陳麗萍，廉曉麗，蔡子涵，李 倩，歐陽(yáng)天昭，楊毅梅

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院，太原 030000；3.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；4.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

肝吸蟲Clonorchis sinensis是一種食源性人畜共患寄生蟲，人或貓、狗等食入含有活囊蚴的淡水魚、蝦后，在消化液作用下，幼蟲循膽汁逆行至肝膽管發(fā)育為成蟲。以寄生部位上皮增生、結(jié)構(gòu)紊亂及擴(kuò)張為主要病理變化的肝吸蟲病，如沒有正確診斷并及時(shí)治療，可發(fā)展為肝膽慢性炎癥、膽汁性肝硬化甚至肝膽管惡性腫瘤〔1〕。持續(xù)炎癥、肝吸蟲感染等是引起膽管癌的主要誘因，肝膽管惡性腫瘤的預(yù)后差、生存率低〔2〕。由于肝吸蟲早期及低度感染時(shí)無(wú)明顯臨床癥狀，易導(dǎo)致治療延誤，對(duì)宿主造成不良后果。因此，只有早發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療才能減少其對(duì)宿主的實(shí)質(zhì)性損害。

目前，肝吸蟲病的診斷方法主要是糞便或膽汁查蟲卵及血清抗體檢測(cè)。病原檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝吸蟲蟲卵是確診的依據(jù)，但肝吸蟲蟲卵不明顯，易被污染物覆蓋而漏檢〔3〕。肝吸蟲在宿主體內(nèi)發(fā)育和寄生的過(guò)程中主要產(chǎn)生特異性IgG 抗體〔4〕。血清IgG 抗體檢測(cè)是診斷肝吸蟲感染的有效方法，但I(xiàn)gG 抗體通常在感染一段時(shí)間后才開始產(chǎn)生，無(wú)法早期診斷及分辨感染的時(shí)期，且經(jīng)治療痊愈后抗體水平變化不明顯，無(wú)法用于肝吸蟲病的療效考核，而檢測(cè)循環(huán)抗原可彌補(bǔ)上述不足〔5-6〕。肝吸蟲循環(huán)抗原是蟲體在發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的蟲卵抗原及蟲體分泌物等，在肝吸蟲感染早期、急性期或活動(dòng)期的血液中存在，是肝吸蟲現(xiàn)癥或急性感染的證據(jù)，可作為活蟲感染的標(biāo)志并用于療效考核〔7-8〕。由于血清中肝吸蟲循環(huán)抗原成分較難獲取，研究〔9〕證明循環(huán)抗原的主要成分是排泄分泌抗原，但其在血清中的含量較低，目前使用常規(guī)免疫學(xué)方法檢測(cè)的研究甚少，研發(fā)高靈敏的檢測(cè)方法是當(dāng)下早期診斷肝吸蟲病所面臨的新課題。

納米金是指在三維結(jié)構(gòu)中至少有一維小于100 nm 的金粒子，其合成簡(jiǎn)單、體積小、表面易于修飾、生物相容性好，單位面積可結(jié)合多個(gè)生物分子從而起到信號(hào)放大的作用，且結(jié)合后生物分子的活性幾乎不會(huì)發(fā)生改變〔10-11〕。納米金棒是一種棒狀納米金，通過(guò)紫外分光光度計(jì)掃描可見橫向和縱向2個(gè)吸收帶，其中縱向吸收帶的位置隨著其縱橫比的增加而產(chǎn)生位移，能實(shí)時(shí)反映抗原-抗體的相互作用〔12〕。因此，本研究在李家萌〔13〕對(duì)納米金棒的最佳聚合條件研究基礎(chǔ)上，將納米金棒與巰基化的特異性抗體結(jié)合，利用其縱向吸收帶的特性，對(duì)肝吸蟲感染的大鼠血清循環(huán)抗原進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 HAuCl4（上海杰泰生物技術(shù)公司，批號(hào)：A601926）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，華美生物工程公司，批號(hào)：112-020-74）；NaBH4（成都華夏化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：MFCD0035）；乙二胺四乙酸（EDTA，碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C0503）；AgNO3（華夏試劑公司，批號(hào)：20563439）；抗壞血酸（晶美生物工程有限公司，批號(hào)：20006621）；特勞特試劑（上海生工公司，批號(hào)：TR4720853）；PEG-6000（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：473-3CWRD）；PAGE 蛋白回收試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司，批號(hào)：PG114）；BCA 蛋白定量試劑盒（Signalway Antibody 公司，批號(hào)：3415）；大鼠血清抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（昆明嬌曼生物有限公司，批號(hào)：D2020495）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 含有活囊蚴的麥穗魚由廣西醫(yī)科大學(xué)提供；健康雄性SD 大鼠（150～200 g），購(gòu)自大理大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（云）2021-0015。

