崔雪潔，許先梅，許震，錢志剛，榮梅芬，卓茵，杜茂波

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700； 2.蕪湖市諾康生物科技有限公司，安徽蕪湖 241000）

甘舒諾丹靈芝孢子粉葛根丹參黃芪膠囊(以下簡(jiǎn)稱甘舒諾丹膠囊)是由靈芝孢子粉、葛根、丹參和黃芪4味中藥提取物組成的具有輔助保護(hù)化學(xué)性肝損傷或酒精性肝損傷作用的保健食品。方中靈芝補(bǔ)虛強(qiáng)壯、扶正固本，自古以來(lái)就被用于補(bǔ)肝益氣，與靈芝的成分相比，靈芝孢子粉中的腺嘌呤核苷、蛋白質(zhì)以及微量元素等更為豐富[1]。葛根可用作解酒及酒醉不醒的治療[2]。黃芪和丹參早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，是補(bǔ)氣活血治療氣虛血瘀證的典型藥對(duì)，且療效確切，常被用作肝損傷的治療[3]。目前，尚缺乏關(guān)于甘舒諾丹膠囊內(nèi)容物的快速檢測(cè)和成分鑒定方法。為了控制甘舒諾丹膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量，便于將本保健品進(jìn)一步申報(bào)為藥品，筆者采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合自建數(shù)據(jù)庫(kù)的篩查，通過(guò)對(duì)比相對(duì)分子質(zhì)量、碎片離子信息以及裂解規(guī)律等方式，對(duì)甘舒諾丹膠囊中的主要化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒定并對(duì)檢測(cè)到的化合物所屬藥材進(jìn)行了歸屬，以期為后續(xù)臨床應(yīng)用、質(zhì)量控制以及新藥研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters ACQUITY UPLCTM型，美國(guó)沃特世公司。

質(zhì)譜儀：Waters Xevo G2-XS Qtof 型，美國(guó)沃特世公司。

電子天平：AT201型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

離心機(jī)：Legeno Micro 21R型，美國(guó)賽默飛世爾公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

甘舒諾丹膠囊樣品：0.45 g/粒，國(guó)食健注G20110335，批號(hào)為210320，上海奧諾康生物科技有限公司。

乙腈、甲醇：質(zhì)譜純，德國(guó)默克公司。

甲酸：質(zhì)譜純，美國(guó)西格瑪奧德里奇公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

將冷凍的胰臟置于4℃冰箱中解凍，待樣品將要完全解凍時(shí)從頭、體、尾三個(gè)部位剪取約0.5 g左右的胰腺，并用分析天平準(zhǔn)確稱重。按質(zhì)量體積比1∶9的比例加入勻漿介質(zhì)在玻璃勻漿器中勻漿(整個(gè)操作過(guò)程都在冰浴條件下進(jìn)行)。充分勻漿后將勻漿液倒入離心管中3 000 r/min 4℃條件下離心10 min，收集上清并迅速將上清液分裝成若干份貯存于-20℃中，以備進(jìn)行酶活性分析。

1.2 樣品溶液制備

取甘舒諾丹膠囊內(nèi)容物粉末約1 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇20 mL，以60 kHz超聲30 min，冷卻，用超純水補(bǔ)足損失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，離心，取上清液，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾并轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜儀

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱[2.1 mm×100 mm，1.8 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：0.1% (體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，流量為0.3 mL/min，梯度洗脫；梯度洗脫程序：0～1 min時(shí)B體積分?jǐn)?shù)為2%，1～22 mim時(shí)B 體積分?jǐn)?shù)為2%～95%，22～26.4 min 時(shí)B 體積分?jǐn)?shù)為95%，26.4～26.5 min時(shí)B體積分?jǐn)?shù)為95%～2%，26.5～30 min 時(shí)B 體積分?jǐn)?shù)為2%；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：10 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜儀

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正、負(fù)離子掃描模式；掃描范圍：m/z50～1 000；掃描時(shí)間：0.5 s；毛細(xì)管電壓：3 kV；錐孔電壓：30 V；碰撞能量：低能量為6 V，高能量為20～45 V；錐孔氣流量：50 L/h；離子源溫度：100 ℃；去溶劑化溫度：400 ℃；去溶劑氣流量：600 L/h。

