溫澤華，楊璨，黃玉榮，于家樂，蘇琦，李曉，金艷，張民

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

中華絨螯蟹屬于甲殼綱，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖物種。長(zhǎng)江流域是中華絨螯蟹的主要產(chǎn)區(qū)，其中以蘇州陽澄湖最為著名，具有極高的商業(yè)價(jià)值[1]。中華絨螯蟹因生長(zhǎng)迅速、風(fēng)味鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而深受消費(fèi)者的歡迎和喜愛，但蟹的貯藏和風(fēng)味保持是影響其流通消費(fèi)的重要因素。目前對(duì)于蟹的研究主要集中在蛋白質(zhì)、肽和殼提取物的抗菌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等[2]，近幾年雖對(duì)中華絨螯蟹營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味研究有所增加[3-5]，但對(duì)其風(fēng)味特性變化機(jī)理、鮮味物質(zhì)鑒定等方面研究相對(duì)較少。

食品的風(fēng)味是由氣味、滋味和三叉神經(jīng)特征相結(jié)合的一種復(fù)雜感覺，它是食品感官特性的主要組成部分之一，影響著消費(fèi)者對(duì)食品的接受程度[6]。鮮味是除酸、甜、苦、咸之外的第五種基本味道，是水產(chǎn)品的主要特征味道，也是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)[7]。鮮味物質(zhì)之間存在協(xié)同作用，可以用作鮮味增強(qiáng)劑以改善產(chǎn)品整體口感和感官品質(zhì)[8]。水產(chǎn)品被認(rèn)為是典型鮮味化合物的良好來源，其鮮味物質(zhì)主要包括游離氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸、肽及其衍生物或反應(yīng)產(chǎn)物等[9-12]。鮮味肽及其衍生物作為一種理想的天然產(chǎn)品，是獲得高質(zhì)量產(chǎn)品不可或缺的元素[13]，目前已從魚肉[12]、貝肉[14]、沙蟹汁[15]中鑒定出鮮味肽。

中華絨螯蟹鮮味物質(zhì)豐富，可以作為開發(fā)優(yōu)質(zhì)鮮味食品添加劑的基礎(chǔ)。因此，本研究以中華絨螯蟹蟹肉為原料，研究不同蛋白酶對(duì)蟹肉的酶解效果，通過風(fēng)味分析、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和鮮味預(yù)測(cè)，獲得新型蟹源鮮味肽，以期為鮮味調(diào)味品的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華絨螯蟹：產(chǎn)自江蘇省蘇州市陽澄湖；木瓜蛋白酶（1×105U/g）、胰蛋白酶（1×105U/g）、復(fù)合風(fēng)味酶（1×105U/g）、中性蛋白酶（2×105U/g）、堿性蛋白酶（1×105U/g）（均為食品級(jí)）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；胃蛋白酶（1.2×103U/g）（食品級(jí)）：廈門墨奕懷食品貿(mào)易有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5'-單磷酸腺苷（5'-adenosine monophosphate，5'-AMP）、5'-單磷酸鳥苷（5'-guanosine monophosphate，5'-GMP）、5'-單磷酸肌苷（5'-inosine monophosphate，5'-IMP）（均為標(biāo)準(zhǔn)品）：壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；乳酸、琥珀酸、細(xì)胞色素C、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、桿菌肽（均為標(biāo)準(zhǔn)品）：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Sephadex G-15 葡聚糖凝膠：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH 計(jì)（DHSJ-3F）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（XMTD-204）：天津市歐諾儀器儀表有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9070MBE）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；離心機(jī)（TDZ5-WS）：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；自動(dòng)凱氏定氮儀（K9840）：山東海能科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀（Synergy HTX）：美國(guó)伯騰儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（MODULYOD-230）、質(zhì)譜儀（Q Exactive）：賽默飛世爾科技公司；高效液相色譜儀（SPD-20A）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS-QP2010 Ultral）：日本島津公司；氨基酸分析儀（Biochrom30+）：英國(guó)Biochrom 公司；定時(shí)數(shù)顯恒流泵（HL-2D）、自動(dòng)部份收集器（BS-100A）：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蟹肉酶解液的制備

