鄧云雙　李桃　鄧曉玲　鄭正

關(guān)鍵詞：柑橘黃龍病；癥狀；茶枝柑；橘絡(luò)；病原分布

中圖分類號(hào)：S436.66 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing， HLB）是世界柑橘生產(chǎn)中最具毀滅性的病害之一，對(duì)全球的柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。黃龍病病原為α- 變形菌綱（ Alphaproteobacteria ）， 根瘤菌科（Rhizobiaceae），候選韌皮部桿菌屬細(xì)菌（Candidatusliberibacter spp.）[1]。根據(jù)病原16S rDNA 和β-操縱子基因的序列特征，以及傳病媒介和病原性質(zhì)，可分為亞洲種（Candidatus Liberibacterasiaticus， CLas）、非洲種（Candidatus Liberibacterafricanus， CLaf）和美洲種（Candidatus Liberibacteramericanus， CLam），其中CLas 的分布范圍最廣，危害最大[2]。通過(guò)對(duì)我國(guó)柑橘黃龍樣品進(jìn)行16SrRNA 基因的擴(kuò)增以及測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，我國(guó)柑橘黃龍病菌均為CLas[3-4]。柑橘感染黃龍病后葉片會(huì)出現(xiàn)均勻黃化、斑駁黃化以及缺素狀黃化等癥狀，同時(shí)植株不定期抽稍，開花多而早，座果率低，果實(shí)小而畸形，果實(shí)成熟期出現(xiàn)“紅鼻子”果、“青果”等典型癥狀[5]。

黃龍病作為系統(tǒng)性侵染病害，其病原在染病植株內(nèi)分布并不均勻[3， 6-16]。郭亨玉等[7]發(fā)現(xiàn)染病貢柑橘絡(luò)中的CLas 濃度最高且顯著高于其他部位（果實(shí)中軸、新葉等）。陳燕玲等[8]發(fā)現(xiàn)同一病枝的“紅鼻子果”中CLas 濃度高于葉片的，而斑駁老葉的CLas 濃度低于新葉。健康植株在染病后，體內(nèi)的病原菌濃度分布并不均勻，不同組織間也存在差異[9]。婁兵海等[11]發(fā)現(xiàn)柑橘花器和種子中的CLas 分布不均，其中種皮組織濃度最高，花粉濃度最低。FANG 等[13]發(fā)現(xiàn)CLas 在染病沙糖桔的果皮內(nèi)分布不均勻，傾向于定植于果皮的中間或遠(yuǎn)端（莖端）區(qū)域。KUNTA 等[14]發(fā)現(xiàn)葡萄柚和甜橙的花梗、果軸、葉中脈的CLas 濃度明顯高于其他部位。LOUZADA 等[15]發(fā)現(xiàn)在樹的北側(cè)CLas 濃度顯著高于南、西兩側(cè)；而對(duì)于樹的根部，土壤表層及水平生長(zhǎng)根中的CLas 濃度高于深層垂直生長(zhǎng)的根。TATINENI 等[16]發(fā)現(xiàn)在染病柑橘果柄處的CLas 濃度最高，且顯著高于其他部位。