1.4 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

膠囊中各單味中藥化學(xué)成分的名稱、化學(xué)式、結(jié)構(gòu)式等均從中藥系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)[4]及文獻(xiàn)中收集，根據(jù)收集的信息建立甘舒諾丹化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，并將其導(dǎo)入沃特世UNIFI 2.0軟件中。將在正負(fù)離子模式下通過(guò)UPLC-Q-TOF/MS 采集得到的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)與UNIFI 2.0 軟件中的自建膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)匹配，正離子模式下的加合離子選擇+H和+Na，負(fù)離子模式下的加合離子選擇-H和+HCOO，選擇離子質(zhì)量偏差在2 mDa范圍內(nèi)的化合物。最后通過(guò)查閱文獻(xiàn)，根據(jù)化合物的典型裂解規(guī)律對(duì)化合物進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證，得到最終結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1 樣品處理

分別選擇甲醇-水(3∶7，體積比，下同)、甲醇-水(1∶1)、甲醇-水(7∶3)、甲醇作為提取溶劑超聲提取樣品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其它三種溶劑相比，以甲醇為提取溶劑時(shí)，樣品溶液的總離子流圖中有效成分峰更多，響應(yīng)值較高，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

為促進(jìn)化合物的電離，提高離子響應(yīng)值，通常需在流動(dòng)相中加入適量的甲酸。分別選擇體積分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.5%甲酸水溶液作為A 相，乙腈作為B 相，考察流動(dòng)相對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，不同體積分?jǐn)?shù)甲酸水溶液對(duì)色譜峰形與響應(yīng)值沒(méi)有顯著影響，最終選擇0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相A 相。

2.2 膠囊化學(xué)成分鑒定結(jié)果

通過(guò)UPLC-Q-TOF/MS 系統(tǒng)對(duì)膠囊水提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，分別采集樣品溶液在正、負(fù)離子模式下的數(shù)據(jù)，得到膠囊水提物的總離子流(TIC)色譜圖，如圖1所示。該方法從膠囊中共鑒定出76種化學(xué)成分，其中醌類化合物有21種，黃酮類化合物有18 種，有機(jī)酸類化合物有11 種，萜類化合物有7種，香豆素類化合物有3種，木脂素類化合物有1種，其它類化合物有15種。對(duì)鑒定出的76個(gè)化合物進(jìn)行藥材歸屬，其中有39 種化合物來(lái)自丹參，18種化合物來(lái)自靈芝，11種化合物來(lái)自黃芪，9種化合物來(lái)自葛根，其中序號(hào)為30 的化合物為葛根、黃芪共有成分。化合物具體信息見表1。

表1 膠囊水提物化學(xué)成分鑒定和藥材歸屬結(jié)果

圖1 膠囊水提物在不同離子模式下的總離子流（TIC）色譜圖

2.3 化合物質(zhì)譜解析

2.3.1 醌類化合物的鑒定

在膠囊水提物中共鑒定出21種醌類化合物，均為丹參酮類化合物，且全部來(lái)源于丹參。丹參酮類化合物表現(xiàn)出抗菌、抗腫瘤、心血管保護(hù)以及抑制神經(jīng)退行性疾病等優(yōu)良的藥理活性。這21 種丹參酮類化合物均具備鄰醌或者對(duì)醌的結(jié)構(gòu)，因此極易發(fā)生還原反應(yīng)，被氧化為酚酸類衍生物。以丹參酮ⅡA 為例，在正離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為295.133 3[M+H]+，該化合物的元素組成為C19H18O3。母離子脫去兩分子的CO 可得m/z239.068 8[C17H19O]+的一對(duì)同分異構(gòu)體。根據(jù)裂解碎片信息并查閱文獻(xiàn)推斷該化合物為丹參酮ⅡA，可能裂解過(guò)程見圖2。

