黃鄭銘 朱 丹 陳 慧

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常見類型之一，預(yù)后較差，5 年生存率不足20%，尤其是晚期患者5 年生存率僅2%左右[1-2]。尋找精準(zhǔn)可靠、能夠?qū)崟r(shí)預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)成為臨床亟待解決的問(wèn)題。腫瘤免疫逃逸是腫瘤惡性進(jìn)展的重要過(guò)程，其機(jī)制十分復(fù)雜，機(jī)體在清除腫瘤細(xì)胞時(shí)，也會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原性進(jìn)行重塑，從而改變免疫效應(yīng)細(xì)胞的監(jiān)視作用[3]。CD8+T 細(xì)胞是機(jī)體關(guān)鍵的腫瘤細(xì)胞毒T 細(xì)胞，其細(xì)胞表面能夠表達(dá)NK 相關(guān)受體，包括NK 活化性受體（NK activating receptor，NKG2D）及抑制性受體（NK inhibitory receptor，NKG2A），通過(guò)與相應(yīng)配體結(jié)合發(fā)揮作用[4]。癌細(xì)胞表面表達(dá)NKG2D 配體（NKG2D ligand，NKG2DL）能夠與T 細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合從而被清除，或表達(dá)NKG2AL 而發(fā)生免疫逃逸[5]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥輔助治療晚期NSCLC 能夠促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞表面NKG2D 表達(dá)，且與CD8+T 細(xì)胞毒性正相關(guān)[6]。Borst 等[7]指出，CD8+T 細(xì)胞表面NKG2A 是一種晚期免疫檢查點(diǎn)，標(biāo)志著癌細(xì)胞活躍分裂的特異性。因此，推測(cè)CD8+T 細(xì)胞表面NKG2D 與NKG2A 表達(dá)在晚期NSCLC 細(xì)胞免疫逃逸效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討CD8+T 細(xì)胞表面NKG2D 與NKG2A表達(dá)與晚期NSCLC 患者臨床預(yù)后的關(guān)系，以期為晚期患者的治療提供指導(dǎo)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2017 年10 月至2019 年9 月浙江省金華市中心醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科收治的94例晚期NSCLC 患者，設(shè)為病例組，另按照2∶1 的比例選擇與病例組性別、年齡信息匹配的47 名健康體檢者為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)（審批號(hào)：2022820101）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）制定的NSCLC 臨床診治指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，且臨床分期TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期；（2）首診患者，且經(jīng)活檢證實(shí)為晚期NSCLC；（3）年齡18～80 歲；（4）東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評(píng)分0～3 分；（5）預(yù)計(jì)生存期3 個(gè)月以上；（6）至少有1 個(gè)可測(cè)量或可評(píng)估病灶；（7）接受外周血CD8+T 細(xì)胞表面NK 相關(guān)受體檢測(cè)；（8）簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）既往接受放化療、靶向治療者；（2）伴其他部位原發(fā)性腫瘤；（3）無(wú)法明確病理類型者；（4）合并HIV、肝炎病毒感染且處于活動(dòng)期者；（5）合并嚴(yán)重內(nèi)科疾病者；（6）近3 個(gè)月服用免疫抑制劑或激素類藥物者；（7）合并自身免疫性疾病者；（8）處于妊娠期或哺乳期；（9）有精神病史、器官移植病史者。

2 方 法

2.1 外周血中CD8+T 細(xì)胞表面NK 相關(guān)受體檢測(cè)病例組患者確診后治療前，對(duì)照組在體檢時(shí)，用含EDTA 抗凝劑的真空管采集空腹靜脈血4 mL，搖勻備用。將20 μL 熒光標(biāo)記單克隆抗體（CD3-PE-Cy7/CD8-Percp/NKG2D-APC、CD3-PE-Cy7/CD8-Percp/NKG2A-PE，抗體均購(gòu)自美國(guó)BD 公司，CD3-PE-Cy7批號(hào)3410991；CD8-Percp 批號(hào)347314；NKG2DAPC 批號(hào)562064；NKG2A-PE 批號(hào)568953）加入EP管中，另設(shè)同型對(duì)照；各EP 管加入待測(cè)抗凝全血100 μL 混勻，避光孵育20 min，加入1000 μL 紅細(xì)胞裂解液繼續(xù)孵育10 min，離心取沉淀，PBS 重懸2次，最終用1%多聚甲醛重懸為200 μL，于BD FACSAria Ⅲ型流式細(xì)胞儀器上檢測(cè)，用FlowJo7.6軟件分析，以CD3 設(shè)門分選CD8+T 細(xì)胞亞群，最終分析CD3+CD8+T 細(xì)胞表面NKG2D+CD8+及NKG2A+CD8+細(xì)胞比率。

2.2 病歷資料收集 調(diào)取病例組患者入院后病歷資料，包括性別、年齡、有無(wú)吸煙史，病理類型、組織學(xué)分級(jí)、ECOG 評(píng)分[9]、TNM 分期及T 分期、N 分期、治療方案（一線化療或靶向治療）。

