張昕，王惠君，薛衛(wèi)杰，王常榮，張長(zhǎng)波，黃永春，劉仲齊

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300191）

鎘是重金屬污染農(nóng)田中最常見(jiàn)的有害元素。在我國(guó)南方鎘污染農(nóng)田中，稻米中的鎘含量極易超過(guò)國(guó)家規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)（0.20 mg·kg-1，GB 2762—2017）[1-2]。鎘在稻米中積累會(huì)顯著降低稻米中谷氨酸含量，從而影響其他氨基酸的合成[3]。水稻是耐鎘能力較強(qiáng)的糧食作物，能將土壤中的鎘富集在根系和莖葉等營(yíng)養(yǎng)器官中，水稻開(kāi)花后，營(yíng)養(yǎng)器官中的鎘隨其他礦質(zhì)元素一起轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)育籽粒中，品種類(lèi)型和灌漿期的氣候條件對(duì)鎘向稻米中的轉(zhuǎn)運(yùn)有顯著影響[3-5]。

在鎘脅迫環(huán)境中，植物體內(nèi)活性氧（ROS）代謝很容易受到干擾，鎘離子通過(guò)擾亂電子傳遞過(guò)程，產(chǎn)生大量的ROS 如超氧陰離子、羥基、H2O2等，進(jìn)而引發(fā)植物氧化損傷[6-7]。葉綠體是合成ROS 的主要細(xì)胞器，葉綠體中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）通過(guò)蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH），將草酰乙酸（OAA）還原為蘋(píng)果酸，蘋(píng)果酸從葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在過(guò)氧化物酶體或線粒體中又被氧化成OAA，同時(shí)產(chǎn)生NADH和ROS[8-9]。蘋(píng)果酸在葉綠體和線粒體等細(xì)胞器間的穿梭和循環(huán)稱為蘋(píng)果酸調(diào)節(jié)（Malate valve），其在維持植物細(xì)胞內(nèi)的能量平衡、pH 和滲透勢(shì)穩(wěn)定、清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量NADH 和ROS等方面發(fā)揮著重要作用[9-10]。外源添加蘋(píng)果酸能顯著提高植物生長(zhǎng)量、增加凈光合速率、減少過(guò)氧化氫積累、增強(qiáng)根系活性等，進(jìn)而減輕鎘的毒害作用[11-13]。由此可見(jiàn)，蘋(píng)果酸在細(xì)胞器間的轉(zhuǎn)運(yùn)和循環(huán)是植物細(xì)胞在逆境條件下調(diào)控能量平衡的重要機(jī)制。

蘋(píng)果酸循環(huán)與氨基酸代謝有密切的關(guān)系。三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的蘋(píng)果酸，可以通過(guò)氧化作用轉(zhuǎn)化成OAA，后者在天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的催化下轉(zhuǎn)化成天冬氨酸，進(jìn)而合成谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸等一系列氨基酸[9，14-15]。這些氨基酸能夠通過(guò)螯合作用降低鎘的生物活性，抑制鎘向稻米中轉(zhuǎn)運(yùn)[4，16]。此外，蘋(píng)果酸還具有補(bǔ)充和平衡三羧酸循環(huán)其他代謝產(chǎn)物的功能，從而可以保證氨基酸和糖代謝對(duì)有機(jī)酸的需求[17-18]。植物的根、莖、葉、花和果實(shí)等多種器官都能通過(guò)蘋(píng)果酸在液泡中的儲(chǔ)存和釋放過(guò)程來(lái)調(diào)控有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸和可溶性糖之間的轉(zhuǎn)化，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞滲透勢(shì)和含氮化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程[18-19]。