茶枝柑（Citrus reticulata cv. chachiensis）又稱新會(huì)柑，在廣東新會(huì)栽培歷史悠久，是廣東地區(qū)的特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)品[17]。利用其果皮加工制成的陳皮具有一定的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[18]。茶枝柑在感染黃龍病菌后，會(huì)出現(xiàn)植株衰退，甚至大幅度減產(chǎn)的情況，嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[19]。目前，尚無(wú)茶枝柑感染黃龍病后的癥狀表現(xiàn)及病原在植株中分布情況的系統(tǒng)報(bào)道。本研究以廣東新會(huì)地區(qū)感染黃龍病的茶枝柑為材料，對(duì)茶枝柑感染黃龍病后的癥狀進(jìn)行系統(tǒng)描述，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)CLas 在茶枝柑枝條不同部位中的含量及分布情況進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探究CLas 在茶枝柑中的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律提供基礎(chǔ)，同時(shí)也可為篩選高濃度的黃龍病菌材料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感染黃龍病的茶枝柑枝條 2021 年11 月于廣東省新會(huì)市采集具有黃龍病典型癥狀的茶枝柑帶果枝條若干，經(jīng)Real-time PCR 檢測(cè)后挑選攜帶黃龍病菌的帶果枝條作為試驗(yàn)材料。挑選來(lái)自不同植株的25 枝具有黃龍病典型癥狀的茶枝柑帶果枝條，作為25 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。如圖1 所示，將每個(gè)帶果枝條依次分為：新葉、新梢枝條韌皮部、果蒂、橘絡(luò)、果實(shí)中軸、果實(shí)枝條葉片、果實(shí)枝條韌皮部、下部老葉8 個(gè)部分。樣品收集后置于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 感染黃龍病的茶枝柑果實(shí)橘絡(luò) 挑選14 個(gè)直徑較大且經(jīng)過(guò)檢測(cè)攜帶黃龍病菌的茶枝柑果實(shí)作為材料，用工具使橘絡(luò)從果實(shí)中完整分離。如圖2 所示，每個(gè)果實(shí)挑取3 條較長(zhǎng)并且長(zhǎng)度超過(guò)5 cm 的橘絡(luò)，按從果蒂到果實(shí)底部的方向進(jìn)行切段，每1 cm 為一段，只保留前5 段，切碎置于2 mL收集管中，舍棄多余橘絡(luò)（不足1 cm），收集的橘絡(luò)用于DNA 提取及CLas 定量檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 植物DNA 提取 所有樣品分別處理切碎取0.1 g 進(jìn)行DNA 提取，其中柑橘葉片僅切取葉中脈。提取總DNA 的方法選用OMEGA BIO-TEK公司的植物DNA 提取試劑盒HP Plant DNA Kit（200） （2485-02）。提取的DNA 樣品使用超微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)NanoDrop one（ThermoFisher Scientific）進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，并置于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 柑橘黃龍病菌的檢測(cè)與定量 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)CLas 進(jìn)行檢測(cè)與定量。檢測(cè)方法參考BAO 等[20]的CLas 定量PCR 檢測(cè)方法，對(duì)所有DNA 樣品進(jìn)行TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。以已知含有CLas 的茶枝柑DNA 樣本為陽(yáng)性對(duì)照，健康茶枝柑DNA 樣本為陰性對(duì)照，ddH2O 為空白對(duì)照，以提取的所有DNA 樣品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。根據(jù)反應(yīng)后得到的CT 值來(lái)判斷樣品中是否含有柑橘黃龍病病菌（CT 值<32）。

qPCR 使用含有引物目的片段pEASY-T1（TransGen Biotech，全式金生物）重組質(zhì)粒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，共設(shè)置8 個(gè)梯度（10 倍稀釋），得到標(biāo)準(zhǔn)方程以量化在總DNA 中的CLas 含量。同一枝條不同部位中的CLas 含量以每1 ng DNA 含有的CLas 拷貝數(shù)來(lái)表示。同一橘絡(luò)不同片段中的CLas含量=每1 μL DNA 的CLas 拷貝數(shù)×提取的總DNA 體積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26 和Microsoft Excel 2019 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用SPSS 26（IBMCorp.，Armonk， N.Y.， USA）單因素方差分析（ANOVA）中的鄧肯式復(fù)極差檢驗(yàn)法（DMRT）進(jìn)行多重比較，利用Origin 2018（OriginLab Corp.， Northampton，MA 01060， USA）對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染黃龍病茶枝柑的癥狀觀察

