王海貞, 劉 昕

1呂梁學院生命科學系, 山西 呂梁 033000; 2中山大學生命科學學院, 廣東 廣州 510275

青藏高寒牧區(qū)草場的高寒草甸是青藏高原地區(qū)面積最大的生態(tài)系統(tǒng),是國家生態(tài)安全屏障,也是牧民農牧業(yè)賴以生存的自然資源。據(jù)報道,青藏高寒牧區(qū)草場的草原毛蟲GynaephoraqinghaiensisChou et Ying危害嚴重,蟲害暴發(fā)時每平方米可達上千條,往往牧草剛返青就被啃食殆盡(范小建, 2011)。在草原毛蟲危害嚴重的年份,采用化學農藥大面積捕殺成為主要方法,嚴重破壞了青藏高寒牧區(qū)的生態(tài)平衡,且加劇了農藥殘留污染。因此,尋找適合的可對草原毛蟲進行生物防治的寄生天敵昆蟲,研究草原毛蟲的生物防治方法,是實現(xiàn)綠色、環(huán)保、無公害、可持續(xù)控制草原毛蟲蟲害的有效途徑,對保護青藏高寒牧區(qū)草甸生態(tài)環(huán)境、促進高寒牧區(qū)農牧業(yè)健康有序發(fā)展具有重要意義。

三江源草原毛蟲金小蜂PteromalussanjiangyuanicusYang是王海貞(2020)在草原毛蟲蛹期采集到的一種寄生蜂,后經過楊忠岐等(2020)從形態(tài)學水平鑒定為金小蜂科的一種新種。研究表明,三江源草原毛蟲金小蜂對寄主草原毛蟲蛹的自然寄生率較高,且出蜂量較大,是草原毛蟲蛹期的優(yōu)勢寄生天敵昆蟲,可作為擴繁的天敵昆蟲對草原毛蟲進行生物防治(王海貞,2020)。但是作為金小蜂科的一種新種,分子標記水平的物種鑒定還未完成,以及在進化過程中系統(tǒng)發(fā)育關系目前還不清楚,不利于這個新物種分類學及遺傳結構的深入研究,制約了其對草原毛蟲生物防治潛能的挖掘。

線粒體DNA (mitochondria DNA, mtDNA)是一種群體遺傳學研究常用的分子標記(王玲等,2018; 殷玉生等,2012; 張桂芬等,2014; 張莉麗等,2016; Oleksiyetal.,2022),具有進化速度快、母系遺傳、基因重組缺失以及易于擴增等特點(Djebbietal.,2018; Palrajuetal.,2018; Wangetal.,2021),是國際公認的廣泛應用于昆蟲種類鑒別的分子生物學技術之一(Janzenetal.,2017; Zhengetal.,2019)。目前,昆蟲線粒體基因研究中結構與功能研究較為深入的是線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因,在傳粉小蜂Wiebesiapumilae(Hill)(吳文珊等,2013)、榕小蜂Eupristinasp.(陳友鈴等,2013)、赤眼蜂Trichogrammasp.(李虹兵等,2018)等多種寄生蜂的遺傳多樣性及種群結構中廣為應用。

本研究基于線粒體COⅠ基因,采用分子生物學手段對三江源草原毛蟲金小蜂進行物種輔助鑒定,并通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹,探索三江源草原毛蟲金小蜂的系統(tǒng)發(fā)育關系,為支持三江源草原毛蟲金小蜂的形態(tài)學物種鑒定結果,以及深入研究三江源草原毛蟲金小蜂的系統(tǒng)發(fā)育提供了科學依據(jù),對草原毛蟲的生物防治具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

本研究所用的三江源草原毛蟲金小蜂樣品采集自青海省玉樹州治多縣海拔4580 m高寒草甸的草原毛蟲蛹內,并浸泡于非凍型DNA組織保存液(天恩澤)中,4 ℃保存,用于樣品總DNA的提取。

1.2 總DNA提取與檢測

三江源草原毛蟲金小蜂總DNA的提取參照基因組DNA提取試劑盒說明書(Axygen)進行。采用Nanodrop 2000分光光度計 (Thermo Fisher Scientific)檢測樣品DNA的濃度和純度。如果提取的樣品DNA濃度過高,在進行PCR試驗前需對樣品DNA進行稀釋。

1.3 COⅠ基因擴增反應

三江源草原毛蟲金小蜂線粒體COⅠ基因擴增引物設計參照小蜂總科COⅠ基因通用引物(吳文珊等,2013),上游引物序列為5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′,下游引物為5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′。PCR反應的總體積為50 μL,其中含有4 μL DNA模板(40 ng·μL-1),各2 μL雙向引物(10 μmol·L-1),5 μL 10×rTaqBuffer (20 mmol·L-1Mg2+),4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1),0.25 μL rTaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1),32.75 μL ddH2O;PCR擴增條件為95 ℃預變性3 min, 94 ℃變性45 s,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸 1 min,35 個熱循環(huán),最后在72 ℃延伸7 min。 擴增產物用1%瓊脂糖電泳進行驗證,并挑選擴增效果較好的樣品,委托華大基因科技有限公司進行正反鏈雙向測序。

