周慧雨,牛立云,劉慧蒙,陳廣瑞,孟志云,甘慧,顧若蘭,吳卓娜,楊雯婕,竇桂芳,*

1(河南大學(xué) 藥學(xué)院,河南 開封,475004)2(中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院,北京,100850) 3(浙江藍(lán)美生物技術(shù)有限公司,浙江 諸暨,311899)

在造酒工業(yè)蓬勃發(fā)展的影響下,飲酒已成為當(dāng)今人們普遍的一種社交娛樂的方式。根據(jù)調(diào)查顯示,我國酒精性肝病的發(fā)病率正在逐年增長[1]。長期酗酒不僅會導(dǎo)致脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化,嚴(yán)重的甚至還會發(fā)展成肝硬化和肝癌,嚴(yán)重危害人們的身體健康[2]。急性酒精性肝損傷是指在短期內(nèi)大量飲酒,肝臟無法及時分解的酒精在體內(nèi)經(jīng)一系列反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),破壞肝臟氧化還原平衡,從而造成氧化損傷[3]。目前臨床上對急性酒精性肝損傷的治療方法主要為戒酒、營養(yǎng)支持和藥物輔助治療,療效一般,并且藥物介入后往往會產(chǎn)生不良反應(yīng)[4]。近年來,人們對藥食兩用天然活性成分的研究越來越深入,其具有的抗氧化活性的天然成分在酒精性肝病的治療中起到越來越重要的作用。

藥食同源成分指的是既可以作為食品供人們?nèi)粘Ｊ秤?又能夠當(dāng)作藥品用于預(yù)防和治療疾病的活性成分,是保健食品開發(fā)的重要原料[5]。這些成分通常具有多種藥理活性,日常食用有助于人們的身體健康。藥食同源成分具有安全性高、來源廣泛的優(yōu)點,因此具有開發(fā)成新型藥品的潛力。

基于實驗室前期調(diào)研,本研究將藍(lán)莓花青素、杜仲雄花茶、米糠脂肪烷醇以及γ-氨基丁酸這4種成分作為研究對象。已有大量研究指出這4種成分具有降血壓[6]、降血脂[7]、改善睡眠[8]等多種藥理功效,也有文獻(xiàn)指出這4種活性成分均具有保護(hù)肝臟、增進(jìn)肝臟功能的作用[9],已被列為新資源食品。藍(lán)莓花青素、杜仲雄花茶粉和γ-氨基丁酸還具有良好的抗氧化活性[10]。米糠脂肪烷雖不具有抗氧化活性[11],但作為一種膳食添加劑,具有緩解疲勞、恢復(fù)體力的功效[12],有利于醉酒后的醒酒,與其他3種天然活性成分聯(lián)合使用時,起到協(xié)同作用。因此推測這4種成分的聯(lián)合服用,具有較好的急性酒精性肝損傷保護(hù)作用。

本研究首先通過體外抗氧化實驗進(jìn)行了處方優(yōu)化,隨后構(gòu)建急性酒精性肝損傷小鼠模型,通過計算肝臟指數(shù),測定血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)的含量,檢測肝臟組織中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)活性,結(jié)合HE染色等指標(biāo)共同說明了該復(fù)方對于急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

γ-氨基丁酸、藍(lán)美1號藍(lán)莓花青素、杜仲雄花茶粉、米糠脂肪烷醇,浙江藍(lán)美生物技術(shù)有限公司;SOD測定試劑盒、MDA測定試劑盒、GSH-PX測定試劑盒,南京建成有限公司;52°紅星二鍋頭,北京某物美超市、DPPH、ABTS,美國GLPBIO;抗壞血酸,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;過硫酸鉀,北京試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra MAX190酶標(biāo)儀,美國Molecular Devices公司;日立7180全自動生化分析儀,日本日立公司;3K15低溫高速離心機(jī),美國Sigma公司;Milli-Q超純水系統(tǒng)A10,美國Millipore公司;恒溫培養(yǎng)箱,公私合營國光醫(yī)療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物

8周齡Balb/c小鼠,雄,體重20～22 g,北京科宇動物養(yǎng)殖中心,合格證號:SCXK(京)2017-0005。飼養(yǎng)在軍事醫(yī)學(xué)研究院動物房中,飼養(yǎng)溫度(20±5) ℃,濕度(50±5)%,12 h光暗交替,在此期間,小鼠自由飲水和攝食。動物飼養(yǎng)條件符合實驗動物倫理委員會的要求。