將中華絨螯蟹洗凈，在冰浴條件下剝離和收集體肉，加熱變性10 min 后，分別選用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶對(duì)蟹肉進(jìn)行酶解。酶解條件為蟹肉與水質(zhì)量比1 ∶6、酶添加量4 500 U/g、酶底比4.4%、酶解時(shí)間4 h，酶解溫度和pH 值分別根據(jù)各酶的最適條件進(jìn)行設(shè)定。酶解后于100 ℃滅酶10 min，以3 500 r/min 離心20 min 收集上清液，經(jīng)真空冷凍干燥后得到蟹肉酶解物。

1.3.2 水解度的測(cè)定

分別采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測(cè)定樣品酶解液中總氮含量[16]和氨基態(tài)氮含量[17]，水解度為氨基態(tài)氮含量占總氮含量的百分比。

1.3.3 感官評(píng)定

選取經(jīng)過感官培訓(xùn)的10 名感官評(píng)定人員，分別從鮮味、甜味、咸味、酸味、苦味、不良風(fēng)味、蟹類特有腥香氣、濃厚感、整體口感和余后感10 個(gè)方面對(duì)各酶解物樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

稱取適量酶解物置于20 mL 頂空瓶?jī)?nèi)，通過頂空固相微萃取技術(shù)對(duì)樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行吸附收集，通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定和分析。色譜條件：Rtx-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱流量為1.0 mL/min。柱溫箱起始溫度40 ℃，保持3 min 后，以4 ℃/min 升溫到150 ℃保持1 min，再以8 ℃/min 升溫到250 ℃保持6 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊（electron impact，EI）離子源（200 ℃）；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

1.3.5 游離氨基酸的測(cè)定

向酶解物中加入5.0%磺基水楊酸沉淀蛋白，以18 000 r/min 離心30 min 后取上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，采用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。色譜柱：4.6 mm×200 mm；緩沖鹽系統(tǒng)為鈉鹽；緩沖液流速0.2 mL/min；脯氨酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm，其他氨基酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm。

1.3.6 呈味核苷酸的測(cè)定

參考呂麗等[18]的方法并稍作修改。酶解物經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進(jìn)行測(cè)定。HPLC 條件：安捷倫C18 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫30 ℃；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。流動(dòng)相A 為0.02 mol/L 的KH2PO4，pH4.6，流動(dòng)相B 為甲醇，流動(dòng)相A 與流動(dòng)相B 以97 ∶3 的體積比等度洗脫。在相同條件下以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，并繪制各濃度梯度混標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行定量分析。

1.3.7 有機(jī)酸的測(cè)定

參考GB 5009.157—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中有機(jī)酸的測(cè)定》[19]并稍作修改。酶解物經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。HPLC 條件：安捷倫C18 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫40 ℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。流動(dòng)相A 為0.1%磷酸溶液，流動(dòng)相B 為甲醇，流動(dòng)相A 與流動(dòng)相B 以97.5 ∶2.5 的體積比等度洗脫。在相同條件下以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，并繪制各濃度梯度混標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行定量分析。

1.3.8 肽含量的測(cè)定

用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋，取40 μL 各濃度標(biāo)液和160 μL 雙縮脲試劑加入96 微孔板，以等體積蒸餾水代替標(biāo)液作空白對(duì)照，室溫下放置30 min，于540 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以相同方法得到酶解物在540 nm 處的吸光度，計(jì)算得到多肽含量。