隨著植物體內(nèi)鎘含量的增加，根、莖、葉等器官中蘋(píng)果酸和檸檬酸的含量顯著下降[20-21]。外源補(bǔ)充蘋(píng)果酸，能否促進(jìn)蘋(píng)果酸-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程并消除鎘的毒性效應(yīng)，尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究采用根際添加和葉面噴施蘋(píng)果酸的方法，對(duì)蘋(píng)果酸通過(guò)氨基酸代謝緩解鎘毒害的生理機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以湖南大面積種植的秈稻品種中早35 為材料，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所人工氣候室和日光溫室分別進(jìn)行水培試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)。盆栽土壤為來(lái)自廣西壯族自治區(qū)河池市某地的水稻土，其基本理化性質(zhì)為：pH 6.53，有機(jī)質(zhì)含量34.38 g·kg-1，全氮0.164%，全磷0.024%，全鉀1.20%，速效鉀含量84.96 mg·kg-1，速效磷含量17.10 mg·kg-1，陽(yáng)離子交換量7.82 cmol·kg-1，鎘含量0.69 mg·kg-1。

1.2 水培試驗(yàn)方法

選取飽滿的水稻種子，用H2O2溶液進(jìn)行種子表面消毒后，將種子均勻鋪至育苗盤(pán)內(nèi)，放置在人工氣候室中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)。水稻幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，轉(zhuǎn)移至1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)7～10 d。當(dāng)多數(shù)水稻幼苗進(jìn)入三葉一心期后，從中挑選大小均勻的幼苗，轉(zhuǎn)移到去離子水中饑餓處理24 h，再分別轉(zhuǎn)移至含有2.7μmol·L-1Cd的1/10 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中處理7 d，在處理液中分別添加0、0.5、1.0 mmol·L-1和1.5 mmol·L-1蘋(píng)果酸（Cd、Cd+MA1、Cd+MA2 和Cd+MA3），用KOH 和HNO3調(diào)節(jié)pH 為5.5～6.0，每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)15株苗。處理液每隔1 d更換1次。處理結(jié)束后，先將幼苗根系浸泡在5 mmol·L-1CaCl2溶液中20 min，去除表面吸附的離子，再用去離子水漂洗干凈。從各重復(fù)中隨機(jī)取5 株水稻幼苗，用根系掃描儀（EPSON STD 1600，winRhizo system V.4.0b）掃描根系，測(cè)定水稻幼苗的總根長(zhǎng)、表面積和根尖數(shù)。然后將各處理的水稻根系與地上部分開(kāi)，殺青（105°C，15 min）后烘干待用。人工氣候室條件參數(shù)：晝夜時(shí)間為16 h/8 h，晝夜溫度為25 ℃/20 ℃，白天光照105μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度60%。

1.3 盆栽試驗(yàn)方法

水稻種子在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡15 min后用去離子水洗凈，播種于育苗盤(pán)中，根據(jù)苗齡，依次澆灌1/10～1/2的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液，幼苗長(zhǎng)到五葉一心之后，選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的苗，移栽到裝有5 kg 土壤的塑料盆中，每盆9 株。水稻開(kāi)花期進(jìn)行葉面噴施處理：處理1 噴施去離子水（CK）；處理2 噴施2 次5 mmol·L-1蘋(píng)果酸（MA1）；處理3 噴施3 次5 mmol·L-1蘋(píng)果酸（MA2），每個(gè)處理重復(fù)4 次，每次噴施總量為30 mL。水稻成熟期收取水稻籽粒、穗頸、旗葉、節(jié)和莖稈等樣品，參照張雅薈等[22]的方法進(jìn)行樣品前處理后用于測(cè)定鎘含量、必需元素含量和籽粒氨基酸含量等指標(biāo)。

1.4 鎘含量及亞細(xì)胞分布的測(cè)定

水培試驗(yàn)的水稻幼苗根系和地上部以及盆栽試驗(yàn)收獲的水稻各器官，分別烘干后磨成粉。參照Xue等[16]的方法，分別稱取0.5 g 樣品于消解管中，加入7 mL HNO3搖勻，室溫下靜置12 h。將消解管放入電熱消解儀ED54上進(jìn)行消解，溫度110 ℃，加熱2.5 h后，冷卻至室溫，在消煮管內(nèi)加入1 mL H2O2搖勻，110 ℃繼續(xù)加熱1.5 h。將消解管內(nèi)的液體于170 ℃下趕酸至1 mL以內(nèi)。再將消解液稀釋并轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶定容，用ICP-MS（Agilent 7500a，美國(guó)）測(cè)定樣品中鎘含量。