1.3.2 處方優(yōu)化

樣品的配制:分別稱取一定質(zhì)量的藍(lán)美1號藍(lán)莓花青素、杜仲雄花茶粉、γ-氨基丁酸,藍(lán)莓花青素、γ-氨基丁酸和杜仲雄花茶粉按照質(zhì)量濃度比例(下同)A:1∶1∶1、B:1∶2∶1、C:1∶1∶2、D:1∶2∶2、E:2∶1∶1、F:2∶1∶2、G:2∶2∶1配制成1 mg/mL 的儲備液備用,藍(lán)莓花青素(H)、γ-氨基丁酸(I)和杜仲雄花茶粉(K)同樣配制成1 mg/mL的儲備液備用。

DPPH自由基清除能力的測定:將各比例的樣品儲備液用超純水稀釋成50 μg/mL的工作液。將抗壞血酸配制成10、15、20、25、30、35、40 μg/mL的梯度溶液,作為陽性對照。100 μL 0.5 mmol/L DPPH溶液和100 μL樣品混勻后,37 ℃避光孵育30 min。在517 nm處測吸光度,記為A1;超純水作為空白對照,測吸光度記為A0;用超純水代替DPPH溶液,測吸光度記為A2,按照公式(1)計算DPPH自由基清除率:

(1)

ABTS陽離子自由基清除能力的測定:將各比例的樣品儲備液稀釋成100 μg/mL的工作液。用0.1 mmol/L PBS緩沖溶液配制7 mmol/L的ABTS陽離子自由基溶液和4.9 mmol/L的過硫酸鉀溶液。將ABTS陽離子自由基溶液與過硫酸鉀溶液等體積混合避光反應(yīng)14 h后,得ABTS陽離子自由基溶液母液。將抗壞血酸配制成50、60、70、80、90、100 μg/mL的梯度溶液,作為陽性對照。

用0.1 mmol/L PBS緩沖液稀釋ABTS陽離子自由基母液20倍,得ABTS陽離子自由基工作液。20 μL的樣品溶液與200 μL ABTS陽離子自由基工作液混勻后,在734 nm波長處測吸光度,記為A1;用20 μL超純水代替樣品測吸光度,記為A0;用0.1 mmol/L PBS緩沖溶液代替ABTS陽離子自由基工作液測吸光度值,記為A2,按照公式(2)計算ABTS陽離子自由基清除率:

(2)

1.3.3 酒精致大鼠肝損傷模型的建立

所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為4組(n=6),空白對照組、模型組、低劑量組(藍(lán)莓花青素:110 mg/kg;γ-氨基丁酸:52.5 mg/kg;杜仲雄花茶粉:52.5 mg/kg;米糠脂肪烷醇:52.5 mg/kg)、高劑量組(藍(lán)莓花青素:175 mg/kg;γ-氨基丁酸:87.5 mg/kg;杜仲雄花茶粉:87.5 mg/kg;米糠脂肪烷醇:87.5 mg/kg)。給藥組按照給藥劑量進(jìn)行一日2次的灌胃,每隔12 h灌胃一次,空白對照組和模型組在同一時間灌相同體積的水,連續(xù)給藥7 d。從第8天開始,模型組和給藥組開始造模。造模方法為:給各小鼠灌52°的白酒,灌胃劑量為12 mL/kg,一日灌胃2次,每隔12 h灌胃1次,空白對照組繼續(xù)灌水,連續(xù)造模3 d。在最后一次灌胃結(jié)束過夜后,將小鼠處死。

1.3.4 肝臟指數(shù)的測定

稱量小鼠的體重后頸椎脫臼法處死,處死后將完整的肝臟取出,于生理鹽水中清洗,用吸水紙擦干水分后進(jìn)行稱重,按公式(3)計算肝臟指數(shù):

(3)

1.3.5 血清血生化指標(biāo)檢測

小鼠摘眼球取血于離心管中靜置后,4 000 r/min、4 ℃,離心10 min取上清液,用于血清中AST和ALT的檢測。

1.3.6 肝臟組織病理切片及氧化指標(biāo)檢測

取各小鼠左下肝葉的同一部位的肝臟放在4%組織固定液中進(jìn)行固定,經(jīng)洗滌脫水,石蠟包埋并切片,HE染色后制成切片置于顯微鏡下觀察。將剩余的肝臟制成10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的肝臟勻漿,4 000 r/min、4 ℃,離心10 min后,取上清液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SOD活性檢測:根據(jù)說明書一次加入待測的組織勻漿上清與相應(yīng)的試劑,混勻后于37 ℃反應(yīng)20 min,于450 nm處按照公式(4)和公式(5)測吸光度:

(4)

式中:A對照,對照品的吸光度;A對照空白,空白對照品的吸光度;A測定,待測樣品的吸光度;A測定對照,待測樣品對照品的吸光度。

SOD活力/(U/mg prot)=

(5)

