李芳芳,王艷麗,李潔,陳倩倩,田其燕,陳克云,鞠香,趙發(fā),張卉,劉艷明

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(肉及肉制品監(jiān)管技術(shù)),山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心,山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心,山東 濟(jì)南,250101)

植物油在人們生活中所占的比例日益增加,其質(zhì)量安全至關(guān)重要。目前,國(guó)內(nèi)植物油產(chǎn)量增長(zhǎng)緩慢,需依靠國(guó)外進(jìn)口來(lái)彌補(bǔ)植物油產(chǎn)需的缺口。國(guó)內(nèi)外對(duì)植物油中農(nóng)藥殘留問(wèn)題的關(guān)注程度日益增加,各個(gè)國(guó)家對(duì)其最高殘留限量要求也有所不同。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定在食用植物油及油料作物中允許使用敵敵畏、甲基對(duì)硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥,禁止使用嘧啶磷、抑草磷等農(nóng)藥。對(duì)于我國(guó)已經(jīng)禁止使用的部分有機(jī)磷農(nóng)藥,其他國(guó)家及組織對(duì)其制定了最高殘留限量。比如韓國(guó)制定了嘧啶磷在花生中的最高殘留限量,歐盟制定了滅蚜磷在芝麻籽、大豆等農(nóng)作物中的最高殘留限量。

植物油基質(zhì)復(fù)雜,對(duì)其農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)需進(jìn)行一定的樣品前處理以減少基質(zhì)干擾。現(xiàn)有前處理技術(shù)主要為固相萃取法、液液萃取法、凝膠滲透色譜法、分散固相萃取和QuEChERS[1-6]。這些前處理方式普遍存在溶劑消耗量大、分析時(shí)間長(zhǎng)、成本高、對(duì)環(huán)境不友好等弊端。隨著綠色化學(xué)理念的推廣,2006年,REZAEE等[7]創(chuàng)造性發(fā)明了分散液液微萃取技術(shù)(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)。該技術(shù)使用微量有機(jī)試劑就可實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物的高效提取和富集,綠色環(huán)保、簡(jiǎn)單快捷、節(jié)約成本。目前,DLLME技術(shù)已被成功應(yīng)用于鄰苯二甲酸酯[8-9]、農(nóng)藥殘留[10-13]、多環(huán)芳烴[14-15]以及食品添加劑[16]的測(cè)定。

農(nóng)藥殘留常規(guī)前處理技術(shù)有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-21]。氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然定性定量準(zhǔn)確,但存在儀器造價(jià)高、耗材昂貴等問(wèn)題,在一般生產(chǎn)企業(yè)及基層實(shí)驗(yàn)室推廣比較困難。氣相色譜儀的配套設(shè)備價(jià)格低,普適性強(qiáng),有利于食品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)的常規(guī)應(yīng)用。

本研究擬結(jié)合DLLME新型前處理技術(shù)和氣相色譜-火焰光度檢測(cè)器(gas chromatography-flame photometric detector, GC-FPD)專(zhuān)一性的優(yōu)勢(shì),建立測(cè)定植物油中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法可以精確、快速地分析植物油中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留含量,對(duì)保障食用者的安全有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

敵敵畏、甲基對(duì)硫磷、嘧啶磷、滅蚜磷、乙拌磷、丙蟲(chóng)磷、滅菌磷、毒死蜱、抑草磷、三唑磷、硫丙磷(質(zhì)量濃度均為100 mg/L),北京曼哈格生物科技有限公司;甲醇、正己烷、三氯甲烷、丙酮、甲苯、乙腈、二氯甲烷(dichloromethane, CH2Cl2)、1,1,2-三氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)(均為色譜純),德國(guó)Merck公司;氯化鈉(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2030氣相色譜儀配置火焰光度檢測(cè)器系統(tǒng),日本島津公司;冷凍離心機(jī),德國(guó)Sigma公司;渦旋混合器,德國(guó)IKA公司;Milli-Q去離子水制備器,美國(guó)Millipore公司;電子天平,美國(guó)塞多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別用刻度吸量管移取0.1 mL的11種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于同一10 mL容量瓶,用CH2Cl2定容至刻度。配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4 ℃保存。使用時(shí)根據(jù)實(shí)際工作稀釋成不同濃度的混合工作標(biāo)液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 樣品提取

