鄭雨微 于浪潮 夏士杰 何雨曦 呂紅明

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

氧化應(yīng)激(Oxidative stress)是由于動(dòng)物機(jī)體活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生與抗氧化劑的防御之間的失衡,而致使組織器官損害的過程[1]。近年來,多項(xiàng)研究指出氧化應(yīng)激嚴(yán)重影響雞的繁殖性能,破壞仔豬腸道健康并參與奶牛多種營養(yǎng)代謝性疾病(如酮病、脂肪肝、低鈣血癥及乳房炎等)的進(jìn)程[2-4]。另外,氧化應(yīng)激還能引起動(dòng)物下丘腦神經(jīng)元損傷,抑制動(dòng)物采食,降低其生產(chǎn)性能[5]。研究表明,5-羥色胺(5-HT)注射于腦室可激活細(xì)胞內(nèi)的NADPH氧化酶,引起下丘腦ROS含量增加,進(jìn)而促使動(dòng)物采食量下降[6]。由此提示,探究增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力、清除體內(nèi)氧自由基及改善腦組織氧化損傷,可能是提高畜禽采食量及生產(chǎn)性能的一種有效策略。

核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)是一種由7個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的重要核轉(zhuǎn)錄因子,其主要功能參與調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原。研究表明,Nrf2激活后可抑制過多的ROS聚集以平衡細(xì)胞的氧化應(yīng)激,減輕機(jī)體組織氧化損害,改善神經(jīng)毒素導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞元損傷[7-8]。在正常情況下,Nrf2和Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)作為復(fù)合體存在于細(xì)胞質(zhì)中,Keap1是Nrf2的天然抑制劑。然而,氧化刺激或小分子化合物能導(dǎo)致其構(gòu)象變化使Keap1的降解,進(jìn)而使Nrf2積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,激活Nrf2調(diào)控的下游抗氧化基因的表達(dá),如血紅素氧合酶-1(HO-1)[9]。大量研究表明,天然植物化合物可通過激活Nrf2信號(hào)通路緩解多種刺激物導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞損傷[10]。Wei等[11]表明鞣花酸可通過激活Nrf2信號(hào)保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受魚藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。Wruck等[12]發(fā)現(xiàn)木犀草素通過依賴ERK介導(dǎo)的Keap1/Nrf2-ARE途徑保護(hù)大鼠PC12和C6細(xì)胞免受1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenyl-pyridinium,MPP+)誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷。

異鼠李素(Isorhamnetin,ISO)是一種存在于沙棘果實(shí)中的天然黃酮類化合物,具有良好的抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)作用[13]。有研究表明,異鼠李素通過增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力可有效緩解過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)氧化損傷[14]。譚會(huì)潔等[15]揭示異鼠李素通過PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信號(hào)通路可顯著減輕魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)是一種神經(jīng)毒性化合物,經(jīng)常用于體外誘導(dǎo)腦組織氧化損傷的模型[16]。異鼠李素能否通過上調(diào)Keap1/Nrf2抗氧化信號(hào)通路保護(hù)6-OHDA導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞損傷,尚未有相關(guān)研究。因而本研究利用6-OHDA誘導(dǎo)人神經(jīng)元細(xì)胞系(SH-SY5Y)的神經(jīng)毒性,探究異鼠李素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞元氧化損傷的保護(hù)作用,為氧化應(yīng)激引發(fā)的動(dòng)物腦組織損傷的防治提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 試劑和試驗(yàn)材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;GSH檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;異鼠李素(ISO),純度>98%,由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供(成都,中國);6-羥基多巴胺(6-OHDA)和二甲亞砜(DMSO)均由Sigma-Aldrich公司提供。試驗(yàn)所涉及的抗體主要購自Abcam(Cambridge MA USA)公司。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶由賽默飛世爾生物化學(xué)制品(美國)有限公司生產(chǎn)。除非有特別地說明,其他試劑均由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)提供。

1.2 SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(其中含1%谷氨酰胺、3 mmol/L谷氨酰胺、10%胎牛血清、0.1%β-巰基乙醇、100 U/mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素),并放置在濕度適宜含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞活力檢測(cè)

