高帥帥，吳民熙，尹紅梅，喻孟元，杜東霞，劉標(biāo)，陳薇，王震，許麗娟，吳迎奔，李詠梅，趙信林

（1.湖南省微生物研究院，長(zhǎng)沙 410009；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長(zhǎng)沙 410205）

施肥可以顯著提高作物產(chǎn)量，據(jù)統(tǒng)計(jì)，化肥對(duì)主要糧食作物產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率高達(dá)40%～60%[1-2]。氮對(duì)作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量至關(guān)重要，施氮?jiǎng)t成為提高糧食產(chǎn)量的關(guān)鍵手段[3-4]。我國(guó)是世界上最大的水稻生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，需要持續(xù)增加水稻產(chǎn)量來(lái)滿足日益增長(zhǎng)的對(duì)糧食的需求[5]。水稻對(duì)氮的需求量較大，且需要分次施氮才會(huì)有更好的效果[6]。為保證產(chǎn)量，農(nóng)民一般選擇直接將尿素撒在稻田上覆水進(jìn)行追氮。在尿素轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮或進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他形態(tài)無(wú)機(jī)氮后，除部分被作物吸收利用，還有相當(dāng)部分通過(guò)NH3揮發(fā)、徑流、淋溶、硝化-反硝化等途徑損失[7]，這不僅造成肥料資源的浪費(fèi)，還會(huì)誘發(fā)多種環(huán)境污染問(wèn)題[8-9]。研究表明，NH3揮發(fā)是氮素?fù)p失的主要形式之一，NH3揮發(fā)量占施氮量的9%～40%[4，10]，NH3揮發(fā)不僅降低了肥料利用率，還會(huì)對(duì)水體、大氣帶來(lái)不良影響[11]。因此，亟待改善施肥技術(shù)或?qū)ふ移渌緩綔p少NH3揮發(fā)。

關(guān)于稻田NH3揮發(fā)的研究很多，多種方法已經(jīng)被證明可以有效降低NH3揮發(fā)。例如：Chen等[12]通過(guò)多點(diǎn)多年試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)土壤-作物綜合系統(tǒng)管理可以有效降低NH3揮發(fā)并提高產(chǎn)量；Li 等[13]通過(guò)深度分析發(fā)現(xiàn)緩控釋肥、硝化抑制劑、脲酶抑制劑等的使用可顯著降低NH3揮發(fā)并提高產(chǎn)量；有研究表明尿素深施[14]、合理晚施[15]等也可以提高氮肥利用率并降低NH3揮發(fā)。盡管上述措施在一定程度上減少了NH3揮發(fā)損失，提高了氮的利用效率，但其經(jīng)濟(jì)性和勞動(dòng)力投入都限制了其在水稻種植系統(tǒng)中的廣泛應(yīng)用。

微生物在自然界的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中發(fā)揮著不可替代的作用，對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的氮循環(huán)具有重要意義[16-17]，但微生物在降低農(nóng)田氮損失方面的研究報(bào)道較少。微生物同化無(wú)機(jī)氮作用是構(gòu)成土壤氮素保蓄能力的重要組成，Li 等[18-20]研究發(fā)現(xiàn)合理恢復(fù)退化生態(tài)系統(tǒng)的土壤微生物同化無(wú)機(jī)氮作用可有效提高土壤氮素保蓄能力，減少氮素?fù)p失風(fēng)險(xiǎn)。微生物在減少氮損失方面的應(yīng)用還體現(xiàn)在堆肥中，如Guo等[21]通過(guò)在豬糞和麥秸混合堆肥中添加5%的巨大芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)NH3和N2O的排放量減少；Tu等[22]發(fā)現(xiàn)，將由乳酸桿菌等組成的微生物菌劑與生物炭組合添加到豬糞與鋸末混合的堆肥中，可以有效降低NH3和N2O排放量，增加堆肥中的氮素存儲(chǔ)量。然而，目前有關(guān)利用相關(guān)微生物降低稻田氮損失的報(bào)道還不多見(jiàn)。

土-水界面是稻田土壤和上覆水中氮“交流”的必經(jīng)之所，特殊的環(huán)境條件使其與上覆水體和耕層土壤相比，在理化、氮磷化學(xué)計(jì)量、微生物種類方面存在特殊性，土-水界面氮素遷移轉(zhuǎn)化極大地影響著稻田氮素走向[23-24]。NH3揮發(fā)是稻田氮損失的主要途徑，稻田土-水界面降NH3工作的開展有利于降低肥料損失，而生物降NH3[25]具有經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)。本研究擬利用湖南省益陽(yáng)市典型稻田的土-水界面樣本篩選土壤中降NH3效果較好的菌株，并對(duì)其致病性和生化特征等進(jìn)行鑒定，以期利用該菌株有效降低稻田NH3揮發(fā)和提高氮肥利用率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