1.3.9 肽分子量分布的測(cè)定

參考黃煜燃等[20]的方法并稍作修改。酶解物經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。HPLC 條件：TSK-gel 2000 SWXL 色譜柱（7.8 mm×30 cm）；柱溫30 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。流動(dòng)相為乙腈-水溶液（體積比2 ∶8，添加0.1%三氟乙酸），等度洗脫。在相同條件下以各標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間和相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)作線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和相對(duì)分子質(zhì)量關(guān)系如表2 所示，通過峰面積計(jì)算得到酶解物中不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍肽的含量。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和相對(duì)分子質(zhì)量關(guān)系Table 2 Relationship between retention time and relative molecular weight of standards

1.3.10 肽的超濾分離

將酶解物置于截留分子量10 kDa 的超濾管中，于4 ℃下以5 000 r/min 離心20 min，將透過液置于截留分子量3 kDa 的超濾管中重復(fù)上述操作，分別收集10 kDa 截留液、3 kDa 截留液和3 kDa 透過液，進(jìn)行描述性感官評(píng)價(jià)。

1.3.11 肽的凝膠層析分離

Sephadex G-15 凝膠經(jīng)水溶脹后填裝于1.6 cm×60 cm 的層析柱中，配制成25 mg/mL 超濾組分溶液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后進(jìn)行凝膠層析分離，用超純水進(jìn)行洗脫，流速為0.5 mL/min，上樣量1 mL。收集各洗脫峰，經(jīng)濃縮、冷凍干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.12 肽的結(jié)構(gòu)鑒定

將描述性感官評(píng)價(jià)最好的層析組分經(jīng)脫鹽處理后進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，并通過MaxQuant 1.5.5.1 檢索數(shù)據(jù)庫解析肽序列。色譜分離條件（0.15 mm×150 mm，RP-C18）：流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%），液相梯度設(shè)置為0～50 min，4%～50%B；50～54 min，50%～100%B；54～60 min，100%B。質(zhì)譜條件為檢測(cè)方式：正離子；分析時(shí)長(zhǎng)：60 min；多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比采集方法為MS2 scan 掃描模式，每次全掃描后采集10 個(gè)碎片圖譜。

1.3.13 蟹肉鮮味肽的預(yù)測(cè)篩選

根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，篩選出具有潛在鮮味特性的蟹肉肽，利用BIOPEP-UWM（http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）中的Sensory peptides and amino acids 模塊預(yù)測(cè)肽的潛在鮮味特性[21]，并利用Pep-Draw（http：//pepdraw.com/）[22]和網(wǎng)站http：//www.innovagen.com/proteomics-tools[21]對(duì)所選鮮味肽的物理化學(xué)特性和水溶性進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用IBM SPSS Statistics 22 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，以P<0.05 為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 2017 和Graph Pad Prism 8.0.2 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對(duì)蟹肉酶解物水解度和口感的影響

不同蛋白酶對(duì)蟹肉酶解物水解度的影響見圖1。

圖1 不同蛋白酶對(duì)蟹肉水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on the degree of hydrolysis of crab meat

由圖1 可知，不同蛋白酶對(duì)蟹肉的酶解程度影響差異較大。這是由于不同蛋白酶對(duì)底物的作用位點(diǎn)和水解方式不同，使得酶解的程度和效果有所差異。其中，胰蛋白酶對(duì)中華絨螯蟹蟹肉的酶解效果最好，水解度為（51.99±1.85）%，顯著高于其它蛋白酶酶解的水解度。目前蟹肉蛋白質(zhì)序列并未明確，本結(jié)果表明胰蛋白酶的酶解特異性可能使得蟹肉蛋白中大量氨基酸和肽游離出來，因此水解度較高。

酶解是提取風(fēng)味物質(zhì)及其前體的有效方法[23]，酶解物的感官評(píng)價(jià)結(jié)果如圖2 所示。

圖2 不同蛋白酶對(duì)蟹肉酶解物感官評(píng)價(jià)的影響Fig.2 Effect of different proteases on sensory evaluation of crab meat hydrolysates