CCK-8試劑盒用于測(cè)定ISO對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。首先,用胰酶消化并在對(duì)數(shù)期生長的SH-SY5Y細(xì)胞離心后,鋪于96孔的培養(yǎng)板中,細(xì)胞計(jì)數(shù)每孔為5×103cells/孔,培養(yǎng)時(shí)間為24 h。然后,利用不同劑量的6-OHDA(50、75、150、300和600 μmol/L)刺激細(xì)胞24 h,以篩選最適合的6-OHDA刺激劑量。其次,在用6-OHDA(300 μmol/L)處理之前1 h,加入5、10和20 μmol/L的ISO,再共同處理24 h。然后,在每個(gè)小孔中添加10 μL CCK-8,放置于培養(yǎng)皿中2 h,最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下的吸光值,檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.4 SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞凋亡檢測(cè)

Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,用于評(píng)估ISO對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。首先,用胰酶消化并在對(duì)數(shù)期生長的SH-SY5Y細(xì)胞離心后,鋪于12孔的培養(yǎng)板中,細(xì)胞計(jì)數(shù)每孔為2.5×105cells/孔,培養(yǎng)時(shí)間為24 h。其次,在用6-OHDA(300 μmol/L)處理之前1 h,加入5、10和20 μmol/L的ISO;再共同處理18 h后,在培養(yǎng)基中加入Hoechst 33342(2 μL/孔)作用15 min后,使用5 mL的固定液,固定10 min。最后,采用無菌的PBS液沖洗3遍后,用不同倍數(shù)的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡程度。

1.5 SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的氧化損傷檢測(cè)

活性氧(ROS)探針檢測(cè)ISO對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的氧化損傷的影響。首先,將SH-SY5Y細(xì)胞接種在96孔板(2×103cells/孔)中24 h。然后,將細(xì)胞置于不同濃度的ISO(5、10和20 μmol/L)中18 h,以及6-OHDA(300 μmol/L)中3 h,將細(xì)胞與50 mmol/L DCFH-DA孵育30 min,用檢測(cè)器分別在激發(fā)和發(fā)射波長485和535 nm處評(píng)估DCF熒光強(qiáng)度,并使用熒光顯微鏡拍照。

1.6 SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的GSH含量檢測(cè)

為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)還原谷胱甘肽(GSH)水平,評(píng)估ISO的抗氧化活性。首先,將SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞在75 mm3培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h,然后將細(xì)胞在不同濃度的ISO處理18 h,隨后接受6-OHDA(300 μmol/L)3 h的刺激。根據(jù)試劑盒說明,利用GSH檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH水平進(jìn)行量化,使用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處吸光度。

1.7 SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞中Keap1的過表達(dá)

用于擴(kuò)增Keap1全編碼區(qū)序列的引物如下:5′-GCT CTA GAG CAT GCA GCC AGA TCC CAG GC-3′(Forword)和5′-CGC GGA TCC GCG TCA ACA GGT ACA GTT CTG CTG G-3′(Reverse)。然后,PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和BamHI酶切后克隆到表達(dá)載體VR1012中。用Viafect轉(zhuǎn)染試劑(Promega)將重組載體VR1012-Keap1轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞系,以實(shí)現(xiàn)Keap1的過量表達(dá)[17]。

1.8 JC-1染色法檢測(cè)SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的線粒體損傷

線粒體膜電位(ΔΨ)由JC-1染色測(cè)定。首先,SH-SY5Y細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)(2.5×105cells/孔);接著用ISO(20 μmol/L)處理細(xì)胞18 h后,再用6-OHDA(300 μmol/L)處理3 h。最后,利用JC-1(10 μg/mL)染料在37 ℃,避光,孵育20 min,再使用熒光顯微鏡拍照、保存。

1.9 Western blot分析SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白、凋亡蛋白水平

收集處理好的細(xì)胞,加入混合蛋白酶抑制劑(10 μmol/L)和蛋白裂解液(RIPA),充分震蕩后置于4 ℃冰箱中,裂解30 min。然后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清。用BCA試劑測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的濃度,根據(jù)上樣量加樣相同數(shù)量的蛋白質(zhì)。隨后,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(Nrf2抗體:A16737、Keap1抗體:ab66620、NQO1抗體:ab80588、HO-1抗體:ab68477、GCLC抗體:ab207777、GCLM抗體:ab126704、Caspase-3抗體:300968、Bax抗體:ab32503、Bcl-2抗體:ab59348、β-actin抗體:60008-1-Ig及Lamin B抗體:SGA1910)和二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗)孵育后?；瘜W(xué)發(fā)光劑ECL,在顯影儀器上顯影,并使用Image Lab 4.0.1軟件分析。