1.3 制備肝吸蟲特異性IgG 抗體

1.3.1 建立大鼠肝吸蟲病模型 將含有活囊蚴的麥穗魚用清水沖洗數(shù)遍，剪刀剪去魚的魚鰭、魚尾、魚骨等，剩下的魚肉剪碎放入絞肉機(jī)絞成肉泥，將魚肉和消化液以1∶10 的比例混合，置于恒溫?fù)u床中消化過(guò)夜約10 h。將消化后的魚肉過(guò)濾到量杯中，倒出上清液留沉淀，重復(fù)4～5 次，直到分離出沉渣中的囊蚴，以備灌胃。將待感染的SD 大鼠分為3組，每組20 只，按囊蚴感染量50、100、200 條，分別對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，即獲得大鼠肝吸蟲病輕度、中度、重度感染模型。

1.3.2 收集不同感染度、不同感染時(shí)間大鼠血清樣品 收集輕度、中度、重度感染后3、10、17、31 d 的大鼠眼內(nèi)眥靜脈血樣，4 ℃放置數(shù)小時(shí)，4 000 r/min離心30 min，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 純化并鑒定肝吸蟲特異性IgG 抗體 利用親和層析法純化收集的血清，鑒定純化后的肝吸蟲特異性IgG 抗體純度。

1.4 納米金棒標(biāo)記肝吸蟲特異性IgG 抗體及抗體篩選

1.4.1 制備金晶種子液 混合0.2 mmol/L CTAB 1.88 mL、2 mmol/L HAuCl4625 μL、純水1.37 mL，將4 ℃冰箱中現(xiàn)配的0.01 mmol/L NaBH4450 μL 加入上述混合液中，快速震蕩2 min，27 ℃放置120 min。1.4.2 制備生長(zhǎng)媒介及聚合納米金棒 向50 mL離心管中加入0.2 mmol/L CTAB 11.88 mL、純水7.71 mL、2 mmol/L HAuCl45.00 mL、10 mmol/L AgNO3150 μL、100 mmol/L 抗壞血酸160 μL 混勻制備成生長(zhǎng)媒介。取108 μL 金晶種子液，加入25 mL 生長(zhǎng)媒介中，27 ℃孵育12 h 后用紫外分光光度計(jì)掃描納米金棒，對(duì)其吸收峰進(jìn)行分析。

1.4.3 純化納米金棒 參照文獻(xiàn)〔14〕的方法并稍加改進(jìn)，將納米金棒懸浮液8 500 r/min 離心20～40 min，留沉淀，加入純水，13 000 r/min 再次離心10 min，棄上清液，加入新配制的0.5 mmol/L CTAB 1.5 mL，獲得高純度的納米金棒。

1.4.4 制備肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒及抗體篩選 將BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定的特異性IgG 抗體稀釋至10、20、30、40 μg/mL，各取200 μL分別加到800 μL 含EDTA 的PBS 緩沖液滅菌管中，再加入5 mg/mL 特勞特試劑5 μL 混合，27 ℃放置60 min。將處理后的特異性抗體混合液進(jìn)行脫鹽，除去雜抗體，收集所需的特異性抗體。將處理后的抗體100 μL 加至2 mL 分裝的納米金棒溶液中，靜置數(shù)分鐘后加入1 mL PEG-6000 溶液，28 ℃放置120 min，用紫外分光光度計(jì)掃描標(biāo)記不同濃度特異性IgG 抗體納米金棒，根據(jù)吸收峰位移變化確定特異性IgG 抗體的最佳標(biāo)記濃度。