茶枝柑植株在感染黃龍病后，枝條上部葉片表現(xiàn)為斑駁型、缺素狀黃化，尤其是枝條新葉癥狀較為明顯，而下部老葉顏色深綠無(wú)黃化，質(zhì)地較硬（圖1）；而感染柑橘黃龍病的茶枝柑果實(shí)（圖3A～圖3C）與健康茶枝柑果實(shí)（圖3D～圖3F）相比，果實(shí)著色不均勻，由果蒂向下呈橘紅色，接近果實(shí)底部顏色接近青綠色，為典型的“紅鼻子”果癥狀，同時(shí)感染黃龍病的果實(shí)與健康果實(shí)相比，大小不均勻，果身不正，呈不對(duì)稱畸形狀；切開果實(shí)可見(jiàn)種子極小，種子呈敗育癥狀。

2.2 黃龍病菌在茶枝柑枝條不同部位的分布

通過(guò)對(duì)感染黃龍病茶枝柑枝條的8 個(gè)部位樣品進(jìn)行CLas 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在25 個(gè)染病枝條中，除果實(shí)橘絡(luò)、中軸及老葉能穩(wěn)定檢測(cè)到CLas 外，其他部位均有部分樣本未檢測(cè)到CLas，尤其是新梢部位（包括新葉中脈和新梢韌皮部）的陰性樣本比其他部位多（表1）。定量結(jié)果表明，CLas 在染病茶枝柑枝條中的分布并不均勻（圖4），其中果實(shí)中軸的CLas 含量最高，橘絡(luò)次之，2 種組織中的CLas 含量接近均顯著高于其他部位（P<0.05）。染病茶枝柑枝條不同部位的CLas 含量從高到低依次為：果實(shí)中軸（2 770 162.87±544 972.11）>橘絡(luò)（2 721 335.84±528 771.21）>果實(shí)枝條葉片（530 145.21±382 295.05）>果蒂（339 704.79±67 481.43）>新葉（168 229.39±30 035.39 ） > 果實(shí)枝條韌皮部（ 150 789.13±26 500.31）>新梢韌皮部（131 369.40±20 451.80）>老葉（51 952.04±6987.41）。

2.3 黃龍病菌在同一果實(shí)同一橘絡(luò)中的分布

基于染病果實(shí)中軸和橘絡(luò)中具有較高的CLas 含量，本研究進(jìn)一步以易剝離的橘絡(luò)組織為材料，探究CLas 在橘絡(luò)組織中的分布規(guī)律。如圖5 所示，通過(guò)對(duì)同一橘絡(luò)不同長(zhǎng)度片段（每1 cm）中的CLas 含量進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)CLas 在同一條茶枝柑橘絡(luò)中呈不均勻的分布規(guī)律，其中位于1～2 cm 位置的橘絡(luò)片段組織中所含有的CLas 含量（670 933 419.18±133 913 902.91）最高，其次為位于2-3 cm 處的橘絡(luò)組織片段（595 644 317.71±121 200 818.51）。統(tǒng)計(jì)分析表明，位于1～2 cm 和2～3 cm 位置的橘絡(luò)片段組織中的CLas 含量顯著高于位于前端（0～1 cm）和后端（4～5 cm）中的CLas 含量（P<0.05）。

