隗 晗 劉可園 譚展清 伊 寶 李光玉* 崔 凱*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,青島 266109;2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,畜禽營養(yǎng)與飼養(yǎng)全國重點實驗室,北京 100193)

水貂是具有極高經(jīng)濟價值的毛皮動物,其腸道較短,食物在腸道內(nèi)停留時間短,腸道是否健康決定水貂能否健康生長,能否獲得較高生產(chǎn)效率。育成期是水貂生長發(fā)育的重要時期,在炎熱的夏季,水貂飼糧中含有的大量新鮮魚蝦或畜禽副產(chǎn)品,在持續(xù)高溫下極易腐敗變質,加上幼貂腸道和免疫器官發(fā)育不完善[1],所以容易發(fā)生腸道疾病[2],嚴重影響?zhàn)B殖效益。因此,通過營養(yǎng)和免疫調控方式促進幼貂胃腸道發(fā)育和降低腹瀉等疾病是目前推動我國水貂養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關鍵[3]。

益生菌在抑制飼料腐敗[4]、促進動物生長[5]、提高免疫力[6]和調節(jié)腸道健康[7]等方面的顯著效果,使其成為優(yōu)質的飼料添加劑[8]。戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)是一種常見益生菌,在2014年被衛(wèi)生部納入可食用菌種名錄,其能夠分解營養(yǎng)物質,產(chǎn)生多種有機酸[9],因而可提高機體的消化機能,促進營養(yǎng)物質的吸收[10],并能夠黏附于動物腸道上皮細胞上而具有較強的抑菌活性[11]。周建東等[12]發(fā)現(xiàn),飼糧中添加戊糖片球菌能顯著提高雞的體重、平均日增重、粗蛋白質消化率和脾臟指數(shù),降低料重比。Lele等[13]研究表明,奶牛飼糧中添加戊糖片球菌夠促進其生長,提高采食量和產(chǎn)奶量。戊糖片球菌對體外模擬胃腸道環(huán)境具有良好的耐受性,能快速在腸道上皮細胞定植[14],具有良好的抗氧化性[15]。單承杰[16]發(fā)現(xiàn),飼糧中添加戊糖片球菌能通過調節(jié)斑馬魚腸道內(nèi)丁酸含量,提高促炎癥因子的分泌,從而增強斑馬魚的抵抗力,防止有害細菌感染。有研究表明,戊糖片球菌可通過分泌有機酸誘導腫瘤細胞凋亡和降低腫瘤細胞黏附性產(chǎn)生抗腫瘤作用[17-18]。但目前有關戊糖片球菌對水貂胃腸道菌群調控作用的研究報道還相對較少,其促進水貂生長、改善胃腸道功能的機理還有待進一步研究。因此,本試驗將從水貂后腸道中分離的1株戊糖片球菌添加到育成期水貂飼糧中,通過測定水貂的營養(yǎng)物質消化率、血清生化和抗氧化指標,對戊糖片球菌促進育成期水貂營養(yǎng)物質消化和提高抗病能力方面的作用進行研究,為水貂源益生菌添加劑的開發(fā)和使用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雄性短毛黑水貂購自山東省海陽市某水貂養(yǎng)殖有限公司。試驗菌株由水貂后腸道中分離,通過MRS瓊脂培養(yǎng)、生化試驗和16S rRNA基因序列分析,鑒定為戊糖片球菌。該菌株有良好的產(chǎn)酸能力,能迅速進入對數(shù)生長期,在膽鹽質量濃度為0.5%的條件下耐受性高,且存活率高于70%,在人工胃腸液中也有較高的存活率,其發(fā)酵上清液能有效抑制金黃色葡萄球菌ATCC 13311、大腸桿菌ATCC 25922,具有良好的細胞黏附性。

1.2 試驗動物和分組

選取(75±3)日齡健康雄性短毛黑水貂100只,隨機分為5組,每組20個重復,每個重復1只水貂,每只水貂單籠飼養(yǎng)。每天每只水貂在基礎飼糧中添加1 mL不同濃度的新鮮戊糖片球菌菌液并攪拌均勻。5組水貂飼糧中添加的新鮮戊糖片球菌菌液的濃度分別為0(Ⅰ組,作為對照組)、1×107(Ⅱ組)、1×108(Ⅲ組)、1×109(Ⅳ組)和1×1010CFU/mL(Ⅴ組)。預試期7 d,正試期56 d。

1.3 試驗飼糧

基礎飼糧參照NRC(1982)和文獻[19]配制,其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.4 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗于2022年7月15日至2022年9月19日在山東省海陽市某水貂養(yǎng)殖場進行,試驗用水貂已完成犬瘟熱和細小病毒疫苗的接種并埋植褪黑激素。水貂采用雙列棚舍單籠飼養(yǎng),每天05:00和14:00各飼喂1次,保證水貂自由采食和飲水。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 生長性能和糞便評分測定