水稻插秧后，在湖南省益陽(yáng)市某典型稻田（28.373 4°N，112.339 1°E）土-水界面采集土水混合樣本帶回實(shí)驗(yàn)室用于分離降NH3菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

氨選擇性培養(yǎng)基[26-27]：蔗糖50.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.1 g，ZnSO40.5 g，NaCl 2.0 g，1 000 mL H2O，氨水10 mL，自然pH。

營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.4。

分離培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基。

富氨培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.25 g，F(xiàn)eSO40.01 g，（NH4）2SO40.47 g，NaCl 1.0 g，1 000 mL H2O，pH 7.0。培養(yǎng)基滅菌后用無(wú)菌水稀釋4倍使用，經(jīng)測(cè)定銨態(tài)氮濃度為25 mg·L-1。

富硝培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.25 g，F(xiàn)eSO40.01 g，KNO30.72 g，NaCl 1.0 g，1 000 mL H2O，pH 7.0。培養(yǎng)基滅菌后用無(wú)菌水稀釋3 倍使用，經(jīng)測(cè)定硝態(tài)氮濃度為34 mg·L-1。

尿素酚紅培養(yǎng)基：尿素20 g，酚紅1 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.4。

低氨選擇性培養(yǎng)基：100 mL 無(wú)氨選擇性培養(yǎng)基中加入2 mL 500 mg·L-1的氨水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降NH3菌株的富集、分離純化

稱取土壤10 g 置于裝有90 mL 無(wú)菌水的三角瓶中，室溫環(huán)境下于180 r·min-1搖床處理30 min，隨后靜置20 min，吸取10 mL 稀釋液接種至裝有100 mL氨選擇性培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置于30 ℃、180 r·min-1搖床上恒溫培養(yǎng)5 d 后，觀察菌液變化，若菌液渾濁則表明菌株具有降解NH3能力，如此反復(fù)連續(xù)富集7代。

分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基中，利用梯度稀釋平板涂布法分離純化菌液中的單菌落，篩選其中長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落，再采用劃線法多次分離純化，直至獲得完全純的單菌落，將分離出的單菌落接種至試管斜面，4 ℃低溫保存待用。

1.2.2 降NH3菌株的復(fù)篩及NH3降低率的測(cè)定[26-27]

將分離得到的單菌株接種至10 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h后，分別吸取細(xì)菌培養(yǎng)液置于無(wú)菌離心管中，8 000 r·min-1離心2 min后棄上清液，加無(wú)菌水重新懸浮，重復(fù)以上操作3 次，去除菌株生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的氨，最后用無(wú)菌水重懸，制得無(wú)氨種子液。

取上述種子液2 mL 于裝有100 mL 低氨選擇性培養(yǎng)基的250 mL 密封瓶中，再向瓶中放入裝有10 mL 0.005 mol·L-1硫酸吸收液的20 mL 試管，35 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)。對(duì)照組不加種子液，加2 mL無(wú)菌水。于培養(yǎng)的第1、2、3、4 天取樣，采用納氏試劑法測(cè)定NH3的釋放量。

式中：R為NH3釋放量的降低率，%；C0為對(duì)照組硫酸吸收液中銨的濃度，mg·L-1；C為加菌液處理硫酸吸收液中銨的濃度，mg·L-1。

1.3 菌種鑒定

將菌株接種在平板上35 ℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，觀察菌落形態(tài)特征，并結(jié)合《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》進(jìn)行生理生化特征的鑒定[28]。

利用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取菌株的DNA，然后利用通用引物27F 和1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[26]，擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，該過(guò)程進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；72 ℃保持10 min。整個(gè)過(guò)程結(jié)束后，儀器設(shè)置為4 ℃終止保存。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)合格后，切割目的條帶進(jìn)行純化回收，用回收后的產(chǎn)物進(jìn)行Sanger 測(cè)序。Sanger 測(cè)序結(jié)果用軟件ContigExpress 進(jìn)行拼接，并去除兩端不準(zhǔn)的部分。批量對(duì)拼接序列進(jìn)行blastn（最新版本v2.13）比對(duì)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)。其中，核酸數(shù)據(jù)庫(kù)選擇最新版本的nt庫(kù)，通過(guò)與nt庫(kù)進(jìn)行blastn比對(duì)，即可得到同源序列的Accession Number號(hào)及物種鑒定和注釋。將測(cè)得的序列結(jié)果在NCBI 進(jìn)行BLAST 比對(duì)，利用Mega7 軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬類別。

1.4 菌株對(duì)不同氮源的利用能力測(cè)定[27]

將無(wú)氨種子液，以2%的接種量，分別接種于富氨和富硝培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)，分別在第1、2、3、4 天取樣，8 000 r·min-1離心2 min 后測(cè)定上清液中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度。銨態(tài)氮采用納氏試劑法進(jìn)行測(cè)定，硝態(tài)氮參照《水和廢水檢測(cè)分析方法》[29]中的紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 菌株產(chǎn)脲酶情況

