陳黃曌,石曼曼,高露露,李玲,程安琪,李雅欣,常永瑤,潘春梅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品與生物工程學院,河南 鄭州,450046)

2021年我國葡萄種植面積、葡萄酒產(chǎn)量和消費量,分別達到78.3萬hm2(世界第3)、5.9×109L(世界第11)和10.5×109L(世界第6)[1]。雖然近年來我國釀酒葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛,但各產(chǎn)區(qū)主栽品種嚴重趨同且與環(huán)境因素聯(lián)系不足的情況仍舊不可忽視。針對上述問題,國內(nèi)主要從釀酒葡萄育種和引進種選育兩方面入手并持續(xù)開展相關(guān)科研工作。在育種方向,2010—2020年,我國共培育出葡萄新品種124個,但釀酒葡萄新品種僅有17個,在實際生產(chǎn)中因缺乏配套栽培技術(shù)也未得到有效推廣利用[2];相比之下,引種選育實用性更高,目前研究側(cè)重點主要集中于引進種在引入地適應性的展現(xiàn)程度方面,主要涉及物候期、植物學性狀、抗病性和果實基礎(chǔ)理化指標的調(diào)查分析[3-6],但與果實品質(zhì)和釀酒特性指標相關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)性研究比較缺乏[7-8]。

然而,以葡萄和葡萄酒酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性為核心的果實品質(zhì)和釀酒特性指標才是紅色釀酒葡萄品種選育的指示性指標[9-10]。首先,對于紅色釀酒葡萄而言,果皮中富含以類黃酮類物質(zhì)(花色苷、黃烷醇和縮合單寧等)為代表的多酚類物質(zhì),它們通過浸漬作用轉(zhuǎn)移至發(fā)酵醪液,對于葡萄酒的感官價值(顏色和口感等)貢獻極大[11]。其次,多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化活性,長期飲用葡萄酒能夠有效阻止心血管疾病、糖尿病和癌癥的發(fā)生[12]。

現(xiàn)階段,釀酒葡萄引進種選育工作主要開展于西部省份[3,5-8],黃河故道產(chǎn)區(qū)幾乎是空白的,但該產(chǎn)區(qū)擁有的種質(zhì)資源優(yōu)勢卻是得天獨厚的,產(chǎn)區(qū)內(nèi)的中國農(nóng)科院鄭州果樹所國家葡萄資源圃保存有超過1 400余份葡萄種質(zhì)資源[13],能夠有效提供最基礎(chǔ)也是最核心的種質(zhì)資源保障?；谏鲜龇治?本試驗于2020年葡萄果實成熟期普查了資源圃內(nèi)釀酒葡萄區(qū)各品種的病害程度、結(jié)實性和果實成熟度,確定了8個表現(xiàn)優(yōu)良的紅色釀酒葡萄引進種(S.8746、卡爾曼希、黑后、黑多內(nèi)、黑謝希、CH5、凱番西亞、Seyal Noir),并對上述引進種和參照品種(赤霞珠)的果實品質(zhì)以及篩選品種和參照品種葡萄酒釀造特性指標進行檢測分析,旨在篩選出與黃河故道產(chǎn)區(qū)風土因素更吻合的紅色釀酒葡萄引進種,不僅能夠為本土釀酒葡萄栽培發(fā)掘新的種質(zhì)資源,還可以為引種推廣種植并釀造高品質(zhì)葡萄酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料分兩部分:第一部分為2020年9月上旬在中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所葡萄種質(zhì)資源圃采集的8個歐亞種紅色釀酒葡萄引進種(S.8746、卡爾曼希、黑后、黑多內(nèi)、黑謝希、CH5、凱番西亞、Seyal Noir)和參照品種(赤霞珠)的成熟期果實。