選取玉米油樣品進(jìn)行分析測(cè)定。稱(chēng)取樣品1 g(精確至0.01 g),加入2 mL正己烷,渦旋2 min。加入2 mL DMF進(jìn)行提取,渦旋2 min,將DMF層移入15 mL離心管中備用。

1.3.2.2 DLLME

將樣品提取中的0.9 mL DMF提取液和260 μL CH2Cl2混合,加入到含有1 mL去離子水的15 mL離心管中。將離心管渦旋60 s,然后離心2 min(6 000 r/min),用微量注射器取出CH2Cl2層于進(jìn)樣瓶中,進(jìn)行GC-FPD分析。

1.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

稱(chēng)取空白樣品,按1.3.2節(jié)前處理過(guò)程制備空白基質(zhì)溶液?；|(zhì)效應(yīng)(matrix effects,ME)的計(jì)算如公式(1)所示?；|(zhì)效應(yīng)結(jié)果為負(fù)值、0、正值分別表示基質(zhì)抑制效應(yīng)、無(wú)基質(zhì)效應(yīng)、基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),且絕對(duì)值越大表明基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)[22]。

(1)

1.3.4 色譜條件

色譜柱:DB-1(30 m×0.53 mm, 1.50 μm);柱流量:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;不分流進(jìn)樣;升溫程序:起始溫度為100 ℃,保持2 min,以6 ℃/min升至210 ℃,不保持,以5 ℃/min升至250 ℃,保持10 min;載氣:氮?dú)?進(jìn)樣口溫度:250 ℃;檢測(cè)器溫度:300 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Origin 9.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

由于植物油樣品脂肪含量高,基體干擾大,對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)必須除去干擾才能獲得高的靈敏度和準(zhǔn)確性。本文為了避免油脂對(duì)檢測(cè)的干擾,先將樣品中的目標(biāo)物提取到有機(jī)試劑中,再結(jié)合DLLME來(lái)進(jìn)一步凈化分析。

2.1 樣品提取條件優(yōu)化

2.1.1 溶解試劑的選擇

正己烷對(duì)油脂含量高的樣品溶解度較大,本文選其作為溶解試劑。為了更好地溶解樣品,需要對(duì)正己烷體積進(jìn)行優(yōu)化,研究了1～5 mL體積正己烷對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)選擇正己烷體積為2 mL時(shí),所有目標(biāo)物的提取效率最高。

2.1.2 提取劑的選擇

本研究樣品提取步驟中的提取劑起到承上啟下的作用,一方面從植物油中提取出目標(biāo)物,另一方面作為下一步DLLME中的分散劑,所以它的選擇尤為重要。提取試劑的選擇有以下原則:a)對(duì)目標(biāo)物有較強(qiáng)的提取能力;b)與目標(biāo)物有良好的分離能力;c)能使DLLME中的萃取劑均勻分散在樣品溶液中。綜合考慮,本研究分別選取乙腈、DMF、丙酮和甲醇作為提取劑。結(jié)果表明(圖1-a),當(dāng)選用丙酮時(shí),它能與正己烷混溶,無(wú)法分層;選擇甲醇作為提取劑時(shí),基線(xiàn)波動(dòng)比較大,并且目標(biāo)物回收率相對(duì)不高;選擇DMF和乙腈作為提取劑時(shí),基線(xiàn)都較穩(wěn)定,DMF組目標(biāo)物的回收率高于乙腈組,另外,DMF在DLLME步驟與萃取劑和水的混溶性更好,更易形成穩(wěn)定的乳濁液體系,因此選擇DMF作為樣品提取步驟的提取試劑。

a-提取劑種類(lèi);b-提取劑體積圖1 樣品提取步驟中提取劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig.1 Effect of extractant on recovery of target substance in sample extraction step