2.3 隨 訪 采用電話或調(diào)取門診病歷的方法進(jìn)行為期3 年的隨訪，確診第1 年隨訪頻率3 個(gè)月1 次，之后半年隨訪1 次，以患者死亡或隨訪時(shí)間（3 年）截止為終點(diǎn)事件。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0 處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較行LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示并行χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法分析NKG2D、NKG2A 表達(dá)與總生存期的關(guān)系，以COX 風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行預(yù)后生存單因素和多因素分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 對(duì)照組與病例組一般資料比較 病例組與對(duì)照組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 對(duì)照組與病例組一般資料比較

3.2 對(duì)照組與病例組外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達(dá)比較 病例組外周血NKG2D+CD8+比率低于對(duì)照組，NKG2A+CD8+比率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 對(duì)照組與病例組外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達(dá)比較（%，±s）

表2 對(duì)照組與病例組外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達(dá)比較（%，±s）

注：對(duì)照組為健康體檢者；病例組為晚期非小細(xì)胞肺癌患者；NKG2D+CD8+ 為CD8+T 細(xì)胞表面NK 活化性受體；NKG2A+CD8+ 為CD8+細(xì)胞表面抑制性受體

組別對(duì)照組病例組t 值P 值例數(shù)47 94 NKG2D+CD8+95.30±2.02 83.19±3.15 21.813＜0.001 NKG2A+CD8+2.86±0.35 6.42±1.17 20.376＜0.001

3.3 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系分析 與ECOG 0 ～1 分、TNM Ⅲ期者比較，晚期NSCLC ECOG 2～3 分、TNM Ⅳ期患者NKG2D+CD8+比率較低，NKG2A+CD8+比率較高（P＜0.05）。見表3。

表3 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（%，±s）

表3 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（%，±s）

注：NSCLC 為非小細(xì)胞肺癌；NKG2D+CD8+為CD8+T 細(xì)胞表面NK 活化性受體；NKG2A+CD8+為CD8+T 細(xì)胞表面抑制性受體；ECOG 為東部腫瘤協(xié)作組

項(xiàng)目性別例數(shù)NKG2D+CD8+t（F）/P 值0.665/0.508 NKG2A+CD8+t（F）/P 值1.489/0.140男女56 38 84.20±3.29 84.65±3.11 6.56±1.18 6.21±1.02年齡（歲）＜60≥60吸煙史41 53 83.77±3.22 82.74±2.98 1.604/0.112 1.943/0.055 6.25±1.12 6.55±1.04 1.341/0.183 1.736/0.086無(wú)有58 36 83.68±3.24 82.40±3.11 6.27±0.97 6.66±1.19病理類型腺癌鱗癌其他組織學(xué)分級(jí)高分化中分化低分化ECOG 評(píng)分（分）0～1 2～3 T 分期T1～T3 T4 N 分期N0 N1～N3 TNM 分期73 15 6 13 44 37 90 4 59 35 15 79 83.31±3.24 83.20±3.15 81.72±3.11 84.10±3.15 83.29±3.10 82.75±3.02 83.36±3.20 79.27±3.06 83.66±3.24 82.40±3.07 84.14±3.19 83.01±3.02 0.676/0.511 0.976/0.381 2.505/0.014 1.858/0.066 1.317/0.191 5.529/＜0.001 6.37±0.95 6.57±1.10 6.60±1.18 6.39±0.95 6.43±1.12 6.77±1.21 6.38±0.85 7.29±1.38 6.28±1.04 6.65±1.18 6.10±1.07 6.28±1.13 0.365/0.695 0.406/0.667 2.041/0.044 1.585/0.116 1.203/0.232 2.594/0.011ⅢⅣ29 65 85.77±3.26 82.04±2.91 5.99±0.89 6.61±1.14治療方案化療靶向治療1.885/0.063 1.094/0.277 61 33 82.72±2.97 84.05±3.24 6.51±1.12 6.25±1.06

3.4 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 截止隨訪結(jié)束，共有4 例失訪，41 例死亡，49 例存活，死亡率為43.62%（41/94）。以平均值83.19%作為界值分為NKG2D 高表達(dá)組（46 例）和NKG2D 低表達(dá)組（48例），平均值6.42%作為界值分為NKG2A 高表達(dá)組（49 例）和NKG2A 低表達(dá)組（45 例）。Kaplan-Meier生存分析顯示，NKG2D 高表達(dá)與低表達(dá)患者累積生存率分別為71.0%、40.4%，平均生存時(shí)間分別為（23.97±1.65）、（31.17±1.31）個(gè)月，且NKG2D 高表達(dá)患者總生存時(shí)間較低表達(dá)患者延長(zhǎng)（Logrank χ2=9.763，P=0.002）；NKG2A 低表達(dá)與高表達(dá)患者累積生存率分別為66.2%、45.1%，平均生存時(shí)間分別為（30.41±1.25）、（24.80±1.73）個(gè)月，且NKG2A 低表達(dá)患者總生存時(shí)間較高表達(dá)患者延長(zhǎng)（Logrank χ2=5.353，P=0.021），見圖1。

