王惠,潘無雙,錢玟,林德賢,劉書亮,陳姝娟,何利
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625014)
有機(jī)磷農(nóng)藥是指磷酸酯或是硫代磷酸脂化合物,依照結(jié)構(gòu)可分為磷酸酯、亞膦酸酯和磷酰胺及其相應(yīng)的硫代衍生物[1]。有機(jī)磷農(nóng)藥可與乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)結(jié)合,生成磷?;憠A酯酶而無法水解乙酰膽堿,使得體內(nèi)乙酰膽堿蓄積,導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)和部分中樞神經(jīng)的過度興奮,從而產(chǎn)生中毒癥狀[2]。有機(jī)磷農(nóng)藥的持續(xù)使用導(dǎo)致了環(huán)境和食品的污染,嚴(yán)重影響了人類健康。目前,用于食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測方法包括毛細(xì)管電泳法、膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法、色譜法、分光光度法和比色法[3]等,然而這些方法都存在一定的局限性,如操作步驟復(fù)雜、成本高、難以實(shí)現(xiàn)快速檢測、酶試劑易失活、結(jié)果不穩(wěn)定以及重復(fù)性較差等缺點(diǎn)。針對上述問題,一些檢測食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的新方法被開發(fā),其中電化學(xué)傳感器由于其檢測速度快、成本低、靈敏度高而備受關(guān)注。
圖1 電化學(xué)傳感器檢測有機(jī)磷農(nóng)藥Fig.1 Electrochemical sensors detect organophosphorus pesticides
可將電化學(xué)傳感器分為2個部分,分別是識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件,利用電化學(xué)分析,一般以電極作為信號轉(zhuǎn)換器,以電勢或者電流為表現(xiàn)信號對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢測。檢測有機(jī)磷農(nóng)藥常用的識別元件包括以下三類:1)以生物材料作為識別元件,例如AChE、有機(jī)磷水解酶(organophosphorus hydrolase, OPH)、核酸適配體、微生物、抗體等;2)以有機(jī)物為識別元件,如分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIP)和肟類化合物等;3)以無機(jī)物為識別元件,如CuO、ZrO2、TiO2等。
電化學(xué)酶傳感器是以酶為識別元件的電化學(xué)傳感器,根據(jù)酶的不同作用,又可將電化學(xué)酶傳感器抑制型和催化型。
電化學(xué)抑制酶傳感器的識別元件大多采用 AChE或丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase,BChE),底物為乙酰膽堿(acetylcholine,ACh),AChE或BChE可以催化ACh,加入有機(jī)磷農(nóng)藥后,有機(jī)磷農(nóng)藥與AChE或BChE結(jié)合,從而抑制ACh的催化反應(yīng)。檢測原理如下:將AChE或BChE固定在玻碳電極上,AChE或BChE可以將ACh催化生成電活性物質(zhì),產(chǎn)生電信號,加入有機(jī)磷農(nóng)藥后,有機(jī)磷農(nóng)藥的磷酸基團(tuán)會和AChE或BChE發(fā)生共價結(jié)合,使AChE或BChE的催化能力降低,導(dǎo)致催化ACh生成的電活性物質(zhì)減少,電信號會隨之變化,如圖2-a所示。
a-AChE為識別元件;b-OPH或產(chǎn)OPH微生物為識別元件;c-抗體為識別元件圖2 電化學(xué)生物傳感器檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的原理Fig.2 Principles of electrochemical biosensors to detect organophosphorus pesticides
GONG等[4]在修飾了Au-PPy交錯的網(wǎng)絡(luò)狀納米材料上負(fù)載了AChE用于甲基對硫磷的檢測,該傳感器具有良好的再現(xiàn)性,且檢出限為2 ng/mL。VIGNESH等[5]在AChE為識別元件的基礎(chǔ)上加以改善放大電信號的材料,修飾碳納米管并采用戊二醛交聯(lián)AChE包裹的牛血清蛋白納米復(fù)合材料對甲基對硫磷進(jìn)行檢測,得到更低的檢出限:3.75×10-11mol/ L(0.099 ng/mL)。