鎘的亞細(xì)胞分布方法主要參照Han 等[23]的方法。從收取的水稻幼苗根系和地上部鮮樣中，分別稱取0.25 g 和0.50 g 置于研缽中，加入提取緩沖液進(jìn)行充分研磨后使之成勻漿液。然后在3 000 r·min-1下離心15 min，沉淀為細(xì)胞壁組分（F1）。取上清液在15 000 r·min-1下離心30 min，沉淀部分為細(xì)胞器組分（F2），上清液為細(xì)胞液組分（F3）。整個(gè)操作過(guò)程在4 ℃下進(jìn)行。提取緩沖液組成為：250 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）和1.0 mmol·L-1二硫赤鮮醇。將收集到的3 種亞細(xì)胞組分分別放在70 ℃電熱板上蒸干至恒質(zhì)量，然后測(cè)定其中的鎘含量。

1.5 酶活性測(cè)定

水稻開(kāi)花期標(biāo)記單穗的開(kāi)花時(shí)間，按照開(kāi)花后5、10、15、20、25、30 d的間隔，從每個(gè)重復(fù)中分別剪取發(fā)育正常的稻穗3 個(gè)，在液氮中研磨成勻漿，從中取0.20 g 左右的勻漿轉(zhuǎn)移到離心管中，加入1.8 mL 緩沖液（pH 7.4，0.05 mol·L-1Tris-HCl）在冰上靜置5 min，然后離心10 min（4 ℃，12 000 r·min-1），上清液即為酶的粗提液。MDH 和AST 的活性用試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測(cè)定。MDH 的活性單位用每小時(shí)催化產(chǎn)生1μmol·L-1NADH 的酶量來(lái)表示，AST 的活性單位用每小時(shí)催化產(chǎn)生1 μmol·L-1丙酮酸的酶量來(lái)表示。

1.6 氨基酸和巰基化合物的測(cè)定

樣品中的游離氨基酸依據(jù)Xue 等[5]的方法提取。將植物樣品曬干磨碎后過(guò)篩，稱取0.20 g 加入2.0 mL去離子水，然后超聲處理30 min，離心（4 ℃，10 000 r·min-1）10 min 后取上清液，殘?jiān)儆?.0 mL 去離子水復(fù)提，將兩次上清液混合均勻過(guò)0.22μmol·L-1濾膜后待測(cè)。

巰基化合物測(cè)定參照Han 等[23]的方法。分別稱取0.20 g 根系和地上部鮮樣，充分研磨后，加入1.8 mL 的提取緩沖液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心（4 ℃，12 000 r·min-1）10 min 后，將上清液輕輕地倒入新的離心管中，加入650 μL HEPES 緩沖液和25 μL TCEP 溶液，混合均勻后，在室溫（25 ℃）下預(yù)培養(yǎng)5 min，再加入20 μL mBBr 溶液，在黑暗條件下（25 ℃）衍生反應(yīng)30 min，用1.0 mol·L-1的MSA 100 μL 終止衍生反應(yīng)，液體用0.22μm 過(guò)濾膜過(guò)濾后，用高效液相色譜儀（Agilent 1200，美國(guó)）測(cè)定谷胱甘肽（GSH）和植物螯合肽（PCs）的含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Excel進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算、統(tǒng)計(jì)與處理、制圖。用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，新復(fù)極差法（Duncan′s）進(jìn)行多重比較、差異顯著性檢驗(yàn)。

轉(zhuǎn)移因子（TF）為相鄰器官間鎘含量的比值[23]，如TFa/b為a器官鎘含量與b器官鎘含量的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果酸對(duì)水稻幼苗根系形態(tài)和鎘積累特性的影響