由圖2 可知，胰蛋白酶酶解物的鮮味、濃厚感、整體口感和蟹類特有腥香氣均最強(qiáng)，苦味較弱。這是由于胰蛋白酶是內(nèi)切酶，能特異性切割精氨酸和賴氨酸羧基端肽鍵[24]，使得酶解液中堿性氨基酸多位于C 末端，因此鮮味增強(qiáng)，苦味較輕。由于胰蛋白酶酶解中華絨螯蟹蟹肉的水解度最高，酶解液的鮮味、濃厚感、整體口感和蟹類特有腥香氣最強(qiáng)，苦味和咸味較弱。因此，選擇胰蛋白酶為酶解中華絨螯蟹蟹肉的最優(yōu)酶。

2.2 蟹肉胰蛋白酶酶解物中的風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果

為解析蟹肉胰蛋白酶酶解物中的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)樣品中肽、游離氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。蟹肉酶解物中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量如表3 所示。

表3 蟹肉酶解物中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量Table 3 Content of volatile flavor compounds in crab meat hydrolysates

由表3 可知，酶解物中共檢出23 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中烴類化合物種類最多，相對(duì)含量占比最高，可能是由于脂肪酸受熱裂解產(chǎn)生大量碳?xì)漕愇镔|(zhì)所致。十七烷被認(rèn)為是使魚類和藻類呈現(xiàn)香氣的重要物質(zhì)，可能是酶解物腥香氣產(chǎn)生的重要來源。反式角鯊烯具有輕微令人愉快的氣味，2，4-二甲基苯甲醛具有溫和清甜的苦杏仁氣味，月桂醇具有弱而持久的油脂氣味，香葉基丙酮具有清甜香、微玫瑰香，苯并噻唑具有似喹啉氣味，吡啶具有魚樣香氣，它們對(duì)酶解物香氣的形成都有一定的貢獻(xiàn)。

雙縮脲法測(cè)定結(jié)果表明蟹肉酶解物中肽含量為（56.51±1.56）%，其分子量分布情況如表4 所示。

表4 酶解物的肽分子量分布Table 4 Peptide molecular weight distribution of hydrolysates

由表4 可知，胰蛋白酶酶解物中大部分是分子量在1 500 Da 以下的肽。多肽的鏈長(zhǎng)及分子量大小直接影響其風(fēng)味特性。有研究發(fā)現(xiàn)海鮮提取物中分子量在1 500 Da 以下的長(zhǎng)肽鏈具有良好的呈鮮特性[25]。因此，肽是蟹肉酶解物中的主要呈鮮物質(zhì)。

游離氨基酸結(jié)果如表5 所示。

表5 蟹肉酶解物中游離氨基酸的含量Table 5 Content of free amino acids in the hydrolysate of crab meat

由表5 可知，17 種氨基酸在蟹肉酶解物中均有檢出，總含量為270.81 mg/g，與前述水解度結(jié)果較為符合。酶解物中精氨酸含量最高，有文獻(xiàn)表明精氨酸在海產(chǎn)品中大量存在，可能是海產(chǎn)品特殊良好風(fēng)味的來源[26]。谷氨酸和天冬氨酸在蟹肉酶解物中含量分別為8.07 mg/g 和3.84 mg/g。酶解物中甜味氨基酸的含量豐富，對(duì)鮮味有增強(qiáng)作用，尤其是丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸。此外，部分含量較低的苦味氨基酸也能增強(qiáng)酶解物的鮮甜味，對(duì)酶解物的風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)。酶解物中所有氨基酸含量均高于其呈味閾值，滋味活性值（taste activity value，TAV）均大于1，說明17 種氨基酸對(duì)酶解物的鮮味都有直接貢獻(xiàn)作用。

核苷酸是重要的呈鮮物質(zhì)，其中5'-AMP、5'-GMP和5'-IMP 是水產(chǎn)品中重要的鮮味成分。蟹肉胰蛋白酶酶解物中呈味核苷酸的含量如表6 所示。