試驗開始后每隔14 d于07:00空腹稱重,每天記錄給料量和剩料量,計算水貂平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI),并計算料重比(F/G),公式如下:

平均日增重(g/d)=(終末體重-初始
體重)/(試驗天數(shù)×水貂數(shù)量);
平均日采食量(g/d)=(初始料量-剩余料量)/
(試驗天數(shù)×水貂數(shù)量);
料重比=平均日采食量/平均日增重。

飼養(yǎng)試驗正式開始后,每組隨機挑選15只水貂,每日07:00由試驗人員觀察每只試驗水貂的糞便情況,每只水貂糞便評分取14 d的平均值。糞便評分在2～4分為正常值,低于2分屬于糞便干燥,高于4分屬于腹瀉。采用表2所示糞便評分標準進行評分。

表2 糞便評分標準

1.5.2 消化試驗

正試期結束前3天時,每組隨機挑選8只水貂,采用全收糞法進行消化試驗,為期3 d,其他日常飼養(yǎng)管理程序不變。試驗期間每日采集飼糧樣品,充分混合,檢測營養(yǎng)物質含量;每日準確稱量給料量和剩料量,計算每日采食量;收集的糞樣稱重后按鮮重的5%加入10%硫酸,65 ℃烘干,準確稱重并記錄,粉碎后過40目篩,備測糞中營養(yǎng)物質含量。干物質含量參照《飼料中水分的測定》(GB/T 6435—2014)測定;粗蛋白質含量參照《飼料中粗蛋白的測定》(GB/T 6432—2018)的凱氏定氮法測定;粗脂肪含量參照《飼料中粗脂肪的測定》(GB/T 6433—2006)測定;鈣含量參照《飼料中鈣的測定》(GB/T 6436—2018)測定;總磷含量參照《飼料中總磷的測定》(GB/T 6437—2018)測定;碳水化合物含量為計算值(碳水化合物含量=干物質含量-粗蛋白質含量-粗脂肪含量-粗灰分含量)。營養(yǎng)物質表觀消化率的計算公式如下:

飼糧中某營養(yǎng)物質表觀消化率(%)=100×(飼糧中
該營養(yǎng)物質含量×采食量-糞中該營養(yǎng)物質含量×
排糞量)/(飼糧中該營養(yǎng)物質含量×采食量)。

1.5.3 血清生化、抗氧化和免疫指標檢測

飼養(yǎng)試驗結束后,每組隨機選取8只水貂通過心臟采集空腹血液10 mL,采集到的血液裝在促凝管中,輕輕混合搖勻,4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min,取上清后置于-20 ℃保存,備測血清生化、抗氧化和免疫指標。

血清白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、葡萄糖(GLU)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量送至南京建成生物工程研究所檢測;血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)含量及總抗氧化能力(T-AOC)采用酶標儀(INFINITE F-50,上海帝肯貿(mào)易有限公司)測定;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)含量。上述指標檢測所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所,測定方法參照試劑盒說明書。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗結果以“平均值±標準差”表示,數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件中的ANOVA程序進行方差分析,多重比較采用Duncan氏法進行,P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著。

2 結 果

2.1 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂糞便評分的影響

由表3可知,試驗第29～42天和第43～56天,Ⅲ、Ⅳ組水貂的糞便評分顯著低于Ⅰ組(P<0.05);試驗第1～56天,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組水貂的糞便評分顯著低于Ⅰ組(P<0.05)。

表3 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂糞便評分的影響

2.2 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂生長性能的影響

由表4可知,飼糧中添加不同水平戊糖片球菌后水貂的平均日增重和平均日采食量均有不同程度增加。其中,試驗第15～28天,Ⅲ組的平均日采食量顯著高于Ⅰ組(P<0.05);試驗第29～42天,Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組的平均日采食量極顯著高于Ⅰ組(P<0.01);試驗第1～56天,Ⅲ組的平均日增重和平均日采食量均顯著高于Ⅰ組(P<0.05)。飼糧中添加不同水平戊糖片球菌后水貂的各階段體重和料重比差異不顯著(P>0.05)。