河北懷來產(chǎn)區(qū)是我國最早認定的優(yōu)質(zhì)葡萄酒原料生產(chǎn)基地,主栽品種為赤霞珠。次年第二部分試驗材料除了以黑多內(nèi)(篩選品種)葡萄和鄭州本土赤霞珠葡萄經(jīng)小容器發(fā)酵釀造的葡萄酒外,還增加了以河北懷來赤霞珠葡萄釀制的葡萄酒用于對比。

1.2 試劑與儀器

沒食子酸、蘆丁、兒茶素等標準品,美國Sigma公司;福林酚、甲基纖維素、3-[4-(二甲基氨基)苯基]-2-丙烯醛[4-(dimethylamino)cinnamaldehyde,p-DMACA]和DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪[2,4,6Tri(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ]等核心試劑,上海源葉生物科技有限公司;小容器葡萄酒發(fā)酵使用的Lallzyme Ex果膠酶和Lalvin RC 212商業(yè)釀酒酵母,法國拉曼公司。

Evolution 220紫外可見分光光度計,美國ThermoFisher;ALPHA 1-2 LD plus 冷凍干燥機,德國Marin Christ;3-18KS臺式高速冷凍離心機,德國SIGMA;ZDJ-4B自動電位滴定儀,中國LICHEN。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備果皮提取液

果實手動剝皮,凍干36 h,液氮保護下磨粉,參考CHEN等[14]的方法制備提取液,用于酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性指標的檢測。

1.3.2 小容器葡萄酒發(fā)酵

將除梗破碎的葡萄醪導入10 L玻璃發(fā)酵罐,添加輔料(亞硫酸和Lallzyme Ex果膠酶)并接種活化后的活性干酵母(Lalvin RC 212商業(yè)酵母)[15]。酒精發(fā)酵過程中,發(fā)酵溫度控制在(25±1) ℃并監(jiān)控比重變化,當醪液比重連續(xù)2 d穩(wěn)定在0.992～0.995且殘?zhí)腔芈渲? g/L以內(nèi),酒精發(fā)酵結(jié)束,皮渣分離,將原酒分裝后-20 ℃凍存[16]。每品種3罐釀造重復。

1.3.3 基礎(chǔ)理化指標測定

果實化學指標(可溶性固形物、滴定酸、pH值并計算固酸比)、物理指標(果實橫徑、縱徑,單粒果重,單粒皮重并計算皮果比)和葡萄酒基礎(chǔ)參數(shù)(殘?zhí)?、滴定酸、酒精度和揮發(fā)酸)的測定分別參考江雨等[17]和LI等[18]的方法。

1.3.4 酚類物質(zhì)含量測定

果皮和葡萄酒中的總酚、總類黃酮、縮合單寧、總黃烷醇和總花色苷含量測定分別采用福林-肖卡法、亞硝酸鹽-氯化鋁法、甲基纖維素法、香草醛-鹽酸法和pH示差法,以紫外可見分光光度計在特定波長測定反應試液吸光值并代入標準方程[14-15]。各種物質(zhì)含量均以各自等價物(總酚-沒食子酸;總類黃酮-蘆丁;原花青素和總黃烷醇-兒茶素;總花色苷-花青素單糖苷)衡量,果實和葡萄酒酚類物質(zhì)含量結(jié)果分別以mg等價物/g果皮干重和mg等價物/L葡萄酒表示。

1.3.5 抗氧化活性指標測定

果皮和葡萄酒的DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率,羥自由基清除率和銅離子還原力測定參考CHENG等[12]和劉金串等[19]的方法。清除率以%表征,果實和葡萄酒的銅離子還原力分別以mg trolox/g果皮干重和μmol trolox/L葡萄酒表示。

1.3.6 果實顏色指標測定

將果汁離心過濾膜,利用紫外可見分光光度計,以蒸餾水為對照,分別檢測420、520、620 nm處吸光值。果汁顏色指標包含A420、A520、A620、CI(飽和度)和T(色調(diào)),其中CI=A420+A520+A620,T=A420/A520[20]。