1.10 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)都進(jìn)行獨(dú)立3次重復(fù)。所有數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0(IBM)軟件進(jìn)行分析與統(tǒng)計(jì),結(jié)果用Mean±SD表示。組間比較采用“One-way ANOVA”檢驗(yàn),多重比較實(shí)用LSD方法。并以P<0.05代表差異性顯著,P<0.01代表差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISO改善6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞活性

本研究結(jié)果顯示:不同濃度的6-OHDA(50、75、150、300和600 μmol/L)刺激SH-SY5Y細(xì)胞24 h均能顯著降低細(xì)胞的存活率,其中300 μmol/L細(xì)胞活性接近50%(圖1(a))。因此,300 μmol/L被選為后續(xù)試驗(yàn)的最佳刺激劑量。同時(shí),研究結(jié)果表明了ISO(5、10和20 μmol/L)處理細(xì)胞可有效增加300 μmol/L 6-OHDA降低的細(xì)胞存活率且呈劑量依賴性,其中ISO(20 μmol/L)治療組細(xì)胞存活率高達(dá)70%,而單獨(dú)使用ISO(20 μmol/L)處理組細(xì)胞活性無明顯下降(圖1(b))。此外,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,6-OHDA可誘發(fā)明顯的形態(tài)學(xué)變化,導(dǎo)致細(xì)胞損傷和萎縮、促進(jìn)細(xì)胞死亡,進(jìn)而顯著減少細(xì)胞的數(shù)量,而經(jīng)ISO(5、10和20 μmol/L)處理能不同程度地改善細(xì)胞損傷和增多細(xì)胞數(shù)量(圖1(c))。

2.2 ISO抑制6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

如圖2(a)～(b)所示:與空白組(Control)相比,300 μmol/L的6-OHDA能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染),細(xì)胞凋亡率為40%左右,而經(jīng)ISO(5、10和20 μmol/L)處理后SH-SY5Y凋亡細(xì)胞呈劑量依賴性減少,其中高劑量的凋亡細(xì)胞降低至15%左右。同時(shí),凋亡蛋白的檢測(cè)結(jié)果顯示:6-OHDA(300 μmol/L)可顯著促進(jìn)Bax和Caspase-3的激活,并抑制Bcl-2的表達(dá),而ISO(20 μmol/L)可有效降低Bax和剪切型Caspase-3的表達(dá),并上調(diào)Bcl-2和前體型Caspase-3的蛋白水平(圖2(c)～(g))。

(a)～(b)Hoechst染色及分析(200×);(c)Western blot分析凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-3;(d)～(g)相應(yīng)蛋白的灰度分析。

2.3 ISO減輕6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的氧化應(yīng)激

胞內(nèi)活性氧(ROS)聚集是導(dǎo)致神經(jīng)毒性的重要原因之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明,與空白組(Control)相比,300 μmol/L的6-OHDA可顯著誘導(dǎo)ROS過多產(chǎn)生(P<0.01),而ISO(20 μmol/L)處理后可顯著減少6-OHDA誘導(dǎo)的ROS過度積累(圖3(a)～(b))。此外,結(jié)果還顯示300 μmol/L的6-OHDA能明顯消耗細(xì)胞中GSH的含量(P<0.05),而ISO(20 μmol/L)處理后可顯著減少GSH的消耗(P<0.05)(圖3(c))。

2.4 ISO改善6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的線粒體損傷

線粒體膜電位(MMP,ΔΨm)的下降是細(xì)胞凋亡和線粒體功能障礙的早期階段的一個(gè)標(biāo)志性事件。當(dāng)線粒體膜電位低時(shí),JC-1產(chǎn)生綠色熒光,代表MMP崩潰;反之,JC-1產(chǎn)生紅色熒光。6-OHDA(300 μmol/L)可誘導(dǎo)綠色熒光點(diǎn)的數(shù)量顯著增加,而ISO(20 μmol/L)能明顯減少綠色熒光點(diǎn)的數(shù)量,而增加紅色熒光。這些結(jié)果提示,ISO可有效改善6-OHDA誘發(fā)的線粒體功能紊亂(圖4)。