MDA含量的檢測:根據(jù)試劑盒的說明書,依次加入相應(yīng)的試劑和待測樣品,于95 ℃水浴鍋中加熱40 min,冷卻后4 ℃,4 000 r/min離心。取上清液測532 nm處的吸光度值。按照公式(6)計算MDA含量:

(6)

式中:待測OD,待測樣品的吸光度;標(biāo)準(zhǔn)OD,標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度;空白OD,空白對照的吸光度;C,標(biāo)準(zhǔn)品濃度,nmol/mL。

GSH-PX活性檢測:根據(jù)試劑盒的說明書,將待測樣品與相應(yīng)的試劑混合均勻后于37 ℃反應(yīng)5 min,離心取上清液后再按照說明書中步驟依此加入相應(yīng)的試劑混勻,室溫靜置15 min后,于412 nm處測吸光度。

按照公式(7)計算GSH-PX活力:

GSH-PX活力/(U/mL)=

(7)

式中:對照OD,對照品的吸光度;待測OD,待測樣品的吸光度;標(biāo)準(zhǔn)OD,標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度;空白OD,空白對照的吸光度;n,稀釋倍數(shù);t,反應(yīng)時間,h;V,取樣量,mL;C1,標(biāo)準(zhǔn)品濃度,μmol/mL;C2,肝臟組織蛋白濃度,mg prot/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 處方優(yōu)化

DPPH自由基清除能力:通過抗壞血酸的吸光度計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線,將樣品的吸光值帶入抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線中,即可得到各樣品的維生素C當(dāng)量值,結(jié)果如圖1所示。

圖1 各比例樣品DPPH自由基清除能力的維生素C當(dāng)量值Fig.1 Vitamin C equivalent value of DPPH radical scavenging ability in various proportions of samples注: A組與其他組相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,圖2同。

結(jié)果顯示,當(dāng)藍(lán)莓花青素∶γ-氨基丁酸∶杜仲雄花茶粉為2∶1∶1時,DPPH自由基的清除率最高。

ABTS陽離子自由基清除能力:通過抗壞血酸的吸光度計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線,將各比例樣品的吸光度帶入抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線中,即可得到各樣品的維生素C當(dāng)量值,結(jié)果如圖2所示。

圖2 各比例樣品ABTS陽離子自由基清除能力的維生素C當(dāng)量值Fig.2 Vitamin C equivalent value of ABTS cationic free radical scavenging ability in various proportions of samples

結(jié)果顯示,當(dāng)藍(lán)莓花青素∶γ-氨基丁酸∶杜仲雄花茶粉為2∶1∶1時,對ABTS陽離子自由基的清除率最高。

因此,選擇藍(lán)莓花青素∶γ-氨基丁酸∶杜仲雄花茶粉為2∶1∶1作為后續(xù)動物實驗的處方比例。同時在處方中再加入一定比例的米糠脂肪烷醇,目的是與其他3種成分聯(lián)合使用以達(dá)到協(xié)同作用。

2.2 肝臟指數(shù)

各組小鼠的肝臟指數(shù)如圖3所示,模型組小鼠的肝臟指數(shù)較空白組相比顯著升高(P<0.001),給藥組的肝臟指數(shù)較模型組顯著下降(P<0.001)。

圖3 四種藥食同源組合物對各組小鼠的肝臟指數(shù)的影響Fig.3 Effects of four medicine food homologous compositions on liver index in each group of mice注:模型組與空白組相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001;給藥組與模型組相比,#表示P<0.05,##表示P<0.01,###表示P<0.001,下同。

2.3 血清中血生化指標(biāo)

圖4為4種藥食同源天然活性成分對各組小鼠血清中AST和ALT的含量影響。與空白對照組相比,模型組小鼠的AST、ALT含量都顯著增加(P<0.001),給藥組的2種酶含量顯著低于模型組,高劑量組降低更為明顯(P<0.001)。

A-AST;B-ALT圖4 四種藥食同源組合物對各組小鼠血清中AST和ALT含量的影響Fig.4 Effects of four medicine food homologous compositions on serum AST and ALT contents in each group of mice

2.4 肝臟組織中氧化指標(biāo)

肝臟中氧化程度指標(biāo)的結(jié)果如圖5所示,模型組小鼠肝臟組織中的SOD和GSH-PX的活性較空白組小鼠肝臟組織中的顯著降低(P<0.001),MDA含量顯著上升(P<0.001)。與模型組相比,給藥組小鼠肝臟組織中的MDA含量較模型組顯著下降(P<0.001),SOD活性和GSH-PX活性顯著上升(P<0.001),高劑量組更為明顯。