產(chǎn)脲酶的細(xì)菌分解尿素后產(chǎn)生的氨使pH 上升，培養(yǎng)基呈堿性，以酚紅為酸堿指示劑，顏色由黃色變?yōu)榧t色。因此，檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)菌株是否產(chǎn)生脲酶采用尿素酚紅培養(yǎng)基[30]。

同時(shí)開展土柱培養(yǎng)試驗(yàn)，設(shè)置添加目標(biāo)菌株和不添加（對(duì)照）處理，在培養(yǎng)的第1、3、5 天取土-水界面泥土作為樣品，利用脲酶試劑盒測(cè)定界面處脲酶活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理，運(yùn)用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析，利用Origin 2019b繪圖，采用Duncan法在0.05的顯著水平上進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 降NH3菌株的篩選

土壤樣品經(jīng)氨選擇性培養(yǎng)基富集、分離純化后，共獲得3 株長(zhǎng)勢(shì)較好的降NH3菌株，分別命名為菌Ⅰ、菌Ⅱ、菌Ⅲ，3 株菌均為細(xì)菌。利用低氨的選擇性培養(yǎng)基對(duì)3 株菌株進(jìn)行復(fù)篩，測(cè)定其NH3降低率，結(jié)果如圖1 所示。在試驗(yàn)持續(xù)期間，菌Ⅰ和菌Ⅲ對(duì)NH3的降低率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，菌Ⅱ在培養(yǎng)的前3 d 的NH3降低率比較平穩(wěn)，第4 天出現(xiàn)上升。在培養(yǎng)的第1、2、3、4 天中，NH3降低率均是菌Ⅱ＞菌Ⅰ＞菌Ⅲ，菌Ⅱ的最高NH3降低率出現(xiàn)在第1 天，為88.60%，顯著高于其他2個(gè)菌株。

圖1 不同菌株的NH3降低率Figure 1 NH3 reduction rates of different bacterial strains

2.2 菌種鑒定

選擇NH3降低率最高的菌Ⅱ進(jìn)行菌種鑒定，將其在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其菌落形態(tài)和顯微觀察特征及革蘭氏染色結(jié)果見(jiàn)圖2。菌Ⅱ的菌落呈圓形，邊緣不整齊，顏色呈微黃色，不透明；革蘭氏染色結(jié)果為陰性，菌體呈桿狀。

圖2 菌Ⅱ的形態(tài)特征及革蘭氏染色情況Figure 2 Morphological characteristics and Gram staining of bacterium Ⅱ

擴(kuò)增菌Ⅱ的16S rDNA 基因序列，得到一個(gè)1 419 bp 的PCR 產(chǎn)物，NCBI BLAST 比對(duì)結(jié)果顯示菌Ⅱ與污水溶桿菌Lysobacter defluvii相似性最高（99.72%以上）。16S rDNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖3），菌Ⅱ與污水溶桿菌Lysobacter defluvii聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)分析、革蘭氏染色結(jié)果以及16S rDNA基因序列分析，菌Ⅱ被鑒定為污水溶桿菌。

圖3 菌Ⅱ的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of bacterium Ⅱ

2.3 菌株對(duì)不同氮源的利用能力

菌Ⅱ降NH3效果見(jiàn)圖4a，加菌處理4 d內(nèi)銨態(tài)氮濃度從25.00 mg·L-1降到9.85 mg·L-1，銨態(tài)氮降低率達(dá)到60.60%，其中第4 天降低率最高。在降低銨態(tài)氮的同時(shí)，培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮濃度從0增加到1.08 mg·L-1。

圖4 菌Ⅱ?qū)Σ煌吹睦媚芰igure 4 Utilization ability of different nitrogen of bacterium Ⅱ

菌Ⅱ降硝能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4b，加菌處理4 d 內(nèi)硝態(tài)氮濃度從34.00 mg·L-1降到3.85 mg·L-1，硝態(tài)氮降低率達(dá)到88.68%，其中第3天降低率最高。在降低硝態(tài)氮的同時(shí)，培養(yǎng)基中的銨態(tài)氮濃度從0 增加到4.37 mg·L-1，隨后降低至0。

2.4 產(chǎn)脲酶性能和溶血性能

將菌Ⅱ接種于尿素酚紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后“十字”菌株周圍未出現(xiàn)紅圈（圖5a），說(shuō)明菌Ⅱ周圍的尿素沒(méi)有被分解，即該菌不產(chǎn)生脲酶。泥柱土-水界面樣品的脲酶活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5b，接種菌Ⅱ后脲酶的活性與對(duì)照相比在第1 天無(wú)顯著差異，但在第3 天和第5天顯著降低。