表4 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂生長性能的影響

續(xù)表4時間 Time項目 Items組別 GroupsⅠⅡⅢⅣⅤP值P-value第15～28天Days 15 to 28平均日增重 ADG/(g/d)17.75±1.0019.59±1.7019.88±1.2019.54±1.0118.44±1.530.744平均日采食量 ADFI/(g/d)114.96±0.54b117.05±0.83ab118.23±0.76a115.68±0.84b115.49±0.75b0.015料重比 F/G6.99±0.516.95±0.756.38±0.406.20±0.318.73±0.500.773第28天體重 BW at day 28/g1 778.0±38.41 820.1±62.41 814.3±39.11 795.4±38.71 816.9±48.30.961第29～42天 Days 29 to 42平均日增重 ADG/(g/d)15.56±1.3318.39±1.0520.16±1.4717.14±1.2417.49±1.510.175平均日采食量 ADFI/(g/d)112.91±1.38Bb117.27±1.58Aa119.74±1.68Aa117.56±1.33Aa111.80±1.60Bb0.001料重比 F/G 12.99±1.386.76±0.457.40±1.237.48±0.518.19±1.210.866第42天體重 BW at day 42/g1 995.9±41.52 077.6±61.62 096.6±37.92 035.4±43.32 061.8±51.40.697第43～56天 Days 43 to 56平均日增重 ADG/(g/d)21.82±1.8519.32±1.2918.09±1.8321.38±1.4823.40±3.450.360平均日采食量 ADFI/(g/d)109.81±1.45111.09±2.31115.31±2.51112.59±1.58110.51±1.7110.282料重比 F/G16.22±1.6014.48±1.7914.17±1.8313.99±0.9515.12±1.170.832第56天體重 BW at day 56/g2 234.9±56.22 359.8±52.22 383.8±49.32 291.2±51.12 305.4±63.30.441第1～56天 Days 1 to 56平均日增重 ADG/(g/d)17.20±0.95b19.41±0.99ab20.02±0.81a18.45±0.63ab18.02±0.63ab0.045平均日采食量 ADFI/(g/d)111.86±0.90b114.28±1.44ab116.74±1.21a114.00±0.77ab112.44±1.08b0.019料重比 F/G6.98±0.486.21±0.406.00±0.236.31±0.236.37±0.200.275

2.3 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂營養(yǎng)物質表觀消化率的影響

由表5可知,各組之間干物質、粗蛋白質、粗脂肪和碳水化合物的表觀消化率均差異不顯著(P>0.05)。

表5 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂營養(yǎng)物質表觀消化率的影響

2.4 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂血清生化指標的影響

由表6可知,飼糧中添加不同水平戊糖片球菌對水貂血清TP、ALB、GLU和TG含量均無顯著影響(P>0.05);Ⅲ組水貂血清CHO含量顯著低于Ⅰ組(P<0.05),與其他組相比差異不顯著(P>0.05);Ⅲ組水貂血清HDL-C含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05),與其他組相比差異不顯著(P>0.05);Ⅲ和Ⅳ組水貂血清LDL-C含量顯著低于Ⅰ組(P<0.05),同時Ⅲ組還顯著低于Ⅴ組(P<0.05)。

2.5 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂血清抗氧化和免疫指標的影響

由表7可知,各組水貂血清GSH-Px、SOD活性和MDA含量無顯著差異(P>0.05);Ⅲ和Ⅳ組水貂血清T-AOC顯著高于Ⅰ組(P<0.05),但與其他2組差異不顯著(P>0.05); Ⅲ、Ⅳ組水貂血清IgM含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05);各試驗組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組)水貂血清IgA含量均顯著高于Ⅰ組(P<0.05);Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組水貂血清IgG含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)。

表7 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂血清抗氧化和免疫指標的影響

3 討 論

3.1 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂糞便的影響

腹瀉是水貂比較容易出現(xiàn)的一種疾病,嚴重影響水貂的健康,進而導致毛皮質量下降,嚴重的還會導致水貂的死亡[20]。每年8—9月份是水貂腹瀉病的高發(fā)期,發(fā)病水貂糞便表現(xiàn)為稀軟狀態(tài),嚴重時還會產(chǎn)生便血癥狀。當腸黏膜屏障被破壞時,腸道上皮通透性增加,毒素、細菌或飼糧相關抗原穿過腸黏膜上皮,導致炎癥、腹瀉等疾病,降低生長性能。其中,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染被認為是導致水貂腹瀉的最重要原因之一[21]。李斐然[22]研究發(fā)現(xiàn),牦牛源戊糖片球菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有良好的抑制作用。在本研究中,飼糧中添加戊糖片球菌能顯著降低水貂糞便評分,改善水貂腸道健康。其原因可能是,飼糧中添加戊糖片球菌可通過改善腸道屏障、促進短鏈脂肪酸產(chǎn)生、調節(jié)腸道菌群組成,從而達到促進腸穩(wěn)態(tài)的作用[23];此外,飼糧中添加戊糖片球菌后可能通過菌群代謝產(chǎn)物間接提高水貂腸道菌群中有益菌的相對豐度,從而降低了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的相對豐度。

3.2 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂生長性能和營養(yǎng)物質表觀消化率的影響