為了研究DMF體積對(duì)提取結(jié)果的影響,分別使用不同體積(1、2、3、4 mL)的DMF進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明(圖1-b),當(dāng)DMF體積小于2 mL時(shí),樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥的提取率隨提取試劑體積的增大而逐漸增大,其原因?yàn)镈MF體積太小時(shí)不能將有機(jī)磷農(nóng)藥充分提取。當(dāng)DMF體積大于2 mL時(shí),不同體積的DMF對(duì)提取效率的影響相差不大。選取DMF的提取體積為2 mL。

2.2 DLLME萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑的選擇

萃取劑需滿(mǎn)足:a)對(duì)目標(biāo)物有較強(qiáng)的萃取能力;b)不易溶于水;c)易溶于分散劑[23]。本研究分別選取甲苯、1,1,2-三氯乙烷、CH2Cl2、三氯甲烷作為萃取劑。研究表明(圖2-a),CH2Cl2對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的萃取效果最好,主要原因是CH2Cl2的極性較大,對(duì)極性相對(duì)較大的有機(jī)磷農(nóng)藥的選擇性強(qiáng),因此選擇CH2Cl2為萃取劑。

a-萃取劑種類(lèi);b-萃取劑體積圖2 DLLME中萃取劑對(duì)回收率的影響Fig.2 Effects of extraction solvent in the DLLME step

萃取劑體積直接決定了DLLME的萃取效率,研究了不同體積(60、100、140、180、220、260、280、300、320 μL)的CH2Cl2對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的萃取效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-b所示,當(dāng)CH2Cl2體積小于260 μL時(shí),有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率與CH2Cl2的體積成正相關(guān),但當(dāng)CH2Cl2體積逐漸增大到320 μL時(shí),各分析物的回收率與其成負(fù)相關(guān),因此CH2Cl2的體積選擇260 μL。

2.2.2 分散劑的選擇

由2.1.2節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,DMF在樣品提取步驟對(duì)目標(biāo)物有較強(qiáng)的提取能力,在DLLME中又能使CH2Cl2在樣品溶液中很好的分散。因此,選擇DMF作為DLLME中的分散劑。

DMF體積決定了CH2Cl2在樣品水溶液中的分散及萃取效率,在0.7～1.1 mL DMF內(nèi)研究了DMF體積對(duì)萃取效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,在0.7～0.9 mL時(shí),萃取效率與DMF體積呈正相關(guān),反映出CH2Cl2在樣品水溶液中的分散性更好,更易形成均勻的小液滴,提取更充分;而在0.9～1.1 mL時(shí),萃取效率與DMF體積呈負(fù)相關(guān),這是因?yàn)楫?dāng)DMF體積過(guò)大時(shí),有機(jī)磷農(nóng)藥可能在分散劑中的溶解度會(huì)增大,進(jìn)而導(dǎo)致CH2Cl2的萃取效率降低。因此選擇DMF體積為0.9 mL。

圖3 DLLME中DMF體積對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of the volume of DMF on the recovery of pesticides obtained from DLLME