圖2 丹參酮ⅡA的可能裂解過(guò)程

2.3.2 黃酮類化合物的鑒定

在膠囊水提物中共鑒定出18種黃酮類化合物，其中8種來(lái)源于黃芪，7種來(lái)源于葛根，2種來(lái)源于丹參，還有1 種為黃芪和葛根共有的化合物。黃酮苷類化合物第一步通常是脫去糖基形成黃酮苷元，黃酮苷元的裂解規(guī)律則和黃酮類化合物一致，即黃酮母核結(jié)構(gòu)中的C環(huán)的C1位、C3位，C0位、C4位容易發(fā)生RDA裂解反應(yīng)，從而產(chǎn)生A環(huán)和B環(huán)兩種碎片離子。以熊竹素為例，在正離子模式下，化合物20的準(zhǔn)分子離子峰為315.086 3[M+H]+，且其元素組成為C17H14O6。 母離子脫去一分子甲基得m/z300.062 8[C16H12O6]+，然后以斷裂1 和3 鍵的方式斷裂脫去B 環(huán)得m/z167.033 9[C8H7O4]+。根據(jù)裂解碎片信息并查閱文獻(xiàn)推斷該化合物為熊竹素，可能裂解過(guò)程見圖3。

圖3 熊竹素的可能裂解過(guò)程

2.3.3 有機(jī)酸類化合物的鑒定

在膠囊水提物中共鑒定出11 種有機(jī)酸類化合物，其中6種來(lái)源于靈芝，4種來(lái)源于丹參，1種來(lái)源于黃芪。有機(jī)酸類化合物主要包括脂肪族、芳香族和萜類3類化合物，具有抗炎癥、抗氧化、抑制血小板凝集等藥理作用。有機(jī)酸分子是含有羧酸的化合物，所以主要通過(guò)脫去羧基生成其特征離子碎片。以香葉酸A為例，在正離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為313.071 1[M+H]+，該化合物得元素組成為C17H12O6。 母 離 子 脫 去 一 分 子C11H7O4得m/z110.035 2[C6H6O2]+，或者脫去一分子C3H3O2和一分子C6H6O2得m/z133.028 1[C8H5O2]+。根據(jù)裂解碎片信息并查閱文獻(xiàn)推斷該化合物為香葉酸A，可能裂解過(guò)程見圖4。

圖4 香葉酸A的可能裂解過(guò)程

2.3.4 萜類化合物的鑒定

在膠囊水提物中共鑒定出7 種萜類化合物，其中5種來(lái)源于靈芝，2種來(lái)源于丹參。萜類化合物分布極為廣泛，是天然產(chǎn)物中數(shù)量較多的一類化合物。根據(jù)結(jié)構(gòu)中異戊二烯基的數(shù)量可以分為單萜、倍半萜、二萜以及三萜等。以柳杉酚為例，在正離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為301.216 2[M+H]+，該化合物的元素組成為C20H28O2。母離子脫去一分子C2H2O得m/z259.169 0[C18H27O]+。根據(jù)裂解碎片信息并查閱文獻(xiàn)推斷該化合物為柳杉酚，可能裂解過(guò)程見圖5。

圖5 柳杉酚的可能裂解過(guò)程

2.3.5 香豆素類化合物的鑒定

在膠囊水提物中共鑒定出3 種香豆素類化合物，其中2種化合物來(lái)源于丹參，另外1種化合物來(lái)源于葛根。香豆素類化合物是指α-苯并吡喃酮及其衍生物，屬于苯丙素類化合物，根據(jù)香豆素環(huán)上取代基和位置的不同，可分為簡(jiǎn)單香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和其它香豆素。以6，7-二甲氧基香豆素為例，在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰207.065 0[M+H]+，該化合物的元素組成為C11H10O4。母離子脫去一分子C3H2O 得m/z153.053 3[C8H9O3]+。根據(jù)裂解碎片信息并查閱文獻(xiàn)推斷該化合物為6，7-二甲氧基香豆素，可能裂解過(guò)程見圖6。

圖6 6，7-二甲氧基香豆素的可能裂解過(guò)程

3 結(jié)語(yǔ)

甘舒諾丹靈芝孢子粉葛根丹參黃芪膠囊作為一種具有輔助保肝作用的保健食品，其藥效作用源于其主要成分如醌類、黃酮類等化學(xué)成分。采用UPLC-QTOF/MS技術(shù)，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合自建數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量、碎片離子信息以及裂解規(guī)律等方式從甘舒諾丹膠囊中共鑒定出76種成分，其中醌類和黃酮類化合物占比最大，高達(dá)51%。采用UPLC-QTOF/MS 結(jié)合UNIFI 軟件的方法，可以快速鑒別甘舒諾丹膠囊提取物中的化學(xué)成分，但是該方法仍難于有效區(qū)分同分異構(gòu)體，也無(wú)法避免煎煮方式造成的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)改變，有待進(jìn)一步研究。