1.3.7 葡萄酒感官評價

感官評價打分表由外觀、香氣和口感3類一級評價指標組成,分別占比20%、40%和40%,各類一級指標下設(shè)置若干項二級評價指標,共計10項,總分100分[21]。由12名專業(yè)品評人員(4男8女,20～40歲)組成的感官評價小組對3款葡萄酒進行盲品打分,共進行3輪,每人每項二級指標評分以平均分計,之后統(tǒng)計一級指標得分和總分。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以SPSS 20.0進行單因素方差分析(ANOVA),用Duncan法進行多重比較,P<0.05 表示差異達到顯著水平,以Word 365和Origin 2018分別繪制三線表和柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實品質(zhì)指標

2.1.1 果實基礎(chǔ)理化指標

由表1可知,卡爾曼希、黑后、黑謝希、凱番西亞和Seyal Noir果實橫、縱徑均大于對照赤霞珠果實,證明果實體積更大,其中卡爾曼希果實橫、縱徑處于最高水平,分別為17.51、17.13 mm;而黑多內(nèi)、S.8746和CH5果實橫、縱徑均小于對照赤霞珠,果粒更小,前2個品種同處最低水平,分別為12.44、12.93 mm和12.78、12.40 mm。8個引進種中除了黑多內(nèi)和S.8746 外,單粒果重均大于對照赤霞珠,其中卡爾曼希處于最高水平,達到3.06 g,比赤霞珠高111.03%,而S.8746果重最小,為1.33 g,是赤霞珠果重的91.72%。除CH5和黑后的單粒皮重與對照赤霞珠處于同一水平外(0.17～0.18 g),其他6個引進種單粒皮重均顯著高于對照赤霞珠,Seyal Noir的單粒皮重處于最高水平,達到0.33 g,比對照赤霞珠果實高94.12%。黑多內(nèi)和S.8746的皮果比顯著高于對照赤霞珠(0.12),同為0.18,比赤霞珠高50.12%,其余引進種均低于赤霞珠,卡爾曼希最低,僅有0.07,是赤霞珠的41.67%。

表1 九種紅色釀酒葡萄果實物理指標Table 1 Physical parameters of nine varieties of red grapevine berries

由表2可知,CH5果實可溶性固形物含量最高,為26.7 °Brix,處于20～25 °Brix的有5個品種,依次為:卡爾曼希(24.7 °Brix)>黑謝希(24.3 °Brix)>Seyal Noir(23.9 °Brix)>S.8746(22.7 °Brix)>黑多內(nèi)(21.2 °Brix),20 °Brix以下的有3個品種,對照赤霞珠最低,僅有17.1 °Brix。S.8746、Seyal Noir、黑多內(nèi)和卡爾曼希果實滴定酸含量均顯著高于對照赤霞珠(4.3 g/L),S.8746最高,達到6.4 g/L,比赤霞珠高48.84%,剩余引進種果實滴定酸含量處于同水平且低于對照赤霞珠,均在3 g/L附近。Seyal Noir、黑多內(nèi)和S.8746果實的pH顯著低于對照赤霞珠,前者最低,為3.42;其余5個引進種果實pH均高于赤霞珠,除黑謝希外均達到顯著水平,黑后和卡爾曼希果實pH顯著高于其他3個品種,分別為4.38和4.35。Seyal Noir和赤霞珠果實固酸比同處最低水平,僅有3.8和3.9,其他引進種果實固酸比均高于對照赤霞珠,CH5果實固酸比最高,達到8.6,是赤霞珠的121.51%。

表2 九種紅色釀酒葡萄果實化學指標Table 2 Chemical parameters of nine varieties of red grapevine berries