此外,以AChE為識別元件的傳感器還可用來檢測久效磷、毒死蜱、甲基對硫磷、倍硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥,均呈現(xiàn)較低的檢出限及較高的準(zhǔn)確性[6-9]。以AChE作為識別元件制備的電化學(xué)傳感器材料易得,成本較低,但特異性較差,研究發(fā)現(xiàn), AChE的活性也受氨基甲酸酯類農(nóng)藥的影響,因此電化學(xué)AChE傳感器用于食品中時,會導(dǎo)致檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的結(jié)果偏大。
電化學(xué)催化酶傳感器以O(shè)PH為識別元件,對食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測。OPH能識別有機(jī)磷農(nóng)藥中的結(jié)構(gòu),包括P—O、P—S、P—F、P—CN[10],使有機(jī)磷農(nóng)藥水解成硝基苯酚,硝基苯酚的電化學(xué)活性可以表現(xiàn)出電信號的變化,如圖2-b所示?;谝陨显磉M(jìn)行了大量研究,如PEDROSA等[11]成功制備以O(shè)PH為識別元件的電化學(xué)傳感器對含有P—O的對氧磷進(jìn)行檢測。除此之外,DEO等[12]以碳納米管修飾電極并負(fù)載OPH,對對氧磷和含有P—S的甲基對硫磷進(jìn)行檢測。
對氧磷和甲基對硫磷是分別含有P—O和P—S的有機(jī)磷農(nóng)藥,OPH可催化這2種有機(jī)磷農(nóng)藥水解,生成電活性物質(zhì),從而使電信號發(fā)生變化。電化學(xué)OPH傳感器只針對上述的結(jié)構(gòu)有機(jī)磷農(nóng)藥,具有良好的特異性,但OPH來自特定的微生物,目前還不能擴(kuò)大生產(chǎn)。
電化學(xué)復(fù)合酶傳感器的識別元件是采用2種及2種以上的酶。除了上述的AChE和OPH單獨(dú)作為識別元件,也可以采用復(fù)合酶作為識別元件,SAHIN等[13]研究出一種以O(shè)PH和辣根過氧化物酶作為識別元件的電化學(xué)傳感器, OPH能夠水解有機(jī)磷農(nóng)藥生成酚類物質(zhì),酚類物質(zhì)的水解產(chǎn)物可作為電子轉(zhuǎn)移的介質(zhì),在辣根過氧化物酶電極上得到電信號,將該傳感器用于二氯倍硫磷的檢測,檢測效果良好。目前,電化學(xué)復(fù)合酶傳感器開發(fā)較少,對比單一酶作為識別元件的電化學(xué)傳感器,2種或2種以上復(fù)合酶傳感器的檢出限并未大幅度降低,針對電化學(xué)復(fù)合酶傳感器還需要進(jìn)一步研究。以酶作為識別元件的電化學(xué)傳感器存在一些問題,如酶不易保存,在貯藏過程易出現(xiàn)酶活下降的現(xiàn)象,且放大電信號的材料需進(jìn)一步篩選,重金屬材料會導(dǎo)致酶變失活等,對電化學(xué)酶傳感器的進(jìn)一步研究還需解決上述問題。
以抗原/抗體為識別元件的電化學(xué)傳感器稱為電化學(xué)免疫傳感器。將抗原/抗體修飾到電極上,分別用于檢測抗體/抗原,利用抗原抗體的特殊反應(yīng),以電信號的形式表現(xiàn),實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測,如圖2-c所示。因?yàn)榭乖贵w的免疫免疫反應(yīng)具有特異性,電化學(xué)免疫傳感器只需利用不同的抗原或抗體,就可以實(shí)現(xiàn)對不同有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測,并得到較好的檢測專一性。如LIU等[14]以對氧磷半抗原為識別元件,采用競爭法對對氧磷進(jìn)行檢測,將該電化學(xué)免疫傳感器用于湖水、農(nóng)田水、自來水和純凈水中對氧磷殘留的檢測,都得到較好的回收率。同時MEHTA等[15]采用抗對硫磷抗體為識別元件,實(shí)現(xiàn)對對硫磷的特異性檢測。
但抗原/抗體大多為蛋白質(zhì),易受溫度、pH值、介質(zhì)環(huán)境等因素影響而導(dǎo)致其生物活性降低,需要特別考慮其儲藏穩(wěn)定性。有研究表明通過改善貯藏條件及采用交聯(lián)劑處理,可以延長抗原/抗體識別元件的電化學(xué)穩(wěn)定性,如MEHTA等[16]將所制備的電化學(xué)傳感器放置于4 ℃的冰箱中,50 d后傳感器的輸出信號減少小于5%;YIN等[17]采用交聯(lián)劑保護(hù)抗體的生物活性,使傳感器在9周后仍保留原來信號的85%。電化學(xué)免疫傳感器特異性好、靈敏度,但其核心識別元件抗原抗體的獲取困難,因此將電化學(xué)免疫傳感器擴(kuò)大生產(chǎn),還需解決抗原抗體的獲取問題。
核酸適配體是10~50個單鏈脫氧核糖核酸或核糖核酸通過指數(shù)富集(SELEX),由配體的系統(tǒng)進(jìn)化產(chǎn)生,它們能夠以高親和力特異性結(jié)合各種分析物,進(jìn)而特異性折疊成三維結(jié)構(gòu),核酸適配體可以形成廣泛的結(jié)構(gòu)基序,包括發(fā)夾、莖、凸起、G-四鏈體和假結(jié),通過疏水和范德瓦爾斯相互作用、氫鍵、芳香堆積等多種相互作用與目標(biāo)物識別[18]。電化學(xué)核酸適配體傳感器是利用核酸適配體與目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測,如圖2-c所示。