蘋(píng)果酸能顯著促進(jìn)根系的生長(zhǎng)發(fā)育并抑制鎘的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。在含有2.7 μmol·L-1鎘的培養(yǎng)液中加入0.5～1.5 mmol·L-1的蘋(píng)果酸使水稻幼苗單株平均根尖數(shù)增加43.6%～96.1%（圖1A），總根長(zhǎng)增加31.5～44.3 cm（圖1B）。隨著培養(yǎng)液中蘋(píng)果酸濃度的增加，水稻根系和地上部中的鎘含量顯著下降。根系中的鎘含量主要分布在F1 中，F(xiàn)3、F2 中的鎘含量很低。根系F1中的鎘含量對(duì)蘋(píng)果酸最為敏感，添加0.5、1.0、1.5 mmol·L-1的蘋(píng)果酸使水稻根系F1 中的鎘含量分別下降7.9%、35.9%、45.5%，而根系F3 中鎘含量?jī)H分別下降23.8%、34.8%、39.6%（圖1C）。與根系不同，地上部F1和F3中的鎘含量比較接近，且F3中鎘含量對(duì)蘋(píng)果酸最為敏感。添加0.5、1.0、1.5 mmol·L-1的蘋(píng)果酸使水稻幼苗地上部F3的鎘含量分別下降29.5%、37.1%、39.7%，而F1 的鎘含量?jī)H分別下降6.7%、16.4%、13.9%（圖1D）。

圖1 蘋(píng)果酸對(duì)水稻幼苗根尖數(shù)、根長(zhǎng)以及鎘在根系和地上部亞細(xì)胞分布特征的影響Figure 1 Effects of malic acid on root tips，root length，and the subcellular distribution of Cd in roots and shoots of rice seedlings

2.2 蘋(píng)果酸對(duì)水稻幼苗氨基酸和PCs含量的影響

在培養(yǎng)液中添加不同濃度的蘋(píng)果酸后，水稻幼苗根系和地上部中的大部分氨基酸呈現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)（圖2A 和圖2B）。在無(wú)蘋(píng)果酸的鎘脅迫處理中，幼苗根系和地上部的游離氨基酸總量分別為13.1 g·kg-1和10.1 g·kg-1。添加0.5、1.0 mmol·L-1和1.5 mmol·L-1蘋(píng)果酸后，幼苗根系中的氨基酸總量分別達(dá)到14.9、15.9 g·kg-1和18.2 g·kg-1，地上部的氨基酸總量分別達(dá)到11.9、13.1 g·kg-1和15.2 g·kg-1。在檢測(cè)到的12 種游離氨基酸中，根系中丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和纈氨酸對(duì)蘋(píng)果酸的濃度特別敏感，添加0.5 mmol·L-1的蘋(píng)果酸即能使其含量顯著增加，添加1.5 mmol·L-1蘋(píng)果酸使根系中天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的含量增加92.9%～140.0%，丙氨酸和纈氨酸的含量增加41.7%～54.5%（圖2A）。地上部丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和色氨酸6 種氨基酸對(duì)蘋(píng)果酸的濃度特別敏感，添加1.5 mmol·L-1蘋(píng)果酸使地上部中丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和甘氨酸含量增加18.2%～66.7%，谷氨酸和色氨酸含量增加90.9%～100.0%（圖2B）。添加蘋(píng)果酸后，根系和地上部丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸5 種氨基酸的含量呈顯著增加的趨勢(shì)。

圖2 蘋(píng)果酸對(duì)水稻幼苗根系和地上部氨基酸及巰基化合物的影響Figure 2 Effects of malic acid on amino acids in roots and shoots，and on sulfhydryl compounds in roots and shoots of rice seedlings