釀酒葡萄果實越小、皮果比越大,果實表面積體積比、果皮占比越大,單位體積葡萄原料酚類物質(zhì)含量越高,釀造優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒潛力越大[22]。大多數(shù)成熟期釀酒葡萄果實可溶性固形物含量在20～25 °Brix,在此范圍內(nèi)隨著果實可溶性固形物含量上升,釀酒酵母細胞膜因滲透勢升高將逐步延遲酒精發(fā)酵啟動,當可溶性固形物含量達到25～30 °Brix,酒精發(fā)酵提前終止的可能性大幅度上升[23]。黑多內(nèi)果粒小、皮果比大,可溶性固形物含量適中,發(fā)酵效率更高。赤霞珠(參照品種)在黃河故道產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)一般,果實可溶性固形物含量和固酸比均處于最低水平,成熟度欠佳。

2.1.2 果皮酚類物質(zhì)含量

釀酒葡萄果皮中的類黃酮物質(zhì)是酚類物質(zhì)的主要組成部分,兩者在果皮中的相對含量具有較大相關(guān)性[24]。由表3可知,黑多內(nèi)、黑后、CH5和凱番西亞果皮中總酚和總類黃酮含量均顯著高于對照赤霞珠,在4個品種中黑多內(nèi)均處于最高水平,分別為103.17、21.92 mg/g,比赤霞珠高83.78%和102.92%?？s合單寧和黃烷醇同屬兒茶素類物質(zhì),對葡萄酒苦澀感以及陳年能力影響較大[14]。黑多內(nèi)、黑后、CH5、S.8746和凱番西亞果皮中縮合單寧含量均高于對照赤霞珠,前2個品種達到顯著水平,黑多內(nèi)處于最高水平,達到79.17 mg/g,比赤霞珠高127.54%。在不同品種果皮總黃烷醇含量對比分析中,僅有黑多內(nèi)高于赤霞珠且達到顯著水平(5.91 mg/g),比赤霞珠高72.45%。Seyal Noir果皮中總酚、總類黃酮、縮合單寧和總黃烷醇含量均顯著低于對照赤霞珠和其他引進種。葡萄果皮中花色苷含量對葡萄酒的顏色呈現(xiàn)貢獻最大[16],8個釀酒葡萄引進種果皮總花色苷含量均高于對照赤霞珠,除卡爾曼希外都達到顯著水平,含量最高的品種為黑后(31.77 mg/g),其次是CH5(23.65 mg/g)、S.8746(22.68 mg/g)和黑多內(nèi)(18.30 mg/g),剩余品種含量都在10 mg/g以內(nèi),赤霞珠含量最低,僅有1.72 mg/g。

表3 九種紅色釀酒葡萄果皮酚類物質(zhì)含量 單位:mg/g 果皮干重

黑多內(nèi)葡萄果皮酚類物質(zhì)含量豐富,這和黑多內(nèi)果實高皮果比是相符的[9]。對照組赤霞珠葡萄果皮中各酚類物質(zhì)含量與該產(chǎn)區(qū)前人研究結(jié)果是可比的[17],但赤霞珠作為晚熟品種,果實生長發(fā)育周期長,而黃河故道產(chǎn)區(qū)夏季降水較多,病害嚴重,采收時間早,導致果皮中酚類物質(zhì)積累受限,尤其對于在果實轉(zhuǎn)色后才開始合成積累的花色苷來說影響最大。