1.5 篩選并鑒定循環(huán)抗原組分

1.5.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析循環(huán)抗原 SDS-PAGE 法純化獲得不同感染時(shí)間血清樣品中分子量為26、28 kDa的血清排泄分泌純化抗原條帶，用PAGE 蛋白回收試劑盒收集凝膠中的蛋白質(zhì)。

1.5.2 肝吸蟲血清循環(huán)抗原的抗原性鑒定 采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定血清循環(huán)抗原濃度，分別向400 μL 含EDTA 的PBS 緩沖液中加入上述不同感染時(shí)間的循環(huán)抗原100 μL，再取5 mg/mL 特勞特試劑5 μL，加入上述混合液中，27 ℃放置60 min。將處理后的循環(huán)抗原混合液進(jìn)行脫鹽，直至收集到所需抗原。取上述循環(huán)抗原200 μL 與4 mL 納米金棒溶液混勻5 min，加入2 mL PEG-6000，28 ℃放置120 min。紫外分光光度計(jì)測(cè)定納米金棒的吸收峰，判斷是否標(biāo)記成功。向2 mL 納米金棒標(biāo)記的不同時(shí)間肝吸蟲循環(huán)抗原內(nèi)各加入40 μL 大鼠陽(yáng)性血清抗體，28 ℃反應(yīng)10 min。

1.6 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測(cè)血清循環(huán)抗原 用肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒分別檢測(cè)不同感染度、不同感染時(shí)間、不同稀釋度的血清循環(huán)抗原，檢測(cè)結(jié)果與陰性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。

1.7 ELISA 檢測(cè)肝吸蟲血清特異性抗體 用ELISA 試劑盒檢測(cè)肝吸蟲不同感染度、不同感染時(shí)間、不同稀釋度的血清特異性抗體，檢測(cè)結(jié)果與臨界值進(jìn)行對(duì)比。本研究的臨界值為0.211 5。

2 結(jié)果

2.1 肝吸蟲特異性IgG 抗體純化結(jié)果 肝吸蟲特異性IgG 抗體純化后顯示2 個(gè)條帶。見圖1。

圖1 原始樣品及抗體純化后流出各部分電泳圖

2.2 肝吸蟲特異性IgG 抗體最佳標(biāo)記濃度 納米金棒分別標(biāo)記濃度為10、20、30、40 μg/mL 的特異性IgG 純化抗體，結(jié)果顯示標(biāo)記前后納米金棒吸收峰均發(fā)生不同程度的位移，位移分別為10.0、20.0、15.0、4.0 nm?？贵w標(biāo)記濃度為20 μg/mL 時(shí)，吸收峰位移最大為20.0 nm，表明肝吸蟲特異性IgG 純化抗體最佳標(biāo)記濃度為20 μg/mL。

2.3 循環(huán)抗原各組分電泳結(jié)果 SDS-PAGE 法純化獲得不同感染時(shí)間大鼠血清樣品的電泳條帶，結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)的血清樣品中均有分子量為26、28 kDa 的排泄分泌純化抗原條帶。見圖2。

圖2 不同感染時(shí)間大鼠血清SDS-PAGE 電泳圖

2.4 肝吸蟲血清循環(huán)抗原的抗原性鑒定結(jié)果 納米金棒分別標(biāo)記感染后3、10、17、31 d 的肝吸蟲排泄分泌純化抗原，檢測(cè)肝吸蟲陽(yáng)性血清抗體。結(jié)果表明，檢測(cè)前后納米金棒吸收峰均不同程度地發(fā)生位移，位移分別為13.0、15.5、16.5、15.5 nm，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，即不同感染時(shí)間的肝吸蟲排泄分泌純化抗原均能識(shí)別陽(yáng)性血清抗體。因此，不同感染時(shí)間的肝吸蟲排泄分泌純化抗原均具有較強(qiáng)的抗原性。

2.5 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒血清循環(huán)抗原檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 不同程度感染后3 d 大鼠血清循環(huán)抗原光譜掃描結(jié)果 陰性對(duì)照血清的吸收峰最大位移為2.0 nm，用肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測(cè)輕度、中度、重度肝吸蟲囊蚴感染后3 d 大鼠血清循環(huán)抗原的吸收峰最大位移分別為3.0、11.0、13.0 nm。見圖3 A～C，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