核酸適配體針對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行設(shè)計,因此具有極強(qiáng)特異性,此外核酸適配體還具有可重復(fù)利用性。如KAUR[19]等制備核酸適配體成功應(yīng)用于生菜樣品中馬拉硫磷的檢測,該傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性。GUO等[20]以核酸適配體為識別元件制備電化學(xué)傳感器用于蘋果和大白菜中毒死蜱殘留的檢測,檢測效果準(zhǔn)確且回收率高。該傳感器不僅具有良好的選擇性和重復(fù)性,并且可以通過尿素再生,實(shí)現(xiàn)重復(fù)使用。核酸適配體目前被認(rèn)為是基于酶和抗體的潛在替代品,相比酶和抗體,核酸適配體穩(wěn)定性較好,可形成與目標(biāo)物相匹配的結(jié)構(gòu),特異性好,存在可重復(fù)性,但特定核酸適配體較高的成本及復(fù)雜的篩選都限制了電化學(xué)核酸適配體傳感器的進(jìn)一步發(fā)展。
電化學(xué)微生物傳感器以微生物的細(xì)胞或細(xì)胞表面的活性物質(zhì)作為電化學(xué)傳感器的識別元件,如從環(huán)境篩選出能夠產(chǎn)生有OPH的微生物,OPH與有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)合后會使其分解產(chǎn)生硝基苯酚等物質(zhì),硝基苯酚等物質(zhì)具有電化學(xué)活性,基于此原理檢測有機(jī)磷農(nóng)藥[21],如圖2-b所示。
MULCHANDANI等[22]研制出了一種由溶解氧電極組成的電化學(xué)微生物傳感器,以微生物為識別元件,該微生物能在細(xì)胞表面表達(dá)OPH,降解有機(jī)磷農(nóng)藥并消耗氧氣,該傳感器對于對氧磷的檢出限為0.1 mmol/L。電化學(xué)微生物傳感器具有創(chuàng)新性,但與
電化學(xué)催化酶傳感器相比存在缺陷,微生物難以固定,且不同微生物的運(yùn)動方式不同,導(dǎo)致固定方式的復(fù)雜性;電化學(xué)微生物傳感器由于其識別元件的特殊性,導(dǎo)致其穩(wěn)定性相對于其他傳感器較差;微生物傳代較快,難以在檢測過程中確定微生物是否存活,導(dǎo)致檢測結(jié)果存在誤差。
以生物材料為識別元件的電化學(xué)傳感器在應(yīng)用方面受到一定的限制,如酶和抗體等物質(zhì)會出現(xiàn)活力降低的現(xiàn)象,需要放置在4 ℃的條件下進(jìn)行保存;核酸適配體成本高昂等。學(xué)者們開發(fā)出了一些有機(jī)物替代生物材料用于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測,如分子印跡聚合物、肟類化合物等。
分子印跡聚合物molecular imprinted polymers,MIPs)是一類聚合材料,目標(biāo)分子表現(xiàn)為模板,交聯(lián)的單體圍繞著目標(biāo)分子進(jìn)行排列聚合,形成特定的結(jié)合腔,結(jié)合腔的形狀和官能團(tuán)可以與目標(biāo)分子特異性結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分子的檢測[23]。電化學(xué)分子印跡傳感器是利用MIPs與目標(biāo)物質(zhì)的特異性結(jié)合,將該反應(yīng)轉(zhuǎn)換為電信號,實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測,如圖3所示。
圖3 電化學(xué)分子印跡聚合物/肟類化合物傳感器檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的原理Fig.3 Principles of electrochemical molecularly imprinted polymer/oxime compound sensors for detecting organophosphorus pesticides
研究者利用此原理通過改善修飾材料和制備MIPs的原材料從而改善電化學(xué)MIPs傳感器的檢測性能,如ZOUAOUI等[24]基于殼聚糖電沉積印跡草甘膦的MIPs,成功用于草甘膦的檢測,檢測時間為30 min。而DING等[25]通過在聚吡咯納米管的壁上和表面上印跡草甘膦位點(diǎn)制備得到針對于草甘膦的電化學(xué)分子印跡傳感器,將其用于檢測橙汁和大米飲料中的草甘膦殘留,回收率分別為97.45%~101.69%和94.54%~102.79%。且制備的傳感器檢測時間更短。
