì)的數(shù)量應(yīng)根據(jù)種質(zhì)資源的總數(shù)及其遺傳變異的豐富程度而定。如果種質(zhì)資源數(shù)較少，則核心種質(zhì)取樣的比例可以相對大一些；如種質(zhì)資源總數(shù)很大，則核心種質(zhì)取樣比例可以小一些[5]。例如，Yang 等[6]在304 份馬尾松二代育種群體中以34.2%的比例抽取104 份種質(zhì)構(gòu)建了馬尾松二代育種核心種質(zhì)。楊漢波等[2]以15.3%的比例從754 份木荷種質(zhì)資源中抽取115 份種質(zhì)組成木荷核心種質(zhì)。本研究利用M 策略以58.8%的抽樣比例從102 份楠木種質(zhì)資源中抽取60 份種質(zhì)組建核心種質(zhì)，能夠最大程度地代表原有種質(zhì)的遺傳多樣性。以上結(jié)果均反映出供試種質(zhì)資源數(shù)量對核心種質(zhì)抽樣比例有明顯影響，分析其原因可能為：（1）相對較少的種質(zhì)資源數(shù)，暗示種質(zhì)資源選擇時的強度較大，中選并保存的優(yōu)異種質(zhì)資源具有豐富的遺傳變異，導(dǎo)致在構(gòu)建核心種質(zhì)時需要抽取更多的種質(zhì)數(shù)以保證核心種質(zhì)的代表性；（2）核心種質(zhì)抽樣方法的不同也可能造成最終核心種質(zhì)抽樣比例存在差異。因此，對于不同種質(zhì)資源總數(shù)的樹木核心種質(zhì)抽樣方法的選擇對正確構(gòu)建核心種質(zhì)的關(guān)鍵。

目前，主要通過表型數(shù)據(jù)、遺傳標記數(shù)據(jù)或表型與分子標記相結(jié)合的方式來構(gòu)建核心種質(zhì)[20]。在許多作物中，通常是應(yīng)用形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)對原始群體進行壓縮，建立基于形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的初級核心種質(zhì)，然后再利用分子數(shù)據(jù)壓縮原始群體，建立基于分子數(shù)據(jù)的初級核心種質(zhì)，最后將二者進行綜合，構(gòu)建最終的核心種質(zhì)[21-22]。但這在樹體高大、表型變異豐富的林木而言，要得到可靠的表型數(shù)據(jù)需要較長的年限[23]。DNA 分子標記不會或極少受到環(huán)境的影響，較形態(tài)學(xué)標記更適用于構(gòu)建核心種質(zhì)，且優(yōu)勢明顯[24-25]。已有相當(dāng)數(shù)量的林木樹種利用分子標記技術(shù)成功構(gòu)建了核心種質(zhì)，反映出DNA 標記技術(shù)在林木核心種質(zhì)構(gòu)建中的高效性和準確性。例如，Liang等[26]利用SSR 標記從蘋果種質(zhì)中以13.2%的抽樣比例構(gòu)建了蘋果核心種質(zhì)。劉勇等[27]根據(jù)678 個SSR和AFLP 分子標記聚類結(jié)果，采用逐級壓縮法選擇、構(gòu)建了包含25 份樣本的柚類核心種質(zhì)。曾憲君等[28]利用SSR 分子遺傳多樣性以30.2%的抽樣比例構(gòu)建了歐洲黑楊核心種質(zhì)。本研究中，基于等位基因和遺傳多樣性取樣策略構(gòu)建的楠木核心種質(zhì)等位基因數(shù)等遺傳多樣性參數(shù)保留率明顯高于隨機取樣策略。這與劉娟等[29]、楊漢波等[2]對杏和木荷核心種質(zhì)構(gòu)建的結(jié)果相一致，均證明基于等位基因和遺傳多樣性優(yōu)先的取樣策略優(yōu)于隨機取樣策略。本研究對不同取樣策略構(gòu)建的候選核心種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)利用t檢驗在統(tǒng)計學(xué)上進行驗證，以驗證各候選核心種質(zhì)的代表性。最終確定M 策略是楠木核心種質(zhì)的最優(yōu)取樣策略，并以此構(gòu)建了包含60 份種質(zhì)的楠木核心種質(zhì)，5 個?。ㄊ校┑姆N質(zhì)資源均有抽取。當(dāng)然，由于本次研究的楠木種質(zhì)資源總數(shù)偏少且遺傳多樣性豐富，導(dǎo)致核心種質(zhì)抽取比例偏大，也從側(cè)面反映出資源收集的欠缺，后續(xù)應(yīng)當(dāng)進一步強化楠木種質(zhì)資源全面調(diào)查，以最大限度地收集楠木優(yōu)良種質(zhì)資源，擴大種質(zhì)資源的數(shù)量，提高遺傳多樣性，以期在楠木育種循環(huán)中獲得更高的遺傳增益。

通過DNA 指紋是目前品種資源鑒定的有效技術(shù)手段，在植物品種鑒定中得到廣泛應(yīng)用[30]。如郭娟等[31]利用61 條SRAP 特異性條帶構(gòu)建了5 個楊樹品種的分子指紋圖譜。何旭東等[32]優(yōu)選核心EST-SSR引物組合構(gòu)建楊樹品種的指紋圖譜，可以將33 個楊樹品種準確區(qū)分開來。沈敬理等（2015）采用15 個SSR 位點+2 對SRAP 標記組合的方式構(gòu)建了馬尾松種子園131 個無性系的DNA 指紋圖譜，可有效區(qū)分種子園各無性系。以上研究均表明，利用分子標記技術(shù)可實現(xiàn)種質(zhì)或品種的高效、精準鑒別。本研究利用全部14 對SSR 引物擴增的多態(tài)性條帶構(gòu)建了60份楠木核心種質(zhì)的分子身份信息，可以實現(xiàn)每份核心種質(zhì)的準確鑒定。考慮到引物數(shù)量在種質(zhì)鑒定中重要作用，在今后的工作中，可適當(dāng)增加標記數(shù)量以形成更加精準的分子身份信息，以提高種質(zhì)鑒定的準確性，為輔助雜交親本選配和再選育提供參考。