2.2.3 鹽效應(yīng)的選擇

由于離子強(qiáng)度作用,在提取溶液中加入適量的無(wú)機(jī)鹽會(huì)有利于增大目標(biāo)物在有機(jī)相中的溶解度。本研究考察了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%、5%、10%、15%、20%)的氯化鈉對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥萃取效率的影響。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象發(fā)現(xiàn):隨著氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,最后取出的萃取劑體積會(huì)逐漸增大,而且分散劑、水、萃取劑三者形成的渾濁體系也逐漸變澄清。結(jié)果表明,鹽濃度的增大并不一定能增大目標(biāo)物在有機(jī)相中的溶解度,有機(jī)磷農(nóng)藥的萃取效率與鹽濃度呈負(fù)相關(guān),原因可能是鹽效應(yīng)使目標(biāo)物和萃取劑在水中的溶解度同時(shí)減小,使得萃取劑與水形成的小液滴減少,因此導(dǎo)致萃取效率降低[24]。另外,鹽效應(yīng)還有可能會(huì)增大水的黏度,不利于目標(biāo)物在水中的傳質(zhì)[25]。綜合以上原因,氯化鈉對(duì)提高萃取效率無(wú)積極作用,因此選擇不添加氯化鈉。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限

由表1中基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果可知,植物油基質(zhì)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的萃取回收率產(chǎn)生一定影響。為降低植物油基質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的干擾,用空白基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL),按1.3.4節(jié)色譜分析條件進(jìn)行測(cè)定。采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法,分別以信噪比為3和10得到方法的檢出限(limits of detection,LOD)和定量限(limits of quantification,LOQ)[22]。結(jié)果如表1所示,在0.01～1.00 μg/mL內(nèi),所有目標(biāo)物線(xiàn)性關(guān)系均良好,相關(guān)系數(shù)為0.999 1～0.999 7,表明所建立方法適合分析植物油中的11種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。

表1 11種農(nóng)藥的線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)Table 1 Linear ranges, correlation coefficients, limits of detection, limits of quantification, and matrix effects for 11 pesticides

2.3.2 方法準(zhǔn)確度和精密度

在空白玉米油樣品中添加目標(biāo)物進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),分別添加0.01、0.10、0.50 mg/kg 3個(gè)濃度水平,每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果如表2所示。11種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率為75.6%～116.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為1.6%～8.7%。

表2 方法的回收率和精密度 (n=6)Table 2 Recoveries and RSDs for the developed method (n=6)

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定和方法驗(yàn)證

采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)17批植物油(玉米油、花生油、大豆油)實(shí)際樣品進(jìn)行分析測(cè)定,在所有樣品中均未檢出有機(jī)磷農(nóng)藥?；ㄉ秃痛蠖褂椭?.01 mg/kg和0.10 mg/kg濃度的回收率和RSD結(jié)果如表3 所示,回收率為78.2%～112.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～6.8%。結(jié)果表明,該方法對(duì)實(shí)際樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥的測(cè)定具有適用性和有效性,花生油空白基質(zhì)和其加標(biāo)的色譜圖如圖4。

表3 十一種有機(jī)磷農(nóng)藥在花生油和大豆油中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 Recoveries and RSDs of peanut oil and soybean oil spiked with 11 organophosphorus pesticides at different concentrations (n=3)

1-敵敵畏;2-乙拌磷;3-甲基對(duì)硫磷;4-毒死蜱;5-嘧啶磷;6-滅蚜磷;7-丙蟲(chóng)磷;8-丙菌磷;9-抑草磷;10-三唑磷;11-硫丙磷a-質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;b-加標(biāo)水平為0.01 mg/kg空白花生油樣品;c-空白花生油樣品圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白花生油樣品及空白花生油樣品的GC-FPD色譜圖Fig.4 Chromatograms of GC/FPD from mix standards, blank peanut oil spiked with mix standards and blank peanut oil

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)考察了前處理過(guò)程中樣品提取條件和DLLME條件對(duì)回收率的影響,建立了分散液液微萃取技術(shù)與氣相色譜-火焰光度檢測(cè)器相結(jié)合測(cè)定植物油中11種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度較高,并且簡(jiǎn)單快捷、有機(jī)試劑用量低以及對(duì)環(huán)境綠色環(huán)保,有利于在基層實(shí)驗(yàn)室展開(kāi)工作,為市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)對(duì)植物油中有機(jī)磷等農(nóng)藥的快速監(jiān)測(cè)分析提供技術(shù)支持。