電化學(xué)MIPs傳感器的識別元件通過印跡不同的有機(jī)磷農(nóng)藥可以實(shí)現(xiàn)對其他有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測,大量研究表明,能將分子印跡聚合物用于多種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測[26-27]。分子印跡聚合物是針對特定的目標(biāo)物進(jìn)行設(shè)計,具有良好特異性和重復(fù)使用性,但其制備過程復(fù)雜,且模板分子需采用純度較高的單體,制備成本較高,限制了該方法在食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。
肟類化合物能與有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)合發(fā)生反應(yīng),使其磷酰化,利用此原理制備電化學(xué)肟傳感器對有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測,如圖3所示。WU等[28]制備識別元件4-氨基苯乙酮肟對二乙基氰基膦酸酯進(jìn)行檢測,該傳感器具有較廣的檢測范圍,并能用于檢測其他有機(jī)磷農(nóng)藥,如樂果、殺螟硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥。以肟類化合物為識別元件的電化學(xué)傳感器對有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測具有良好特異性,檢出限低等優(yōu)勢,但肟類化合物合成步驟繁雜且合成原料具有毒性,限制了電化學(xué)肟傳感器的大規(guī)模應(yīng)用。
以有機(jī)物為識別元件的電化學(xué)傳感器雖然穩(wěn)定性好,但其制備流程復(fù)雜、制備所用有機(jī)物大多存在毒性、污染較大,為了避免出現(xiàn)上述問題,以無機(jī)物為識別元件的電化學(xué)傳感器也被廣泛研究。
電化學(xué)無機(jī)物傳感器利用無機(jī)物與有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行結(jié)合,得到電信號變化,從而實(shí)現(xiàn)對有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測,識別元件可以為CuO、TiO2、ZrO2等無機(jī)化合物。據(jù)研究發(fā)現(xiàn),銅或含銅化合物與硫代化合物具有良好的親和力[29],可以與含硫的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行結(jié)合形成配合物,引起電信號的變化,如圖4所示。
圖4 電化學(xué)CuO傳感器檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的原理Fig.4 Principles of electrochemical CuO sensors to detect organophosphorus pesticides
由于馬拉硫磷和甲基對硫磷都屬于含硫的有機(jī)磷農(nóng)藥,因此電化學(xué)Cu/CuO傳感器可對這類農(nóng)藥進(jìn)行檢測。如HUO等[30]在玻碳電極上修飾了單壁碳納米管和氧化銅納米線對馬拉硫磷進(jìn)行檢測,該電化學(xué)傳感器對馬拉硫磷的檢測顯示出良好選擇性、靈敏度和較寬的線性范圍,將大蒜中加入馬拉硫磷,檢測得到回收率良好。李瓊[31]通過簡單混合的方式得到銅納米線和石墨烯/殼聚糖復(fù)合納米材料并將其成功用于甲基對硫磷的檢測。
電化學(xué)銅傳感器操作簡便,環(huán)境污染小,可以實(shí)現(xiàn)馬拉硫磷和甲基對硫磷等含硫有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測,但銅也能和EDTA[32]和檸檬酸[33]等物質(zhì)進(jìn)行配位結(jié)合,導(dǎo)致該檢測方法易受干擾、檢測結(jié)果準(zhǔn)確度不高。
除了CuO,其他納米金屬、納米金屬氧化物及其復(fù)合物也對有機(jī)磷農(nóng)藥表現(xiàn)出特殊催化活性和吸附性,如ZrO2等,ZrO2對磷酸基團(tuán)有很強(qiáng)的親和力[34],GAO等[35]在玻碳電極上合成了Au、ZrO2和石墨烯復(fù)合材料對大白菜中的甲基對硫磷進(jìn)行檢測,得到96.2%~102.1%的回收率。以無機(jī)物為識別元件的電化學(xué)傳感器無毒,但其與有機(jī)磷農(nóng)藥配位結(jié)合力特異性不強(qiáng),易受其他物質(zhì)的干擾。
不同的電化學(xué)傳感器在應(yīng)用于實(shí)際檢測食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留時各有優(yōu)缺點(diǎn)(表1)。電化學(xué)AChE傳感器成本較低,在食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)較為成熟,但該方法特異性差的問題仍未解決。電化學(xué)OPH傳感器具有良好特異性,由于目前OPH來自特定微生物,將其應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測需要解決其生產(chǎn)問題。