王曉衛(wèi),趙佳麗,徐海虹,尚 韜

(1浙江省臨海市中醫(yī)院醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)共同體·浙江 臺(tái)州 317000;2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江省中醫(yī)院·浙江 杭州 310018)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)屬于臨床常見(jiàn)惡性腫瘤,每年發(fā)病率及死亡率逐步上升,目前臨床治療多采用化療,不僅會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性還會(huì)降低患者的依從性[1]。研究證實(shí),中草藥在抗炎及治療腫瘤方面發(fā)揮了重要的作用,其中甘草提取物在治療腫瘤及腸道相關(guān)疾病中療效更為顯著[2-3]。

鐵死亡體現(xiàn)為細(xì)胞產(chǎn)生了鐵依賴(lài)性的ROS聚集現(xiàn)象以及細(xì)胞和亞細(xì)胞層面上的形態(tài)學(xué)變化[4]。有關(guān)鐵死亡的研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡進(jìn)程與體內(nèi)的多種癌癥疾病相關(guān),不僅可以抑制肝癌、前列腺癌、乳腺癌,還能夠減緩其他癌癥的進(jìn)程[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡能夠抑制CRC細(xì)胞增殖[6-7]。基于此,本實(shí)驗(yàn)探討了甘草水提物(Licorice extract,LE)聯(lián)合鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin對(duì)CRC荷瘤裸鼠體內(nèi)鐵死亡的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 甘草水提物(Licorice extract,LE)制備:甘草粉25 g,將其溶于400 mL沸水中,并不斷攪拌使其完全溶解,濾紙過(guò)濾并取濾液離心,離心所得上清液即為L(zhǎng)E,置于冰箱中留待后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。Erastin:上海源葉生物科技有限公司,ACS號(hào):571203-78-6,規(guī)格5 mg, 98%。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 18只SPF級(jí)雌性BALB/c裸鼠,6 周齡,體質(zhì)量(20±2) g,購(gòu)于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005,飼養(yǎng)于無(wú)特定病原微生物體的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中。CACO2細(xì)胞(iCell-h032):賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 xCT Antibody、Ki67 Antibody、Anti-SLC7A11 antibody、Anti-GAPDH antibody、Anti-DPP4 antibody、Anti-NOX 1 antibody:Affnity;山羊抗兔IgG H&L (HRP)預(yù)吸附二抗:Abcam;細(xì)胞丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒:南京建成生物工程研究所有限公司。Nikon Eclipse E100光學(xué)顯微鏡:日本尼康公司;CMaxPlus酶標(biāo)儀:美國(guó)MD公司;低溫高速離心機(jī):美國(guó)賽默飛公司;化學(xué)發(fā)光儀:上海勤翔公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) CACO2細(xì)胞(iCell-h032)在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),并加入10%FBS、1%NEAA、1%青霉素和鏈霉素溶液,環(huán)境條件為37 ℃含5% CO2。

1.5 異種移植瘤動(dòng)物模型制備 模型制備參照博慶麗[10]等報(bào)道,小鼠接種CACO2細(xì)胞(4×106),用于體內(nèi)致瘤。待瘤體積長(zhǎng)到100 mm3開(kāi)始分組給藥。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 造模后小鼠隨機(jī)分組,模型組:灌胃及腹腔注射同體積生理鹽水;LE組:灌胃2 mg/kg LE;LE+Erastin組:灌胃2 mg/kg LE,并腹腔注射30 mg/kg Erastin,每組6 只。給藥4 周。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 腫瘤體積和重量 末次給藥12 h,安樂(lè)死處死小鼠并剝離腫瘤組織,測(cè)量腫瘤體積并稱(chēng)重。

1.7.2 病理學(xué)觀察 取腫瘤組織固定后切片,行常規(guī)石蠟包埋后進(jìn)行HE染色,觀察腫瘤組織病理變化。

1.7.3 腫瘤組織MDA和GSH含量的檢測(cè) ELISA法檢測(cè)腫瘤組織MDA和GSH含量。

1.7.4 腫瘤組織Ki-67和SLC7A11 表達(dá)的免疫組化檢測(cè) 石蠟切片脫蠟至水,加入阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后用一抗(xCT Antibody、Ki67 Antibody)、二抗(山羊抗兔IgG H&L (HRP)預(yù)吸附二抗)孵育,DAB顯色后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。鏡檢觀察,藍(lán)色為細(xì)胞核,抗原陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色至褐色;Image J計(jì)算平均光密度值。

1.7.5 腫瘤組織SLC7A11、DPP4和NOX1蛋白表達(dá)的 Western blot檢測(cè) 制備瘤組織蛋白樣品,進(jìn)行凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜,加入一抗(Anti-SLC7A11 antibody、Anti-GAPDH antibody、Anti-DPP4 antibody、Anti-NOX 1 antibody)、二抗(山羊抗兔IgG H&L (HRP)預(yù)吸附二抗)進(jìn)行封閉劑抗原反應(yīng),孵育結(jié)束后顯影并拍攝圖像。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腫瘤體積、重量比較 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腫瘤體積、重量比較