紅色代表正常細(xì)胞;綠色代表線粒體膜電位損傷細(xì)胞,200×。

2.5 ISO增強(qiáng)SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞中抗氧化蛋白的表達(dá)

鑒于GCLC、GCLM、HO-1和NQO1是細(xì)胞中重要的抗氧化蛋白,因而本試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)ISO對(duì)GCLC、GCLM、HO-1與NQO1表達(dá)水平的影響。首先,不同濃度ISO(2.5、5、10和20 μmol/L)處理SH-SY5Y細(xì)胞18 h。結(jié)果顯示,ISO能顯著促進(jìn)抗氧化蛋白GCLC、GCLM、HO-1和NQO1表達(dá)(P<0.05),其中20 μmol/L的ISO效果最佳(圖5)。

(a)Western blot分析抗氧化蛋白GCLC、GCLM、HO-1和NQO1表達(dá)情況;(b)～(e)相應(yīng)蛋白的灰度分析。

2.6 ISO上調(diào)SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞中Keap1/Nrf2信號(hào)通路

核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對(duì)多種抗氧化酶(如GCLC、GCLM、HO-1和NQO1等)具有關(guān)鍵的調(diào)控作用,而Keap1可負(fù)向調(diào)節(jié)Nrf2。本研究結(jié)果表明,ISO可有效增加Nrf2的核轉(zhuǎn)位,并降低其細(xì)胞質(zhì)水平(圖6(a)～(b))。為明確ISO激活的Nrf2信號(hào)是否直接被Keap1抑制所調(diào)節(jié),進(jìn)行過表達(dá)SH-SY5Y細(xì)胞Keap1。結(jié)果顯示,Keap1的過表達(dá)能顯著降低ISO增強(qiáng)的Nrf2、GCLC、GCLM、HO-1和NQO1蛋白的表達(dá),這表明ISO介導(dǎo)的抗氧化蛋白的表達(dá)與Keap1/Nrf2信號(hào)通路密切相關(guān)(圖6(c)～(g))。

(a)Western blot分析Nrf2漿核蛋白表達(dá)情況;(c)Western blot分析過表達(dá)Keap1(OE-Keap1)后對(duì)Keap1、Nrf2、NQO1及HO-1蛋白表達(dá)影響;(b),(d)～(e)相應(yīng)蛋白的灰度分析。

2.7 ISO逆轉(zhuǎn)6-OHDA降低的Nrf2抗氧化信號(hào)通路

基于上述結(jié)果,本試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了ISO對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞抗氧化蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,300 μmol/L的6-OHDA能顯著降低抗氧化蛋白Nrf2、GCLC、HO-1與NQO1的表達(dá),而ISO(20 μmol/L)處理后可有效恢復(fù)這些蛋白的表達(dá)(圖7)。

(a)Western blot分析Nrf2、GCLC、NQO1及HO-1蛋白表達(dá)影響;(b)～(e)相應(yīng)蛋白的灰度分析。

3 討 論

飼料是畜禽獲取營養(yǎng)的主要來源,但由于儲(chǔ)存與生產(chǎn)過程中易受空氣氧化,引起氧化變性、蛋白質(zhì)破壞,而產(chǎn)生有毒有害的物質(zhì),進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體氧化損傷及采食量降低,嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[18-19]。在飼料中添加適量的抗氧化劑可有效改善在儲(chǔ)存過程中飼料的氧化等問題,并能有效防止飼料氧化造成的畜禽機(jī)體氧化損傷。近年來,研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑還能通過減少下丘腦ROS含量,增加其下丘腦促采食神經(jīng)元的NPY/AgRP蛋白表達(dá),提高動(dòng)物的采食量,繼而增強(qiáng)其生產(chǎn)性能[20]。天然植物化合物因具有來源廣泛、毒副作用小及藥理活性多樣,在神經(jīng)損傷保護(hù)作用的應(yīng)用中備受研究者關(guān)注[21]。ISO作為一種果實(shí)食用性黃酮類小分子化合物,具有良好的抗氧化、抗炎和抗凋亡活性[22]。本研究表明,ISO可通過上調(diào)Nrf2抗氧化通路有效緩解6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及線粒體損傷,進(jìn)而改善神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。