2.1.3 果實抗氧化活性指標

由表4可知,黑多內(nèi)、黑后和S.8746果實DPPH清除率顯著高于對照赤霞珠,黑多內(nèi)處于最高水平,達到30.27%,比赤霞珠高87.86%,Seyal Noir處于最低水平,僅有7.74%,剩余品種DPPH自由基清除率分布在12%～17%,且各品種間差異不大。各品種果實ABTS陽離子自由基清除率存在較大差異,黑多內(nèi)、黑謝希、CH5和凱番西亞顯著高于對照赤霞珠,黑多內(nèi)處于最高水平,達到67.34%,其他3個品種處于同一水平,分布在35%～39%,卡爾曼希和黑后同處最低水平,僅有6.02%和3.74%。有別于DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率分析結(jié)果,凱番西亞的羥自由基清除率處于最高水平,達到22.85%,其次是對照赤霞珠(18.38%)和黑多內(nèi)(16.18%),黑后最低,僅有9.74%,其他品種果實羥自由基清除率分布在10%～15%。黑多內(nèi)、黑后、CH5和凱番西亞果實銅離子還原力均顯著高于對照赤霞珠,黑多內(nèi)處于最高水平,達到33.86 mg/g,比赤霞珠高69.52%,S.8746和卡爾曼希處于與赤霞珠處于同水平,Seyval Noir和卡爾曼希同處最低水平,分別為12.87 mg/g和14.34 mg/g。

表4 九種紅色釀酒葡萄果實抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of nine varieties of red grapevine berries

抗氧化劑能夠通過氧化自身而保護機體細胞免遭自由基中間體傷害,具有良好的食品營養(yǎng)價值,而葡萄果皮中的酚類物質(zhì)是葡萄果實和葡萄酒中最主要的抗氧化劑來源[12]。黑多內(nèi)葡萄更優(yōu)的抗氧化活性表現(xiàn)和果皮中含量較高的酚類物質(zhì)相關(guān),這和針對地中海地區(qū)7種釀酒葡萄果皮植物化學活性成分與抗氧化活性關(guān)聯(lián)分析結(jié)果是一致的[25]。

2.1.4 果實顏色指標

表5展示了9種紅色釀酒葡萄果汁顏色指標。A420、A520、A620數(shù)值分別與果汁的黃色、紅色和藍色色調(diào)相關(guān),對照組赤霞珠均處于最低水平,分別為0.43、0.66和0.10,而黑后、黑多內(nèi)、CH5和S.8746三個波長吸光值均處于較高水平,尤其是A520,4個品種同處最高水平,證明它們的果汁顏色更偏紅色色調(diào),與之相符,上述品種果實CI值同樣處于較高水平。果汁的高CI值和低T值與高品質(zhì)葡萄酒存在較大關(guān)聯(lián)[20],在4個品種中黑多內(nèi)果汁T值最低。

表5 九種紅色釀酒葡萄果汁顏色指標Table 5 Chromatic indexes of grape juices of nine red grapevine varieties

2.2 葡萄酒釀酒特性指標

2020年通過對黃河故道產(chǎn)區(qū)8個紅色釀酒葡萄引進種和參照品種(赤霞珠)成熟期果實品質(zhì)指標的比較分析,結(jié)果表明黑多內(nèi)葡萄果粒小、皮果比高,果汁可溶性固形物含量適中且色彩飽和度高,果皮酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性指標均處于較高水平,具備釀造高品質(zhì)葡萄酒的果實品質(zhì)特征。在此基礎(chǔ)上,2021年以鄭州果樹所黑多內(nèi)葡萄、本土和河北懷來赤霞珠葡萄為原料進行小容器葡萄酒釀造,進一步比較3款葡萄酒釀酒特性指標。

2.2.1 葡萄酒基礎(chǔ)指標

由表6可知,黑多內(nèi)和河北懷來赤霞珠葡萄酒酒精體積分數(shù)和滴定酸分處高位,達到11.21%和4.97 g/L,河南鄭州赤霞珠葡萄酒兩指標均最低,僅有8.39%和2.19 g/L。3款葡萄酒殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸含量均符合GB 15037—2006《葡萄酒》理化要求,證明發(fā)酵過程控制嚴密,酒精發(fā)酵徹底且酒體健康狀況良好。