表6 蟹肉酶解物中呈味核苷酸的含量Table 6 Content of flavor nucleotides in crab meat hydrolysates

由表6 可知，5'-GMP、5'-IMP 和5'-AMP 均有檢出，其中5'-IMP 含量最高，說明5'-IMP 是樣品中的主要特征呈味核苷酸。類似的，郭亞男等[27]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖三疣梭子蟹肌肉中IMP 和AMP 含量豐富，劉天天[28]發(fā)現(xiàn)IMP 和GMP 對(duì)沙蟹蟹肉和沙蟹汁鮮味有直接貢獻(xiàn)。酶解物中3 種核苷酸含量均高于其呈味閾值，TAV 均大于1，說明3 種核苷酸對(duì)酶解物的鮮味都有直接貢獻(xiàn)作用，可增強(qiáng)酶解物鮮味。

乳酸、琥珀酸及其鈉鹽是主要的有機(jī)酸鮮味物質(zhì)，在許多水產(chǎn)養(yǎng)殖品種中被檢出，是甲殼類水產(chǎn)品中主要的肌肉代謝產(chǎn)物，能對(duì)產(chǎn)品呈鮮起到輔助作用[29]。Yang 等[30]發(fā)現(xiàn)河豚肉中乳酸是主要的有機(jī)酸鮮味物質(zhì)，使得河豚具有特殊的味覺特性。蟹肉胰蛋白酶酶解物中有機(jī)酸的含量如表7 所示。

表7 蟹肉酶解物中有機(jī)酸的含量Table 7 Organic acid content in crab meat hydrolysates

由表7 可知，乳酸和琥珀酸均有檢出，琥珀酸對(duì)鮮味有主要貢獻(xiàn)作用。酶解物中乳酸和琥珀酸含量豐富且高于呈味閾值，TAV 均大于1，說明乳酸和琥珀酸對(duì)酶解物的鮮味有直接貢獻(xiàn)作用，可增強(qiáng)酶解物鮮味。這與劉天天[28]和司蕊[14]的研究結(jié)果一致。

2.3 蟹肉肽的分離與純化

將蟹肉胰蛋白酶酶解物經(jīng)超濾分離，得到分子量分別為＞10 kDa、3～10 kDa 和＜3 kDa 的超濾組分，3 個(gè)組分的描述性感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表8。

表8 酶解物超濾組分的描述性感官評(píng)價(jià)Table 8 Descriptive sensory evaluation of ultrafiltration components of hydrolysates

由表8 可知，分子量小于3 kDa 的組分鮮味強(qiáng)度更高，甜味也要比分子量大于3 kDa 的組分強(qiáng)，說明主要的鮮味及增鮮物質(zhì)集中在分子量小于3 kDa 組分。因此，選擇分子量3 kDa 以下的各樣品組分進(jìn)行凝膠層析分離。

對(duì)酶解物分子量3 kDa 以下組分進(jìn)行凝膠層析分離，得到5 個(gè)組分，色譜圖如圖3 所示，5 個(gè)層析組分的描述性感官評(píng)價(jià)見表9。

表9 酶解物層析組分的描述性感官評(píng)價(jià)Table 9 Description and sensory evaluation of hydrolysate chromatographic components