1.4 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構建

1.4.1 COⅠ基因序列拼接及堿基組成分析 利用Seqman軟件對測序所得的三江源草原毛蟲金小蜂線粒體COⅠ基因正反向序列進行拼接,刪除頭尾載體序列,通過觀察測序峰圖校正可疑位點,然后將拼接完成后的序列保存為Fasta格式的文件,并對拼接后的基因序列堿基組成進行統(tǒng)計分析。

1.4.2 基于COⅠ基因的物種分子鑒定與構建系統(tǒng)發(fā)育樹物種選擇 本研究將測序得到的COⅠ基因序列在NCBI中Nucleotide BLAST (basic local alignment search tool)進行序列比對,根據(jù)比對序列的相似度,進行物種分子鑒定。同時,挑選與三江源草原毛蟲金小蜂線粒體COⅠ基因序列相似度較高且具有科、屬代表性的膜翅Hymenoptera小蜂總科Chalcidoidea寄生蜂(共5科9屬11種)用于遺傳關系的分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建(表1)。選取的COⅠ基因序列通過登錄號從GenBank中下載,并保存為Fasta格式文件,用于物種間基因序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。

表1 GenBank中收錄的11種寄生蜂COⅠ基因信息Table 1 Information of COⅠ gene of eleven parasitic wasps from GenBank

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構建 應用Mega 6.0軟件,基于Kimura 2-paramter模型,計算物種間的遺傳距離;通過鄰接法(neighbor-joining)構建系統(tǒng)發(fā)育N-J樹,采用自舉法(bootstrap)重復抽樣1000次檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度(Tamuraetal.,2013)。

2 結果與分析

2.1 基因序列分析與物種分子鑒定

獲得的三江源草原毛蟲金小蜂線粒體COⅠ基因正向序列長度為847 bp,反向序列長度為845 bp。采用Seqman軟件對正反向序列進行拼接組裝,得到校正后的COⅠ基因序列長度為812 bp,A、T、C、G堿基含量分別為34.36%、42.61%、10.59%、12.44%,AT含量達76.97%,GC含量達23.03%,AT含量顯著高于GC含量,具有明顯的AT偏好性。NCBI數(shù)據(jù)庫Blast結果顯示,三江源草原毛蟲金小蜂與蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum(L.) COⅠ基因相似度最高,為91.12%。

2.2 遺傳距離分析

遺傳距離分析結果如表2所示,三江源草原毛蟲金小蜂與蝶蛹金小蜂遺傳距離最小,為0.060,與Apocryptasp.遺傳距離最大,為2.760,表明進化過程中三江源草原毛蟲金小蜂與蝶蛹金小蜂親緣關系最近,與Apocryptasp.親緣關系最遠。

表2 基于小蜂總科比對物種COⅠ基因遺傳距離矩陣Table 2 The matrix of genetic distance for COⅠ gene of comparing Chalcidoidea species

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育N-J樹(圖1)顯示,Aphelinidae sp.PC124、Aphelinidae sp.、Apocryptasp. PC123這3個物種先后聚為一支,并從小蜂總科其他物種中分離出來,表明這3個物種與其他物種在進化上不屬于一個分類階層;三江源草原毛蟲金小蜂先后與Eupelmussp.、Sycoscaptersp.、Idiomacromerussp.、Diaziellabizarre、Eurytomasp.聚為一支,且與Idiomacromerussp.+ (Diaziellabizarre+Eurytomasp.) + (Eupelmussp.+Sycoscaptersp.)形成姊妹群。

圖1 基于COⅠ基因構建的三江源草原毛蟲金小蜂系統(tǒng)發(fā)育N-J樹Fig.1 Phylogenetic N-J tree of P. sanjiangyuanicus based on COⅠ gene