表6 葡萄酒樣品基礎(chǔ)理化指標Table 6 General oenological parameters of wine samples

2.2.2 葡萄酒酚類物質(zhì)和抗氧化活性指標

由圖1可知,黑多內(nèi)葡萄酒5種酚類物質(zhì)(總酚、總類黃酮、縮合單寧、總黃烷醇和總花色苷)含量分別為1276.04、314.27、220.48、114.10、162.00 mg/L,比河南鄭州赤霞珠葡萄酒高了150.53%、151.46%、15.73%、143.21%和392.17%,均達到顯著水平;河北懷來赤霞珠葡萄酒各酚類物質(zhì)含量與前人研究結(jié)果基本一致[26],總酚含量與黑多內(nèi)葡萄酒相比略高但差異不顯著,總類黃酮和總黃烷醇含量顯著低于黑多內(nèi)葡萄酒,分別是其含量的59.6%和84.0%,但河北懷來赤霞珠葡萄酒縮合單寧和總花色苷含量更高且達到顯著水平,分別是黑多內(nèi)葡萄酒含量的1.15倍和1.21倍。在抗氧化指標對比分析中,黑多內(nèi)葡萄酒銅離子還原力在3款葡萄酒中處于最高水平,達到1 384.98 μmol trolox/L,分別是河北懷來和河南鄭州赤霞珠葡萄酒的1.28倍和1.53倍。

圖1 葡萄酒樣品酚類物質(zhì)含量和銅離子還原力Fig.1 Phenol contents and CUPRAC of wine samples注:同一指標不同小寫字母表示不同品種間存在顯著差異(P<0.05)。

2.2.3 葡萄酒感官評價

由表7可知,黑多內(nèi)和河北懷來赤霞珠葡萄酒感官評價總分分別為77.08分和73.07分,而河南鄭州赤霞珠葡萄酒整體表現(xiàn)不佳,總分僅有60.41分,處于最低水平。黑多內(nèi)和河北懷來赤霞珠葡萄酒10項二級評價指標得分基本都在7分以上,前者果香突出、口感醇厚,其香氣濃郁度、持續(xù)性(8.61分),口感延續(xù)性、層次感(8.23分)和口香品質(zhì)、余味(8.52分)得分處于最高水平。本土赤霞珠葡萄酒澄清度得分略低(6.48分),可能和葡萄原料健康程度相關(guān)[27],酒體顏色整體偏桃紅,呈現(xiàn)淡粉色,顏色評分處于最低水平,僅有5.04分,這和本土赤霞珠葡萄酒低花色苷含量相關(guān);嗅覺感受單一,香氣4項二級評價指標得分都在6分上下,均處于低水平,其中濃郁度、持續(xù)性得分最低,僅有5.66分;而低酒精度、低酸度和低酚類物質(zhì)含量直接導致酒體口感寡淡[28],其中平衡度、協(xié)調(diào)性(5.64分)和口感品質(zhì)、余味(5.88分)的感官評分均在6分以下。

表7 葡萄酒樣品感官評價得分Table 7 Organoleptic evaluation scores of wine samples

3 結(jié)論

在針對黃河故道產(chǎn)區(qū)8種紅色釀酒葡萄引進種果實品質(zhì)指標對比分析中,黑多內(nèi)表現(xiàn)最優(yōu):果粒小、皮果比高,含糖量適中,果皮總酚、總類黃酮、總黃烷醇和縮合單寧含量均處于最高水平,果實DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率和銅離子還原力顯著高于其他品種;在葡萄酒釀酒特性指標分析中,黑多內(nèi)葡萄酒在酚類物質(zhì)含量、抗氧化活性和感官質(zhì)量上全面優(yōu)于本土赤霞珠葡萄酒,與河北懷來赤霞珠葡萄酒相較,同樣可比且部分指標(總類黃酮、總黃烷醇含量,銅離子還原力和感官質(zhì)量)表現(xiàn)更優(yōu)。黑多內(nèi)作為在8個紅色釀酒葡萄引進種中與黃河故道產(chǎn)區(qū)風土因素匹配度最高的品種,具備在當?shù)赝茝V種植并釀造優(yōu)質(zhì)干紅葡萄酒的潛力。