圖5 菌Ⅱ產(chǎn)脲酶情況Figure 5 Urease production status of bacterium Ⅱ

溶血性是體外對(duì)相關(guān)菌株安全性測(cè)定過(guò)程中需要分析的關(guān)鍵指標(biāo)之一。將菌Ⅱ接種于血平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行溶血性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6，可以看出菌Ⅱ在血平板上生長(zhǎng)良好，菌落附近沒(méi)有出現(xiàn)溶血圈，說(shuō)明菌Ⅱ不具有溶血性。

3 討論

NH3揮發(fā)是稻田氮損失的重要途徑，目前關(guān)于稻田NH3揮發(fā)的研究主要集中在施肥方式[15，31]、肥料用量[32]、氮肥種類[33-34]、土壤改良劑[35]等，但利用微生物降低稻田NH3揮發(fā)的報(bào)道較少，所以篩選土-水界面處的降NH3菌株十分必要。本研究通過(guò)采集湖南省典型稻田土-水界面樣品，進(jìn)一步篩選出的菌Ⅱ降NH3效果較好，NH3降低率最高可達(dá)88.60%，具有一定降低稻田NH3揮發(fā)的潛力。高通量測(cè)序所得菌株基因序列與NCBI 基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析，證明所篩選菌株為溶桿菌屬，進(jìn)一步通過(guò)菌落形態(tài)、顏色以及革蘭氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)所篩選菌株與Yassin等[36]報(bào)道的Lysobacter defluvii十分相似，所以判斷所得菌株為污水溶桿菌。但是，目前有關(guān)污水溶桿菌的研究較少，關(guān)于污水溶桿菌的降NH3或氮轉(zhuǎn)化功能方面的研究更為缺乏。同時(shí)，由于本試驗(yàn)是在室內(nèi)開展的培養(yǎng)試驗(yàn)，該菌株在實(shí)際田間的降NH3效果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

與尹紅梅等[27]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，菌Ⅱ的硝態(tài)氮利用能力和氨氮利用能力較弱，一方面這可能是因?yàn)楸狙芯拷臃N率為2%，低于尹紅梅實(shí)驗(yàn)中的5%，另一方面可能是由于該菌株大量繁殖吸收了部分的氮。富氨培養(yǎng)基中銨態(tài)氮下降，但是硝態(tài)氮沒(méi)有顯著增加，由于本試驗(yàn)是在非厭氧條件下進(jìn)行，好養(yǎng)的溶桿菌不易使反硝化發(fā)生，因此，富氨培養(yǎng)基中銨態(tài)氮降低的一個(gè)原因很可能是所培養(yǎng)菌株將其利用并轉(zhuǎn)化為生物量氮，試驗(yàn)開展期間，隨著菌的生長(zhǎng)，供試培養(yǎng)基逐漸變渾濁，這也在一定程度上反映了菌株確實(shí)有一定的增殖，另一方面，由于是非厭氧條件，部分氨氮也可能通過(guò)NH3揮發(fā)損失。由于硝態(tài)氮相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)試驗(yàn)在有氧條件下進(jìn)行，所以富硝培養(yǎng)基中減少的硝態(tài)氮極有可能是被菌株增殖利用了。

脲酶是尿素分解過(guò)程中的關(guān)鍵酶[37]，尿素酚紅培養(yǎng)基研究表明菌Ⅱ幾乎不產(chǎn)生脲酶[30]，同時(shí)在土-水界面添加該菌株可能還有抑制脲酶產(chǎn)生的作用，這說(shuō)明菌Ⅱ不會(huì)通過(guò)產(chǎn)生脲酶加速尿素產(chǎn)NH3的過(guò)程，滿足稻田土-水界面降NH3的基本要求。溶血性是體外對(duì)相關(guān)菌株安全性測(cè)定過(guò)程中需要分析的關(guān)鍵指標(biāo)之一，本研究發(fā)現(xiàn)菌Ⅱ無(wú)溶血性[38-39]，初步斷定菌Ⅱ的致病性可能較低，但是還需要開展進(jìn)一步試驗(yàn)來(lái)鑒定其是否為致病菌株，從而決定該菌是否可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

4 結(jié)論

（1）通過(guò)對(duì)稻田土-水界面降NH3菌株的篩選，獲得了一株在室內(nèi)試驗(yàn)條件下具有較好降NH3效果的菌株——菌Ⅱ，經(jīng)鑒定該菌株為污水溶桿菌。

（2）菌Ⅱ幾乎不產(chǎn)脲酶，且不具有溶血性，具有降低稻田NH3揮發(fā)的潛力。

（3）菌Ⅱ可能對(duì)氨氮和硝態(tài)氮具有較好的吸收和利用能力，其在稻田降低氮肥損失方面的效果需要進(jìn)一步在田間驗(yàn)證。