電化學(xué)免疫傳感器特異性好,靈敏度高,但抗原/抗體獲取仍存在困難;電化學(xué)核酸適配體傳感器是近幾年研究較多的電化學(xué)傳感器,針對不同的物質(zhì)可以篩選出不同的結(jié)構(gòu),特異性好,但每種有機(jī)磷農(nóng)藥需要篩選與其特異性結(jié)合的適配體,特定的二級結(jié)構(gòu)形成機(jī)制復(fù)雜,且核酸適配體的成本問題仍沒有得到解決。電化學(xué)微生物傳感器具有創(chuàng)新性,但由于微生物的特殊性,導(dǎo)致該電化學(xué)傳感器穩(wěn)定性較差。電化學(xué)分子印跡聚合物傳感器穩(wěn)定性好,易保存,可重復(fù)使用,但分子印跡聚合物的功能單體價格較為昂貴,制備時間長且多數(shù)有機(jī)物存在毒性。電化學(xué)肟傳感器針對有機(jī)磷農(nóng)藥有很強(qiáng)特異性且來源較廣,但肟類化合物易氧化及部分肟類化合物存在毒性。電化學(xué)無機(jī)物傳感器雖然無毒,但特異性差,如銅可以和多種化合物進(jìn)行配合。綜上,電化學(xué)傳感器仍需進(jìn)一步優(yōu)化方法,以實(shí)現(xiàn)在食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測的廣泛應(yīng)用。
表1 不同種類電化學(xué)傳感器用于檢測食品中有機(jī)磷農(nóng)藥的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of different types of electrochemical sensors in detecting organophosphorus pesticides in food
電化學(xué)傳感器是食品中快速檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的研究熱點(diǎn),但應(yīng)用于食品中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測仍存在如下問題:(1)電化學(xué)傳感器的識別元件存在缺陷。易受介質(zhì)環(huán)境其他物質(zhì)的干擾;部分識別元件制備成本高,制備過程環(huán)境污染大,難以應(yīng)用于實(shí)際食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測。(2)放大電信號材料有待進(jìn)一步研究,食品中殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥含量少,因此在制備電化學(xué)傳感器時需要修飾提高電化學(xué)性能的材料,但在使用提高電化學(xué)性能材料的同時會帶來額外的一些問題,如多孔材料吸附非檢測目標(biāo)物質(zhì)而帶來干擾;金屬納米材料易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象導(dǎo)致檢測靈敏性降低等;(3)電化學(xué)傳感器需進(jìn)一步研究其系統(tǒng)化和功能化。目前大多研究電化學(xué)傳感器仍配置的電化學(xué)工作站進(jìn)行研究;有機(jī)磷農(nóng)藥降解速度快,因此很難實(shí)現(xiàn)對食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速、實(shí)時現(xiàn)場檢測;目前大多前處理方法仍采用國標(biāo)方法的前處理方法,缺少針對于電化學(xué)傳感器的前處理方法。
電化學(xué)傳感器快速檢測食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留具有儀器簡單、響應(yīng)速度快、檢測靈敏度低等優(yōu)點(diǎn),具有較高的應(yīng)用潛力,尤其以下發(fā)展方向值得關(guān)注:(1)開發(fā)具有選擇特異性好、毒性低且環(huán)境友好、制備成本低的識別元件;制備靈敏性、選擇性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性俱佳的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測的電化學(xué)傳感器,如研究可替代MIPs的廉價材料、改良核酸適配體篩選方法以降低識別元件成本等研究;改善電化學(xué)免疫傳感器的儲藏環(huán)境及制備條件,以保持識別元件的生物活性,增強(qiáng)其貯藏穩(wěn)定性、延長保質(zhì)期,進(jìn)一步提高其在食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測的應(yīng)用潛力。(2)篩選、研究新的可提高電化學(xué)性能的材料或方法,以避免或降低由材料帶來的對電化學(xué)傳感器檢測的不利影響;(3)電化學(xué)傳感器檢測方法的系統(tǒng)化、功能化研究,開發(fā)適宜的樣品前處理方法配合電化學(xué)傳感器對實(shí)時、在線、現(xiàn)場快速檢測的需求,并配合儀器制造,將高選擇性、高靈敏度的電化學(xué)傳感器轉(zhuǎn)變?yōu)樽詣踊?、多功能化的自動檢測電化學(xué)分析儀器。