有研究表明,6-羥基多巴胺(6-OHDA)是一種選擇性的兒茶酚胺能神經(jīng)毒素,常用于神經(jīng)元細(xì)胞氧化損傷的模型[23]。6-OHDA可以被多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)器接受,通過抑制線粒體電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈復(fù)合物I和IV,而導(dǎo)致過多的ROS產(chǎn)生[24]。在長壽的非有絲分裂細(xì)胞(如神經(jīng)元)中,氧化應(yīng)激是由線粒體ROS的過度產(chǎn)生或抗氧化防御系統(tǒng)的損害所引起,繼而導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)[25]。此外,腹腔注射脂肪乳劑可導(dǎo)致下丘腦ROS含量增加,促使動(dòng)物采食量下降,而清除ROS含量,則能提高其采食量[26]。本研究表明,6-OHDA可以顯著增加神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)毒性、細(xì)胞凋亡和死亡,引起過多的ROS聚集,而經(jīng)ISO處理后可有效地緩解神經(jīng)元細(xì)胞這些損傷。此外,有研究指出,Bcl-2家族和caspase家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡的途徑中起著極其重要的作用,尤其是線粒體途徑[24]。Bcl-2是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)控者,通過線粒體途徑調(diào)控細(xì)胞色素c的釋放。Caspase-3是級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的凋亡最關(guān)鍵的執(zhí)行者,其激活主要取決于細(xì)胞色素c的釋放[25]。本研究發(fā)現(xiàn)ISO通過抑制Caspase-3的激活和Bax的表達(dá)及上調(diào)Bcl-2蛋白水平,逆轉(zhuǎn)了6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡?？紤]到ROS的積累會(huì)導(dǎo)致線粒體功能紊亂并引發(fā)細(xì)胞凋亡,本研究進(jìn)一步探究了ISO對(duì)ROS的產(chǎn)生和6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中的線粒體功能障礙的影響。本研究結(jié)果表明,6-OHDA顯著促進(jìn)了ROS的產(chǎn)生并加劇了線粒體的損傷,而ISO處理可有效改善ROS產(chǎn)生和線粒體損傷。綜上所述,這些研究表明ISO通過抑制6-OHDA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,進(jìn)而改善其導(dǎo)致神經(jīng)毒性、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。

目前,核轉(zhuǎn)錄因子(Nrf2)是一種與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,在體內(nèi)和體外都能減輕多種氧化劑如MPP+/MPTP、魚藤酮、6-OHDA和過氧化氫的導(dǎo)致的機(jī)體組織細(xì)胞的氧化損傷[26-27]。Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路在保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗內(nèi)源性和外源性應(yīng)激方面起至關(guān)重要的作用,而Keap1與Nrf2結(jié)合存在胞漿中,Nrf2不能表現(xiàn)出生物活性[28]。事實(shí)上,包括天然化合物在內(nèi)的許多生物活性分子都依賴于Nrf2的活化來調(diào)控各種抗氧化酶的表達(dá),調(diào)節(jié)G-谷氨酰半胱氨酸連接酶催化(GCLC)/調(diào)節(jié)(GCLM)亞單位、NAD(P)H:醌氧化還原酶(NQO1)和Ⅱ期解毒酶(血紅素氧合酶,HO-1)的表達(dá)等,以防止氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂和神經(jīng)炎癥[29-30]。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn),不同劑量的ISO(尤其是20 μmol/L)處理SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞18 h能顯著增加抗氧化基因HO-1、GCLM、GCLC和NQO1的表達(dá)。此外,ISO處理能顯著促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位,降低細(xì)胞質(zhì)中Nrf2的比率。然而,過表達(dá)Keap1后能顯著逆轉(zhuǎn)ISO提高的Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)水平,這表明ISO可能通過促進(jìn)Keap1的降解而導(dǎo)致Nrf2入核被激活。此外,據(jù)報(bào)道6-OHDA可通過抑制Nrf2抗氧化信號(hào)通路,以破壞神經(jīng)元細(xì)胞氧化-抗氧化平衡,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷[31]。的確,在研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)6-OHDA能顯著引起Nrf2、GCLC、HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)下降,而經(jīng)20 μmol/L的ISO處理后能顯著恢復(fù)這些抗氧化蛋白的表達(dá)。

4 結(jié) 論

ISO可上調(diào)Keap1/Nrf2及其下游抗氧化相關(guān)蛋白GCLC、GCLM、HO-1和NQO1的表達(dá),進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性、氧化應(yīng)激和線粒體損傷。本研究將有助于對(duì)氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)元損傷的防治提供新策略及新飼料抗氧化添加劑的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ),具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。