A-SOD活性;B-MDA含量;C-GSH-PX活性圖5 四種藥食同源組合物對各組小鼠肝臟組織中SOD活性、MDA含量和GSH-PX活性的影響Fig.5 Effects of four medicine food homologous compositions on SOD activity, MDA content, and GSH-PX activity in liver tissues of mice in each group

2.5 肝臟病理切片結(jié)果

病理學(xué)檢測可通過HE染色直接觀察肝臟組織受損的具體情況。結(jié)果如圖6所示,空白對照組小鼠肝細(xì)胞大小未見改變,肝臟組織未見異常,而模型組小鼠肝細(xì)胞間排列紊亂,出現(xiàn)了大量空泡變性的肝細(xì)胞,局部可見炎性細(xì)胞灶性浸潤,部分肝細(xì)胞出現(xiàn)了輕度脂肪變性。相對于模型組,低劑量組小鼠肝臟組織內(nèi)肝細(xì)胞內(nèi)可見空泡,但并沒有觀察到炎性細(xì)胞灶性浸潤,高劑量組小鼠肝組織的受損情況極大好轉(zhuǎn)。

A-空白對照組;B-模型組;C-低劑量組;D-高劑量組圖6 四種藥食同源組合物對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of four medicine food homologous compositions on liver tissue structure in mice with acute alcoholic liver injury

3 結(jié)論與討論

本研究首先通過體外抗氧化實驗進(jìn)行處方優(yōu)化,結(jié)果顯示,當(dāng)藍(lán)莓花青素∶γ-氨基丁酸∶杜仲雄花茶粉比例為2∶1∶1時,在體外具有最好的抗氧化效果。此外,米糠脂肪烷醇雖不具有抗氧化的活性,但可調(diào)節(jié)肝臟中氧化應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)酶[13],從而達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。并且,米糠脂肪烷還具有緩解疲勞、恢復(fù)體力的作用[14],將其作為膳食添加劑加入到復(fù)方中,更有助于醉酒后的醒酒及體力恢復(fù)、緩解宿醉帶來的不適感,與其他3種成分聯(lián)合服用可以起到協(xié)同作用。

本研究構(gòu)建了急性酒精性肝損傷小鼠模型,通過多指標(biāo)來評估該復(fù)方的肝保護(hù)效果。肝臟指數(shù)是用于反映肝臟腫大程度的指標(biāo)[15]。模型組肝臟指數(shù)較空白組明顯升高,表明造模成功。給藥組肝臟指數(shù)與模型組相比顯著降低,表明該復(fù)方可以減輕短期內(nèi)大量飲酒引起的肝水腫。當(dāng)肝臟受到損傷時,肝細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞,細(xì)胞通透性增加,存在于肝細(xì)胞中的AST和ALT釋放到血液中,血清中這2種酶的含量激增,因而2種酶是臨床上用于評價肝臟損傷及損傷程度的標(biāo)志性酶[16]。模型組AST和ALT含量與空白對照相比,顯著增高,表明模型組小鼠肝臟受到了損傷,建模成功;給藥組2種酶指標(biāo)降低,說明該復(fù)方可以緩解酒精引起的肝臟AST和ALT的含量升高現(xiàn)象。MDA是體內(nèi)重要的脂質(zhì)過氧化物之一[17],是由機(jī)體產(chǎn)生的ROS攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,從而引起脂質(zhì)過氧化作用,最終形成的脂質(zhì)過氧化物。檢測MDA含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度,間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD能夠清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基,其活力高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力[18]。GSH-PX是機(jī)體廣泛存在一種重要的催化過氧化氫分解的酶,可特異催化還原性谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng),起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[19]。本研究中采用這3項指標(biāo)來評價肝臟的氧化程度。模型組肝臟組織中這3項指標(biāo)的結(jié)果說明模型組的小鼠肝臟組織受到了氧化損傷,給藥組結(jié)果顯示該復(fù)方可以通過抗氧化途徑緩解肝臟的氧化損傷。HE染色的結(jié)果顯示,相較于模型組,給藥組的肝臟受損情況得到極大改善。進(jìn)一步說明復(fù)方中這4種藥食同源天然活性成分的聯(lián)合預(yù)防服用對于急性酒精性肝損傷具有良好的保護(hù)作用。

以上結(jié)果共同說明了該復(fù)方對急性酒精性肝損傷具有較好的保護(hù)作用。因此,服用藥食同源天然活性成分用于急性酒精性肝損傷的治療與預(yù)防是一種新的研究方向,為酒精性肝病的治療提供了新的思路,同時也為藥食同源天然活性成分的廣泛應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。