植物體內(nèi)的GSH 和PCs 能通過(guò)螯合作用消除鎘的生理毒性。培養(yǎng)液中添加蘋(píng)果酸后，水稻地上部與根系中的GSH 均顯著增加（圖2C），其中1.5 mmol·L-1蘋(píng)果酸使地上部和根系中的GSH 分別增加了68.4%和33.7%。與GSH 含量的變化趨勢(shì)相反，隨著培養(yǎng)液中蘋(píng)果酸濃度的增加，地上部和根系中的PC2、PC3、PC4的含量呈顯著下降的趨勢(shì)（圖2D）。在檢測(cè)到的植物螯合肽中，PC3的含量明顯高于PC2和PC4。添加1.5 mmol·L-1蘋(píng)果酸使地上部和根系的PC3分別減少了84.7%和81.7%。

2.3 噴施蘋(píng)果酸對(duì)水稻各器官鎘含量的影響

在土壤鎘含量為0.69 mg·kg-1的盆栽試驗(yàn)中，中早35 稻米中的鎘含量高達(dá)0.56 mg·kg-1。MA1 和MA2 處理顯著降低了成熟期籽粒和穗軸中的鎘含量，下降幅度為37.5%～55.4%（圖3A）。在蘋(píng)果酸的作用下，植株頂部營(yíng)養(yǎng)器官旗葉、穗頸和穗節(jié)中的鎘含量顯著下降（圖3B）；莖稈基部的鎘含量也呈下降趨勢(shì)，但未達(dá)5%顯著水平。噴施蘋(píng)果酸后，相鄰器官間鎘的TF 也顯著下降（圖3C）。MA1 和MA2 處理使鎘的TF籽粒/穗軸從0.41 分別下降到0.38 和0.32，TF穗軸/穗頸和TF穗頸/穗節(jié)也均顯著低于噴水的對(duì)照處理。穗節(jié)和莖基部壓縮的分蘗節(jié)是營(yíng)養(yǎng)器官中鎘富集能力最強(qiáng)的器官，蘋(píng)果酸對(duì)TF穗節(jié)/莖基也有顯著影響，從1.37下降到1.16和1.14。

圖3 蘋(píng)果酸對(duì)籽粒和穗軸、營(yíng)養(yǎng)器官鎘含量以及相鄰器官間鎘轉(zhuǎn)移因子的影響Figure 3 Effects of malic acid on Cd content in rice and rachis，vegetative organs，and Cd TF between adjacent organs of rice seedlings

2.4 噴施蘋(píng)果酸對(duì)水稻天冬氨酸和谷氨酸合成的影響

在MDH 催化下，細(xì)胞中的蘋(píng)果酸能高效轉(zhuǎn)化成OAA，后者在AST 的催化下轉(zhuǎn)化成天冬氨酸（4 碳氨基酸）；AST 也能夠催化α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成谷氨酸（5碳氨基酸）（圖4A）。水稻開(kāi)花后，稻穗中的MDH 活性顯著增加，開(kāi)花后10 d 達(dá)到最大值；開(kāi)花期噴施蘋(píng)果酸10～30 d 內(nèi)，MA1 和MA2 處理分別使MDH 的活性提高50.8%～74.5%和63.0%～96.8%（圖4B）；灌漿中后期（開(kāi)花后20 d），MDH 活性略有下降，但依然顯著高于對(duì)照處理（圖4B）。稻穗中AST 的活性在開(kāi)花后5 d 就達(dá)到最大值，一直保持到開(kāi)花20 d，此后開(kāi)始顯著下降（圖4C）。在開(kāi)花后5～30 d 的時(shí)間內(nèi)，MA1 和MA2 處理分別使AST 活性提高5.5%～12.1% 和14.6%～22.6%。

圖4 蘋(píng)果酸-天冬氨酸合成路線，蘋(píng)果酸對(duì)MDH和AST活性以及各器官天冬氨酸和谷氨酸含量的影響Figure 4 Route of malate-aspartic acid synthesis，effects of malic acid on the activities of MDH and AST，and content of aspartic acid and glutamate in rice organs