圖3 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測(cè)不同程度感染后3 d 大鼠血清循環(huán)抗原光譜掃描曲線

2.5.2 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測(cè)相同感染度、不同感染時(shí)間血清循環(huán)抗原結(jié)果 用肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒對(duì)感染度相同、感染時(shí)間分別為3、10、17、31 d 的血清循環(huán)抗原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性。肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒與輕度感染后的血清循環(huán)抗原反應(yīng)，吸收峰分別移動(dòng)了3.0、17.5、10.5、12.0 nm；與中度感染后的血清循環(huán)抗原反應(yīng)，吸收峰分別移動(dòng)了11.0、20.0、14.0、32.5 nm；與重度感染后的血清循環(huán)抗原反應(yīng)，吸收峰分別移動(dòng)了13.0、25.0、16.0、34.5 nm。見圖4。表明肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒可檢出50、100、200 條囊蚴感染后3、10、17、31 d 的血清循環(huán)抗原。

圖4 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測(cè)相同感染度、不同感染時(shí)間血清循環(huán)抗原吸收峰位移結(jié)果

2.5.3 不同稀釋度的大鼠血清循環(huán)抗原光譜掃描結(jié)果 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測(cè)稀釋度為1∶100、1∶200、1∶400、1∶600 的大鼠血清循環(huán)抗原，吸收峰位移分別為9.0、7.0、4.5、1.0 nm。見圖5 A～D。其中稀釋度為1∶600 的檢測(cè)結(jié)果為陰性，其他檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。

圖5 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測(cè)不同稀釋度血清循環(huán)抗原光譜掃描曲線

2.6 ELISA 檢測(cè)肝吸蟲血清抗體結(jié)果 ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，輕度感染后第17 天、中度和重度感染后第10 天、第17 天出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。見表1。稀釋度為1∶100 的血清抗體結(jié)果為陽(yáng)性。見表2。

表1 ELISA 檢測(cè)肝吸蟲不同感染度感染大鼠后不同時(shí)間的血清抗體結(jié)果

表2 ELISA 檢測(cè)不同稀釋度的肝吸蟲感染大鼠后血清抗體結(jié)果

3 討論

本研究采用優(yōu)化的金晶種子生長(zhǎng)法成功聚合出縱橫比穩(wěn)定的納米金棒，利用Au-S 共價(jià)鍵結(jié)合的方式將巰基化的肝吸蟲特異性IgG 抗體包被在納米金棒表面〔15〕，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定納米金棒的吸收峰位移，優(yōu)選出高敏感性的肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒，并檢測(cè)不同感染度及不同感染時(shí)間血清循環(huán)抗原。當(dāng)血清循環(huán)抗原與納米金棒上的肝吸蟲特異性IgG 抗體反應(yīng)后，再次增大納米金棒的縱橫比，使得納米金棒固有頻率發(fā)生改變，從而引起納米金棒縱向吸收峰再次產(chǎn)生位移，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝吸蟲感染的微量血清循環(huán)抗原的檢測(cè)，建立了早期肝吸蟲病的臨床診斷實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

由于肝吸蟲血清排泄分泌抗原具有高活性成分，因此可用于診斷肝吸蟲病〔16〕。Li 等〔17〕證實(shí)肝吸蟲血清排泄分泌抗原中存在多種蛋白條帶，其中分子量為26、28 kDa 是特異性較強(qiáng)的蛋白條帶，與其他寄生蟲無(wú)交叉反應(yīng)。為鑒定其抗原性，構(gòu)建了不同時(shí)間的肝吸蟲血清排泄分泌純化抗原納米金棒檢測(cè)大鼠血清抗體，通過(guò)吸收峰的位移判斷不同感染時(shí)間排泄分泌純化抗原的抗原性。結(jié)果顯示，不同感染時(shí)間的排泄分泌純化抗原納米金棒均可檢測(cè)出大鼠血清抗體，抗原性強(qiáng)，可作為肝吸蟲病的診斷抗原。