戊糖片球菌能夠提高多種動物的生長性能。劉韶娜等[24]研究表明,飼糧中添加戊糖片球菌368后,試驗組豬的終末體重、平均日采食量和平均日增重均高于對照組。有研究表明,飼糧中添加戊糖片球菌能提高試驗動物對干物質和粗蛋白質的表觀消化率[25-26]。動物飼糧中添加適量的戊糖片球菌能促進動物生長,原因可能是戊糖片球菌在胃腸道內(nèi)分泌的一些代謝產(chǎn)物能夠增強胃腸道的一些消化酶活性,從而提高動物對營養(yǎng)物質的消化利用,并可改善飼糧適口性,進而提高采食量[19]。本研究結果顯示,飼糧中添加適量戊糖片球菌能顯著提高水貂的平均日增重和平均日采食量,這與袁文華[27]在乳鴿上的研究結果一致。

3.3 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂血清生化指標的影響

血清生化指標可作為預測水貂健康的關鍵指數(shù)[28]。血清TP和ALB含量主要反映了機體的營養(yǎng)狀況及蛋白質的代謝水平[29]。血清TP含量高有利于改善機體的代謝水平并促進動物健康發(fā)育,ALB可維持機體滲透壓平衡,其含量可表明肝臟合成蛋白質的能力,因此血清ALB含量是反映動物機體健康狀況的重要指標[30]。血清脂代謝產(chǎn)物的含量能反映畜禽機體對脂肪代謝的總體情況。CHO和TG含量可反映脂肪組織的發(fā)育和沉積能力;HDL-C和LDL-C在肝臟和外周組織之間發(fā)揮運輸CHO的功能,且兩者的運輸方向相反,從而保持機體內(nèi)總膽固醇含量的穩(wěn)定[29]。本試驗中,在基礎飼糧中添加不同水平戊糖片球菌后,水貂血清中TP、ALB含量均有升高趨勢,表明戊糖片球菌能夠維持機體內(nèi)代謝環(huán)境相對穩(wěn)定并提高蛋白質利用率,從而激活機體免疫系統(tǒng),提高免疫性能。與Ⅰ組相比,Ⅲ組水貂血清CHO、LDL-C含量顯著降低,血清HDL-C含量顯著提高,表明每天每只水貂在飼糧中添加1×108CFU戊糖片球菌能夠調節(jié)水貂的脂肪代謝。其原因可能是戊糖片球菌改善了腸道菌群結構,提高了水貂腸道菌群多樣性,并通過抑制腸道炎癥反應、改善腸道屏障功能失調,進而緩解了高脂飲食引發(fā)的肝臟損傷[31]。

3.4 飼糧中添加戊糖片球菌對水貂血清抗氧化和免疫指標的影響

動物機體在正常生理狀態(tài)下體內(nèi)的自由基含量是處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài),動物在受到驚嚇等外界環(huán)境因素影響時,體內(nèi)活性氧含量增加,抗氧化劑含量減少,導致氧化/抗氧化平衡被打破,從而發(fā)生氧化應激。戊糖片球菌是一種天然的抗氧化劑,具有安全、穩(wěn)定、增強機體免疫能力等優(yōu)勢[32]。有研究表明,戊糖片球菌可誘導核因子E2相關因子2(Nrf2)-Kelch樣ECH相關蛋白1(Keap1)抗氧化信號通路,提高肉雞的抗氧化能力[33]。Gong 等[34]研究表明,戊糖片球菌能夠通過產(chǎn)生乳酸降低腸道pH,觸發(fā)腸道酶促抗氧化系統(tǒng),使SOD、GSH-Px活性和T-AOC逐漸提高,從而提高抗氧化能力[35-36]。本試驗中,每天每只水貂在飼糧中添加1×108或1×109CFU戊糖片球菌能夠顯著提高水貂血清T-AOC,與上述研究結果相似。

血清免疫指標能夠反映動物機體的免疫功能,血清免疫球蛋白含量升高時,機體的免疫功能也隨之增強[37]。甄玉國等[38]研究表明,飼糧中添加復合益生菌培養(yǎng)物后,肉仔雞血清中IgG和IgA含量顯著提高。本研究中,飼糧中添加不同水平的戊糖片球菌均能夠提高水貂血清中IgM、IgA和IgG含量,但均隨著添加水平的增加呈先上升后下降的趨勢。其原因可能是戊糖片球菌的代謝產(chǎn)物如有機酸、β-葡聚糖、甘露聚糖、多肽等活性物質能夠激活水貂的免疫系統(tǒng),提高機體的免疫功能,但過多的戊糖片球菌可能會抑制有益菌的生長繁殖,影響腸道健康[39]。

4 結 論

飼糧中添加戊糖片球菌可提高育成期水貂的糞便評分和生長性能,改善血清指標,調節(jié)血脂水平,并提高機體抗氧化能力和免疫功能。在本試驗條件下,育成期水貂飼糧中戊糖片球菌的適宜添加水平為1×108CFU/(d·只)。