3 討論

本研究中觀察發(fā)現(xiàn)茶枝柑在感染黃龍病后，葉片會(huì)出現(xiàn)斑駁黃化及花葉癥狀，果實(shí)呈現(xiàn)典型“紅鼻子”果，果實(shí)畸形不對(duì)稱，種子敗育等癥狀，這些癥狀與砂糖橘感染黃龍病后的癥狀表現(xiàn)極為相似[8， 21]。由于CLas 在果實(shí)中分布不均勻，采取更為靈敏的qPCR 方法對(duì)柑橘黃龍病菌的檢測(cè)和定量分析至關(guān)重要，而本研究中所采取的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特異性好，較普通qPCR 更為靈敏[20]，也被廣泛使用于CLas 的檢測(cè)分析中。本研究通過(guò)分析感染黃龍病的茶枝柑帶果枝條不同部位的CLas 含量，發(fā)現(xiàn)CLas 在茶枝柑枝條各部分分布不均勻，主要富集于果實(shí)及附近部位（庫(kù)器官），這一結(jié)果與其他品種[7-10， 12]的研究結(jié)果類似，本研究中果實(shí)中軸的CLas 含量最高，而作為源器官的老葉部分CLas 則最低。TATINENI 等[16]通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CLas 可通過(guò)篩孔在植株中移動(dòng)，并推測(cè)CLas 在植株體內(nèi)的移動(dòng)方向與營(yíng)養(yǎng)流動(dòng)方向一致，可以從制造營(yíng)養(yǎng)的源器官（如成熟老葉）轉(zhuǎn)向儲(chǔ)存或消耗營(yíng)養(yǎng)的庫(kù)器官（如果實(shí)、新葉、花等），這可以進(jìn)一步解釋眾多研究中CLas 均富集于果實(shí)的原因。大多數(shù)對(duì)柑橘類CLas 分布規(guī)律的研究結(jié)果表明，橘絡(luò)上的病菌濃度最高且顯著高于其他部位[7-8， 12]，而柚類則是果實(shí)中軸的CLas 含量遠(yuǎn)高于其他部位[12]；本研究中則是在茶枝柑果實(shí)中軸上的CLas 含量最高，橘絡(luò)次之，二者差異雖然不顯著，但均顯著高于其他部位，與上述2 個(gè)品種中的CLas 分布規(guī)律有所不同，這可能與果實(shí)品種、成熟度、采樣時(shí)間等因素有關(guān)。

對(duì)CLas 在橘絡(luò)中分布規(guī)律的研究結(jié)果顯示，CLas 主要聚集在橘絡(luò)中部，在靠果蒂處含量最低，與郭亨玉等[7]的研究結(jié)果一致。橘絡(luò)中含有韌皮部和木質(zhì)部共同組成的維管束組織，為果實(shí)運(yùn)輸發(fā)育所需的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且與汁囊即果實(shí)果肉相連，能夠?yàn)镃Las 的生長(zhǎng)提供良好的營(yíng)養(yǎng)條件和場(chǎng)所[13]，推測(cè)由于橘絡(luò)中部恰好對(duì)于果實(shí)膨大部位即汁囊更多，營(yíng)養(yǎng)更豐富，CLas 則能在此處更好地繁殖生長(zhǎng)，因此含量更高。果蒂是植株向整個(gè)果實(shí)輸導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)成分的樞紐，張培等[10]通過(guò)掃描電鏡觀察到感染黃龍病的果實(shí)果柄的韌皮部篩管細(xì)胞雜亂無(wú)章，有大量淀粉堆積，堵塞篩管，推測(cè)篩管堵塞會(huì)阻礙黃龍病菌的移動(dòng)是造成黃龍病菌分布不均勻的原因之一。另外FANG 等[13]通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CLas 在橘絡(luò)的韌皮部細(xì)胞中也呈不均勻分布，有的韌皮部細(xì)胞中充滿CLas，而相鄰韌皮部細(xì)胞則含較少甚至未發(fā)現(xiàn)CLas 的存在，這從解剖學(xué)上進(jìn)一步解釋了CLas在橘絡(luò)中分布不均勻的原因。

綜上所述，CLas 在染病茶枝柑枝條及同一橘絡(luò)均呈不均勻分布，并且CLas 在茶枝柑果實(shí)中軸及橘絡(luò)中的濃度顯著高于其他部位，CLas 在茶枝柑同一條橘絡(luò)1～3 cm 片段含量稍高于其他片段，本研究結(jié)果可為研究CLas 在侵染柑橘后的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也可為今后快速獲得高含量黃龍病菌尋找理想植物材料提供參考依據(jù)。