隨著酶活性的增加，籽粒和旗葉等器官中的游離天冬氨酸和谷氨酸含量也顯著增加。MA1 和MA2 處理顯著提高了籽粒、穗軸、旗葉和穗節(jié)中的天冬氨酸含量，對(duì)穗頸和莖基部的天冬氨酸含量無(wú)顯著影響（圖4D）。各器官中游離谷氨酸的含量顯著高于天冬氨酸，MA1 和MA2 處理顯著提高了籽粒、穗軸、旗葉、穗頸和穗節(jié)中的谷氨酸含量，僅對(duì)莖基部的谷氨酸含量無(wú)顯著影響（圖4E）。

3 討論

在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化過(guò)程中，水稻形成了適應(yīng)逆境脅迫的生理調(diào)控機(jī)制。當(dāng)根際環(huán)境中的鎘進(jìn)入水稻根系細(xì)胞后，許多鎘離子被細(xì)胞壁中的大分子所固定，進(jìn)入細(xì)胞膜的鎘會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中封存起來(lái)，以減弱或消除鎘對(duì)細(xì)胞質(zhì)中各種正常生理活動(dòng)的干擾[22，24]。本研究發(fā)現(xiàn)，根際環(huán)境中添加0.5～1.5 mmol·L-1蘋(píng)果酸，既能顯著降低水稻根系細(xì)胞壁和細(xì)胞液中的鎘含量，又能顯著增加根尖數(shù)目、根長(zhǎng)和根表面積。隨著根系細(xì)胞液中鎘含量的顯著下降，轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部的鎘總量大幅度降低（圖1）。這是由于細(xì)胞內(nèi)的小分子有機(jī)酸（如蘋(píng)果酸、檸檬酸等）、氨基酸和PCs 等能與鎘和鉛等重金屬形成螯合物，并清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS等有害物質(zhì)[9，10，13，25]。在鎘脅迫環(huán)境中，外源添加蘋(píng)果酸能顯著提高植物生長(zhǎng)量、增加凈光合速率、減少ROS 積累、增強(qiáng)根系活性等，進(jìn)而減輕鎘的毒害作用[11-12]。不僅如此，水稻開(kāi)花期葉面噴施蘋(píng)果酸，也能顯著降低成熟期稻米和莖葉中的鎘含量（圖3）。這說(shuō)明提高根系和葉片中的蘋(píng)果酸濃度都能有效抑制水稻細(xì)胞對(duì)鎘的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，降低地上部和稻米中的鎘含量。

水稻細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸和天冬氨酸對(duì)鎘離子極為敏感，籽粒和營(yíng)養(yǎng)器官中的谷氨酸和天冬氨酸含量隨著鎘含量的增加而顯著下降[3，5，16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在水稻開(kāi)花期噴施蘋(píng)果酸后稻穗中MDH和AST的活性顯著增加，籽粒和莖葉中游離谷氨酸和天冬氨酸含量顯著上升（圖4），蘋(píng)果酸是三羧酸循環(huán)過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物，它與OAA之間的氧化還原反應(yīng)有助于維持植物細(xì)胞內(nèi)NADH 和NAD+的動(dòng)態(tài)平衡[9-10，15]。在細(xì)胞質(zhì)中，蘋(píng)果酸和α-酮戊二酸通過(guò)氨基轉(zhuǎn)移作用，調(diào)控天冬氨酸和谷氨酸的合成[10，14]。這說(shuō)明噴施蘋(píng)果酸可激發(fā)轉(zhuǎn)氨酶的活性，促進(jìn)蘋(píng)果酸-草酰乙酸-天冬氨酸以及α-酮戊二酸-谷氨酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程。提高根際環(huán)境中的蘋(píng)果酸濃度同樣能顯著提高根系和地上部的天冬氨酸和谷氨酸含量（圖2）。由此可見(jiàn)，在鎘脅迫環(huán)境中提高水稻細(xì)胞的蘋(píng)果酸含量，能顯著促進(jìn)氨基轉(zhuǎn)移過(guò)程，有效消除鎘對(duì)谷氨酸和天冬氨酸合成的抑制作用。