由表9 可知，組分3 的鮮味強(qiáng)度更高，說明主要的鮮味及增鮮物質(zhì)集中在組分3 中。因此，選擇組分3 進(jìn)行下一步的氨基酸序列鑒定。

2.4 蟹肉鮮味肽的鑒定與篩選

通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)組分3 中蟹肉鮮味肽進(jìn)行鑒定和解析，得到381 條多肽。氨基酸的組成和排列位置是影響鮮味的重要因素，研究表明谷氨酸和天冬氨酸是鮮味肽最主要的組成氨基酸，丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸作為甜味氨基酸，可以通過與谷氨酸及天冬氨酸協(xié)同作用產(chǎn)生鮮味[25]。鮮味肽一般同時(shí)含有堿性和酸性基團(tuán)，且C 末端是堿性氨基酸時(shí)顯示出更高的鮮味強(qiáng)度[31]，阮仕艷[32]從羅非魚下頜中篩選出了VADLMR、STELFK、DALKKK、FVGLQER、VVLNPVARVE 5 個(gè)肽段。疏水性氨基酸，如亮氨酸、精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的存在有助于多肽鮮味的呈現(xiàn)[32]。據(jù)此，從381 條多肽中篩選出14 條含有谷氨酸或天冬氨酸，同時(shí)堿性基團(tuán)在C 末端且分子量小于1 000 Da 的肽段。這些多肽的序列長(zhǎng)度在8～10 個(gè)氨基酸之間，分子量分布范圍為795.42～981.55 Da，理化性質(zhì)預(yù)測(cè)如表10 所示。

表10 多肽的氨基酸序列及理化性質(zhì)預(yù)測(cè)Table 10 Prediction of amino acid sequence and physicochemical properties of polypeptides

由表10 可知，14 條多肽均具有良好的水溶性。

利用BIOPEP-UWM 對(duì)14 條多肽的潛在鮮味特性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表11 所示。

表11 多肽的氨基酸序列及鮮味特性預(yù)測(cè)Table 11 Prediction of amino acid sequences and flavor characteristics of polypeptides

由表11 可知，鑒定篩選出的14 條多肽中，AGFAGDDAPR 可在BIOPEP-UWM 數(shù)據(jù)庫中檢索到，它既是鮮味肽、甜味肽又是濃厚感肽，二級(jí)質(zhì)譜解析圖見圖4。m/z 為489.23 的主要碎片離子包括y1（175.119）、y2（272.171 7）、y3（343.208 8）、y4（458.235 8）、y5（573.262 7）、y6（630.284 2）、y7（701.321 3）、y8（848.389 7）、y9（905.411 2）、b2（129.065 9）、b3（276.134 3）。

圖4 AGFAGDDAPR 的二級(jí)質(zhì)譜解析圖Fig.4 Resolution diagram of AGFAGDDAPR secondary mass spectrum

由圖4 可知，除AGFAGDDAPR 外的其它13 條多肽未在BIOPEP-UWM 數(shù)據(jù)庫中檢索到，且多肽中部分片段與BIOPEP-UWM 數(shù)據(jù)庫已報(bào)道的鮮味片段相匹配，說明這些是潛在的新型鮮味肽。鮮味氨基酸片段的出現(xiàn)頻率可以預(yù)測(cè)多肽呈鮮的潛在可能，其中，VDQIGEGGR 和LTEAPLNPK 含有較多的鮮味片段，可能有更強(qiáng)的鮮味。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，胰蛋白酶是酶解中華絨螯蟹蟹肉的最適酶，且所得酶解物具有豐富的鮮味物質(zhì)，多肽含量為（56.51±1.56）%，谷氨酸含量為8.07 mg/g，IMP含量（573.91±21.31）mg/100 g，琥珀酸含量為（1 216.50±68.44）mg/100 g。經(jīng)超濾和凝膠層析分離、質(zhì)譜鑒定、數(shù)據(jù)庫篩選得到14 條具有潛在鮮味特性的小分子肽，其中AGFAGDDAPR 為已報(bào)道的鮮味、甜味和濃厚感肽，其余13 條是未報(bào)道過的，其中VDQIGEGGR 和LTEAPLNPK 含有最多的鮮味片段，可能具有更強(qiáng)的鮮味。綜上，蟹肉中天然存在的特有的鮮美味道，可以作為研究新型海鮮產(chǎn)品的開發(fā)基礎(chǔ)，酶解物產(chǎn)品較蟹肉存儲(chǔ)便利、風(fēng)味易于保持，產(chǎn)品貨架期延長(zhǎng)，有著較為廣闊的市場(chǎng)前景。通過對(duì)其特征性鮮味肽的解析鑒定，為蟹高營(yíng)養(yǎng)和高商業(yè)價(jià)值提供佐證，為新型調(diào)味品的研究和應(yīng)用提供參考。