分析肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測(cè)不同感染度、不同感染時(shí)間的大鼠血清結(jié)果，能間接發(fā)現(xiàn)宿主體內(nèi)循環(huán)抗原的動(dòng)態(tài)變化。肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒與輕度感染后3、10、17、31 d 的血清循環(huán)抗原反應(yīng)，吸收峰分別移動(dòng)了3.0、17.5、10.5、12.0 nm，說(shuō)明感染后3 d 就可檢測(cè)出最低感染量為50 條囊蚴的血清循環(huán)抗原，且感染后10 d 吸收峰的位移較感染后17 d 的大，推測(cè)是早期感染后產(chǎn)生的循環(huán)抗原還沒有被宿主免疫系統(tǒng)清除，而與納米金棒上的特異性IgG 抗體結(jié)合，使得吸收峰位移較大。研究〔18〕發(fā)現(xiàn)IgG 抗體于感染后14 d 開始上升，宿主體內(nèi)的循環(huán)抗原被逐漸清除，使得循環(huán)抗原逐漸減少，因此感染后17 d 吸收峰的位移減小。而感染后31 d 吸收峰位移增大，分析原因應(yīng)該是宿主體內(nèi)的蟲體發(fā)育成熟，循環(huán)抗原的量增多。ELISA 結(jié)果也證實(shí)，輕度感染后17 d、中度和重度感染后10、17 d 的大鼠血清特異性抗體為陽(yáng)性反應(yīng)，判斷是因?yàn)楦腥径扰c血清抗體含量成正比。宿主體內(nèi)抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化與相同感染度、不同感染時(shí)間吸收峰位移先增大、后減小、再增大的規(guī)律相符。相同時(shí)間內(nèi)，輕度、中度、重度感染的吸收峰位移逐漸增加，說(shuō)明隨著感染量的增加，循環(huán)抗原的量越多，與納米金棒上的特異性IgG 抗體結(jié)合得越多，吸收峰位移越大，即宿主體內(nèi)的循環(huán)抗原的含量與蟲體數(shù)量呈正相關(guān)。經(jīng)臨床有效治療后蟲體數(shù)量逐漸減少，血清中循環(huán)抗原的量逐漸減少，位移減小。因此，肝吸蟲血清循環(huán)抗原的檢測(cè)不僅可作為肝吸蟲感染早期及低蟲荷的診斷依據(jù)，也是判斷臨床治療效果的評(píng)估依據(jù)。

本研究進(jìn)一步檢測(cè)了稀釋度為1∶100、1∶200、1∶400、1∶600 的血清循環(huán)抗原，結(jié)果顯示吸收峰分別位移了9.0、7.0、4.5、1.0 nm。由此可見隨著稀釋度的增加，抗原抗體反應(yīng)的比例降低，使得吸收峰位移逐漸減小。稀釋度為1∶600 時(shí)，吸收峰位移僅為1.0 nm，推測(cè)是由于誤差造成。ELISA 僅能檢測(cè)到稀釋度為1∶100 的血清抗體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明納米金棒具有更高的靈敏度。

本研究結(jié)果證實(shí)了肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒可用于檢測(cè)血清循環(huán)抗原，且具有檢測(cè)時(shí)間早和靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。針對(duì)肝吸蟲感染者可在早期感染、低度感染時(shí)提供診斷依據(jù)，在肝吸蟲患者治療過(guò)程中循環(huán)抗原的檢測(cè)可為臨床醫(yī)生提供治療效果的評(píng)估，更好把握療程，提高療效。納米金生物技術(shù)更大的拓展空間源于納米金棒合成簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速且穩(wěn)定性強(qiáng)、結(jié)果觀察不需要特殊的儀器等特點(diǎn)，其優(yōu)勢(shì)完全滿足了即時(shí)檢驗(yàn)的要求，為實(shí)現(xiàn)在患者床旁進(jìn)行疾病的快速診斷和監(jiān)測(cè)奠定了良好的基礎(chǔ)，國(guó)外已有研究〔19〕表明，納米金診斷技術(shù)與即時(shí)檢驗(yàn)的結(jié)合已經(jīng)成為個(gè)人醫(yī)療領(lǐng)域全集成即時(shí)檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)展的最新趨勢(shì)，應(yīng)用前景可觀。