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合而成的三肽化合物（γ-Glu-L-Cys-L-Gly），是PCs 的前體。在植物螯合肽合成酶催化下，GSH可以進(jìn)一步合成結(jié)構(gòu)為[（γ-Glu-L-Cys）2～11-Gly]的PCs，PCs 能與鎘形成無(wú)毒、低分子質(zhì)量的Cd-S-PC 螯合物儲(chǔ)存于液泡中[24，26-27]。水稻細(xì)胞中的鎘含量與PCs 含量呈正相關(guān)關(guān)系[22，24，26]。本研究發(fā)現(xiàn)，提高根際環(huán)境中的蘋(píng)果酸濃度后，水稻根系和地上部組織中的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸含量以及GSH 含量顯著增加，而PC2、PC3、PC4的含量卻隨著蘋(píng)果酸濃度的增加而減小（圖2）。這說(shuō)明蘋(píng)果酸通過(guò)促進(jìn)谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的合成提高了細(xì)胞中的GSH 含量。隨著氨基酸和GSH含量的增加，細(xì)胞液中的鎘含量顯著下降，此時(shí)，細(xì)胞不需要合成更多的PCs 來(lái)消除鎘的毒害，于是PCs的含量表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

氨基酸代謝在植物的抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。天冬氨酸和天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺是細(xì)胞中最重要的氮源供體，與酶活性和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控有密切關(guān)系[7，28-30]。增加谷氨酸濃度能夠提高陽(yáng)離子通道對(duì)鎘的識(shí)別和攔截，抑制有害元素從營(yíng)養(yǎng)器官向籽粒中的轉(zhuǎn)運(yùn)[5，7，31]。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施蘋(píng)果酸后，水稻籽粒、穗軸、穗頸、穗節(jié)和旗葉中的游離谷氨酸含量顯著增加（圖4）。水稻開(kāi)花期噴施檸檬酸、巰基丁二酸等小分子酸能夠激活水稻抗氧化防御體系，提高難溶態(tài)鎘在莖葉組織中的分配比例，調(diào)控水稻體內(nèi)陽(yáng)離子通道的活性，促進(jìn)氨基酸合成和有益元素的轉(zhuǎn)運(yùn)，有效抑制鎘從營(yíng)養(yǎng)器官向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn)[16，23，32]。水稻開(kāi)花期噴施蘋(píng)果酸能夠使鎘從莖基向上部莖葉以及籽粒中轉(zhuǎn)運(yùn)的比率（即TF）大幅度下降，致使水稻各器官的鎘含量自下而上呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（圖3）。由此可見(jiàn)，噴施蘋(píng)果酸在促進(jìn)谷氨酸和天冬氨酸合成的同時(shí)，顯著提高了水稻營(yíng)養(yǎng)器官對(duì)鎘的攔截能力，有效抑制了水稻灌漿期間鎘從旗葉向籽粒中的轉(zhuǎn)運(yùn)，顯著降低籽粒中的鎘含量。

4 結(jié)論

（1）根際環(huán)境中添加0.5～1.5 mmol·L-1的蘋(píng)果酸可顯著降低水稻細(xì)胞壁、細(xì)胞器及細(xì)胞液中鎘的含量。與此同時(shí)，水稻地上部與根系中的谷胱甘肽及其前體谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸含量顯著增加，植物螯合肽含量隨鎘含量的下降而下降。

（2）開(kāi)花期噴施蘋(píng)果酸顯著降低成熟期籽粒和穗軸以及旗葉、穗頸和穗節(jié)中的鎘含量，使鎘從穗軸向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)的比例從0.41 下降到0.32～0.38，相鄰營(yíng)養(yǎng)器官間鎘的轉(zhuǎn)移因子也顯著下降。

（3）噴施蘋(píng)果酸顯著提高灌漿期稻穗中蘋(píng)果酸脫氫酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性，使穗軸、穗莖和旗葉中谷氨酸含量顯著上升，從而抑制了鎘向頂部營(yíng)養(yǎng)器官和籽粒中的轉(zhuǎn)運(yùn)。