3 討論與結論

寄生天敵昆蟲種類鑒定是害蟲生物防控的前提,而建立在形態(tài)學特征觀察基礎上的物種鑒定,通常情況下會因為觀察者的主觀性而導致物種鑒定不準確,同時,傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒別技術需要由專業(yè)的高技術人員識別,而且受樣本保存情況、樣品發(fā)育階段、細微差異的近緣種等因素的限制(盧西西等,2022)。隨著DNA條形碼技術在昆蟲分類學中的應用,利用形態(tài)學觀察與分子生物學相結合的技術逐漸取代了單一依靠形態(tài)學觀察的物種鑒定方法,為物種鑒定提供了更加全面的證據(jù),也為發(fā)現(xiàn)隱存種、新物種提供了新的依據(jù)(Ogden &Lindsay,2016)。本研究在前期已經對從草原毛蟲蛹中采集到的寄生蜂進行了形態(tài)學物種鑒定,并認為是金小蜂科的新種——三江源草原毛蟲金小蜂(楊忠岐等,2020),但未對其進行分子生物學物種輔助鑒定。為了使鑒定結果更加科學準確,本研究采用COⅠ基因分子標記技術,對采集到的寄生蜂樣品再次進行物種輔助鑒定,NCBI數(shù)據(jù)庫Blast結果顯示,本研究采集到的寄生蜂與蝶蛹金小蜂COⅠ基因序列相似度最高,而蝶蛹金小蜂為金小蜂科寄生蜂,表明所采樣品也可能為金小蜂科寄生蜂,但根據(jù)楊忠岐等(2020)的形態(tài)學鑒定結果,所采樣品與金小蜂科其他寄生蜂種類在形態(tài)特征方面存在差異,因此,可以確定本研究從草原毛蟲蛹內采集到的寄生蜂為金小蜂科的新種,再次支持了形態(tài)學物種鑒定結果。形態(tài)學與分子生物學鑒定相結合的方法為三江源草原毛蟲分類學的深入研究提供了參考依據(jù),豐富了草原毛蟲生物防控寄生天敵資源庫。

草原毛蟲是分布在我國青藏高原高寒牧區(qū)的一種重要害蟲,對高寒草甸植被破壞相當嚴重(王海貞和劉昕,2022)。青藏高原地理環(huán)境異常極端惡劣,因此,國內外對草原毛蟲寄生天敵資源調查研究報道較少。1980年,沈南英等(1980)在草原毛蟲蛹內發(fā)現(xiàn)了膜翅目金小蜂科寄生蜂草原毛蟲金小蜂PteromalusqinghaiensisLiao。三江源草原毛蟲金小蜂與草原毛蟲金小蜂雖然在形態(tài)上都保留了金小蜂科的特征,但也有一些細微差異,因此被鑒定為2個不同的種(楊忠岐等,2020)。由于草原毛蟲金小蜂沒有分子方面的基因信息資源,因此無法與三江源草原毛蟲做序列比對,進行深入的系統(tǒng)發(fā)育研究。故此,本研究只能選用小蜂總科中與三江源草原毛蟲金小蜂COⅠ序列相似度較高的11種寄生蜂進行序列比對,以此來研究三江源草原毛蟲金小蜂在小蜂總科中的進化地位。遺傳距離是評估物種之間親緣關系的最直接證據(jù),三江源草原毛蟲金小蜂與蝶蛹金小蜂的遺傳距離最小,揭示在進化過程中三江源草原毛蟲金小蜂與蝶蛹金小蜂親緣關系最近。這在一定程度上再次支持了三江源草原毛蟲金小蜂的形態(tài)學物種鑒定結果。系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結果顯示,三江源草原毛蟲金小蜂先后與Eupelmussp.、Sycoscaptersp.、Idiomacromerussp.、Diaziellabizarre、Eurytomasp.聚為一支,且與Idiomacromerussp.+(Diaziellabizarre+Eurytomasp.)+(Eupelmussp.+Sycoscaptersp.)形成姊妹群,表明三江源草原毛蟲金小蜂在進化上可能與這5種寄生蜂處于同一分類階層。

選擇合適的分子標記,是用DNA序列進行準確分析的前提,不同的DNA序列在生物體中行使不同的功能,所承受的環(huán)境選擇壓力不同,因而在序列進化速度上存在差異(梁宏偉等,2018; 李愛梅等,2022; 許佳丹等,2019)。對生物不同分類階元進行鑒定時,對所選擇的分子標記的變異速度有不同的要求。在對亞種、種、屬等較低的分類階元進行研究時,要求所選擇的分析標記要有較快的變異速度,這樣才能確保在親緣關系較近的不同個體之間存在足夠的變異能夠將它們區(qū)別開來(吳文珊等,2013)。在本研究中,與三江源草原毛蟲金小蜂進行序列比對的11個寄生蜂物種均為小蜂總科昆蟲,屬于較低級的分類單元,因此選用進化速度相對較快的COⅠ序列進行系統(tǒng)發(fā)育研究。此外,很多學者認為,僅僅利用一個基因的分子標記進行物種鑒定時,可能存在一定的誤差風險(吳文珊等,2013),因此,今后應利用線粒體COⅡ、Cytb基因及核糖體16S、28S基因對三江源草原毛蟲金小蜂進行更加全面的分子生物學物種鑒定。