圖1 NKG2D、NKG2A 不同表達(dá)水平患者兩組間累積生存率的Kaplan-Meier 曲線分析

3.5 晚期NSCLC 患者預(yù)后COX 回歸分析 COX多因素分析顯示，N1～N3 分期、TNM Ⅳ期、NKG2D低表達(dá)、NKG2A 高表達(dá)均為影響晚期NSCLC 患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表4。

表4 單因素與多因素COX 分析總生存期的影響因素

4 討 論

肺癌早期缺乏特異性癥狀，使其確診時(shí)多數(shù)已至晚期，尋找可靠生物標(biāo)志物評(píng)估患者病情及預(yù)后有重要臨床意義。T 細(xì)胞在抗腫瘤免疫中扮演重要角色。CD3+反映總體T 細(xì)胞亞群免疫狀態(tài)，CD3+CD4+T細(xì)胞是輔助其他免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)的亞群，其表達(dá)水平降低提示機(jī)體免疫功能下降[10]。CD8+T 細(xì)胞通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)抑制因子發(fā)揮與CD4+T 細(xì)胞相反的免疫學(xué)效應(yīng)[11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T 細(xì)胞表面常表達(dá)一類獨(dú)特的免疫效應(yīng)子群體NKG2D、NKG2A，同時(shí)NKG2A 也表達(dá)于所有NK 細(xì)胞[12]。van Montfoort 等[13]在小鼠腫瘤模型中證實(shí)，接種抗腫瘤疫苗后NKG2A 的阻斷效應(yīng)是通過(guò)CD8+T細(xì)胞進(jìn)行，而非NK 細(xì)胞。Mojic 等[14]在腫瘤免疫治療中發(fā)現(xiàn)，NKG2D 能夠延遲腫瘤生長(zhǎng)，并增加浸潤(rùn)性CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)。由此可知，CD8+T 細(xì)胞表面NK 相關(guān)受體在抗腫瘤免疫效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

本研究顯示，病例組外周血NKG2D+CD8+比率低于對(duì)照組，NKG2A+CD8+比率高于對(duì)照組，說(shuō)明晚期NSCLC 患者外周血中CD8+T 細(xì)胞表面NKG2D 低表達(dá)、NKG2A 高表達(dá)。NKG2D、NKG2A 及其配體均屬于先天性免疫系統(tǒng)的主要成員，能夠觸發(fā)NK、γδ 和CD8+T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[15]。NKG2DL 及NKG2AL在健康細(xì)胞表面少有表達(dá)，但在病毒感染及腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)顯著增加，其與免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合后啟動(dòng)免疫殺傷或抑制效應(yīng)[16]。Osaki 等[17]發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞患者外周血CD8+NKG2D+表達(dá)降低，與本研究結(jié)果一致，說(shuō)明NKG2D 低表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。Ducoin 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，NKG2A 在人結(jié)直腸癌患者中富集，且能夠通過(guò)阻斷NKG2A 克服抗腫瘤免疫反應(yīng)，與本研究結(jié)果相符，說(shuō)明CD8+NKG2A+高表達(dá)參與癌細(xì)胞免疫逃逸。

本研究發(fā)現(xiàn)，晚期NSCLC 患者ECOG 2～3 分、TNM Ⅳ期者NKG2D+CD8+比率較低，NKG2A+CD8+比率較高，提示NKG2D、NKG2A 表達(dá)與患者身體機(jī)能及臨床分期有關(guān)。ECOG 反映患者身體抗腫瘤治療的承受能力，在一定程度上也反映了機(jī)體的免疫功能[19]。隨著病情的進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞免疫逃逸增強(qiáng)，Ⅳ期NSCLC 患者CD8+T 細(xì)胞表面NKG2D 表達(dá)抑制及NKG2A 表達(dá)激活更為明顯，病情更為惡化[20]。本研究經(jīng)Kaplan-Meier 生存分析，NKG2D 高表達(dá)患者總生存時(shí)間較低表達(dá)患者延長(zhǎng)，NKG2A 低表達(dá)患者較高表達(dá)患者延長(zhǎng)，進(jìn)一步COX 分析證實(shí)，NKG2D 低表達(dá)、NKG2A 高表達(dá)均是晚期NSCLC 患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。NKG2D+CD8+低表達(dá)時(shí)其與癌細(xì)胞表面配體結(jié)合產(chǎn)生的活化信號(hào)減弱，對(duì)NK 細(xì)胞毒活性的激活能力不足，而NKG2A+CD8+高表達(dá)進(jìn)一步抑制了NK 細(xì)胞毒活性，二者共同促進(jìn)了癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，不利于免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除癌細(xì)胞，預(yù)后生存期相應(yīng)縮短[21-22]。

綜上所述，晚期NSCLC 患者外周血中CD8+T 細(xì)胞表面NKG2D 低表達(dá)、NKG2A 高表達(dá)，二者表達(dá)情況與患者身體機(jī)能、臨床分期及預(yù)后有關(guān)，可作為評(píng)估晚期NSCLC 患者預(yù)后的可靠參考指標(biāo)。但CD8+T細(xì)胞表面NKG2D 免疫激活與NKG2A 免疫抑制功能在NSCLC 患者中具體如何發(fā)揮作用，仍需要進(jìn)一步深入探討。