2.2 各組小鼠腫瘤組織 HE染色結(jié)果 模型組小鼠腫瘤組織無(wú)變化。LE組腫瘤細(xì)胞周?chē)写罅康牧馨图?xì)胞和白細(xì)胞浸潤(rùn),瘤組織結(jié)構(gòu)破壞,部分細(xì)胞固縮成為孤立的細(xì)胞,可見(jiàn)大量壞死細(xì)胞。LE+Erastin組異型細(xì)胞減少,病理?yè)p傷程度更嚴(yán)重。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)改變(HE,×400)

2.3 各組小鼠腫瘤組織MDA含量和GSH活性測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腫瘤組織MDA、GSH比較

2.4 各組小鼠腫瘤組織Ki-67和SLC7A11 表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖2。

注:與模型組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與LE組比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 各組小鼠腫瘤組織Ki-67和SLC7A11 表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(× 400)

與模型組比較,LE 組與LE+Erastin組小鼠腫瘤組織SLC7A11及Ki-67的表達(dá)顯著減弱(P<0.05或P<0.01);與LE組比較,LE+Erastin組小鼠腫瘤組織中SLC7A11的表達(dá)顯著減弱(P<0.01)。

2.5 各組腫瘤組織SLC7A11、DPP4和NOX1蛋白表達(dá)的Western Blot 檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖3。

注:與模型組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與LE組比較,*P<0.05圖3 各組小鼠腫瘤組織SLC7A11、DPP4和NOX1蛋白的表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果比較

與模型組比較,LE組和LE+Erastin組瘤組織DPP4蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05和P<0.01),SLC7A11、NOX1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01);與LE組比較,LE+Erastin組瘤組織中SLC7A11、NOX1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。

3 討論

CRC具有惡性程度高、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn),臨床治療效果不佳且易反復(fù),給患者帶來(lái)嚴(yán)重的心理壓力及身體負(fù)擔(dān),因此尋找安全有效的治療藥物已經(jīng)成為研究的重點(diǎn)。研究表明,甘草及其提取物能夠通過(guò)多基因、多靶點(diǎn)等途徑發(fā)揮抗CRC的作用[11]。甘草屬于豆科植物,最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有清熱解毒、補(bǔ)脾益氣、緩急止痛等功效[12]。徐上云[13]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用甘草酸處理人結(jié)腸癌細(xì)胞后,細(xì)胞的增殖、遷移及相關(guān)信號(hào)通路蛋白均受到抑制,表明甘草提取物具有抗結(jié)直腸癌作用。

裸鼠皮下移植瘤能夠更好地觀測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況、評(píng)估抑瘤效果。本文通過(guò)對(duì)裸鼠皮下注射CRC細(xì)胞建立皮下移植瘤模型。本文研究結(jié)果顯示,LE組和LE+Erastin組小鼠腫瘤體積及瘤重均顯著降低,表明LE能夠顯著抑制腫瘤的增殖,加入鐵死亡誘導(dǎo)劑后表現(xiàn)出進(jìn)一步的抑制腫瘤生長(zhǎng)趨勢(shì),表明鐵死亡可以發(fā)揮抑瘤作用,且LE與Erastin聯(lián)合的效果更顯著。通過(guò)HE染色結(jié)果可見(jiàn),除模型組外,兩給藥組細(xì)胞均表現(xiàn)出炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及結(jié)構(gòu)破壞,其中LE組瘤組織結(jié)構(gòu)破壞,部分細(xì)胞固縮成為孤立的細(xì)胞,壞死細(xì)胞增多;LE+Erastin組異型細(xì)胞減少,病理?yè)p傷程度更嚴(yán)重。由此可見(jiàn)LE及LE聯(lián)合Erastin能夠較大程度的破壞腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu),造成腫瘤細(xì)胞壞死。

Erastin屬于經(jīng)典的鐵死亡誘導(dǎo)劑,能夠通過(guò)抑制System XC-活性,進(jìn)而阻斷細(xì)胞中GSH的合成,降低細(xì)胞的抗氧化能力,導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[4]。MDA的大量產(chǎn)生標(biāo)志著體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)不斷增強(qiáng),提示鐵死亡進(jìn)程正向移動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)中LE組、LE+Erastin組小鼠腫瘤組織中MDA含量升高而GSH含量降低,并且LE+Erastin組相較于LE組趨勢(shì)更明顯,提示兩組細(xì)胞鐵死亡均增強(qiáng)。

Fan Z[14]研究顯示SLC7A11能夠增強(qiáng)System XC-的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,從而減輕細(xì)胞的鐵死亡。Ki-67是惡性腫瘤增殖效率的反映指標(biāo),其高表達(dá)時(shí)也可作為細(xì)胞增殖活躍的標(biāo)志[15]。NOX1是腸黏膜內(nèi)催化氧自由基生成的重要催化酶,其表達(dá)量與腸黏膜氧化應(yīng)激相關(guān)[16]。DPP4與多種底物和蛋白分子相互作用,其含量與鐵死亡呈正相關(guān)[17]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LE 組與LE+Erastin組小鼠腫瘤組織SLC7A11、Ki-67 mRNA及SLC7A11、NOX1蛋白的表達(dá)顯著降低,而DPP4蛋白表達(dá)水平顯著升高;提示,LE可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,阻礙其增殖進(jìn)程。

綜上所述,LE聯(lián)合Erastin能夠促進(jìn)CRC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)發(fā)生鐵死亡進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。