戴卿印,陸運(yùn)龍,黃茜,秦志永*

1(廣西大學(xué) 資源環(huán)境與材料學(xué)院,廣西 南寧,530004) 2(有色金屬及材料加工新技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧,530004)

花生,一年生豆科草本植物[1],世界上第二大重要的豆類作物和第四大食用油料作物,是油脂和蛋白質(zhì)的主要來(lái)源?；ㄉt衣含有多種多酚化合物(酚酸、類黃酮和二苯乙烯),如各種花青素和原花青素等,具有降血糖、清除自由基、促進(jìn)血小板生成、降血脂等多種生理功能[2],同時(shí)還具有強(qiáng)化毛細(xì)血管、促進(jìn)血液循環(huán)的功效,有助于提高視力、改善關(guān)節(jié)的靈活性、增強(qiáng)心臟活力,預(yù)防大腦病變等作用[3-4]。研究表明其中的多酚化合物有可能成為未來(lái)膳食補(bǔ)充劑和功能性成分的可持續(xù)來(lái)源[5],應(yīng)用在各種食品和制藥領(lǐng)域[6]。盡管花生紅衣有這些有益的特性,但它仍然是一種未得到充分利用的自然資源,更多地只是將這種副產(chǎn)品作為動(dòng)物飼料來(lái)使用。為了提高花生多酚在增強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性和感官特性以及延長(zhǎng)加工食品保質(zhì)期方面的潛力,需要進(jìn)行更多的研究來(lái)開(kāi)發(fā)有效的提取工藝。

許多研究發(fā)現(xiàn)采用固-液提取技術(shù)(浸漬、超聲、索氏提取和熱回流)和不同的有機(jī)溶劑對(duì)花生紅衣的提取率較高,主要是因?yàn)闅滏I作用可以提高酚類物質(zhì)的提取效率[7]。超聲波法具有提取率高、提取時(shí)間短,操作簡(jiǎn)便、成本低、產(chǎn)物易純化、設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)[8-9],被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物及生物活性物質(zhì)提取等領(lǐng)域[10-11]。響應(yīng)面法(response surface method,RSM)是一種評(píng)估多個(gè)因素及其相互作用對(duì)一個(gè)或多個(gè)響應(yīng)變量的影響的有效方法,該方法用于工藝優(yōu)化,可獲得最優(yōu)的工藝因素條件[12]。雖然花生紅衣的一些化合物已經(jīng)被鑒定出來(lái),但許多仍是未知的,這是因?yàn)椴煌崛》椒ā⑻崛?、工藝都?huì)影響其化合物的產(chǎn)率及種類,花生紅衣酚類提取物的活性強(qiáng)弱受其酚類物質(zhì)含量的影響[13]。此外,對(duì)于花生紅衣提取物對(duì)各類細(xì)菌的抑菌抗菌性能以及抗氧化性能的研究并不深入。

本試驗(yàn)采用RSM法探究了花生紅衣多酚的最佳提取條件,優(yōu)化了料液比、溶劑濃度、溫度和時(shí)間等工藝參數(shù);并通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用儀鑒定了花生紅衣中主要的物質(zhì)成分,最后測(cè)定了花生紅衣提取物的總酚含量、抗氧化特性,并對(duì)4種革蘭氏陽(yáng)(陰)細(xì)菌的抑菌抗菌性能進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生紅衣,安徽省昊州某供應(yīng)商;磷酸緩沖液(pH=6.8)、乙醇(分析純)、甲醇(HPLC級(jí))、福林酚(分析純)、沒(méi)食子酸(分析純)、DPPH(分析純)與ABTS(分析純)等試劑,上海麥克林公司;Mueller-Hinton(MH)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸埃希氏菌(ATCC25922)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(ATCC14028)與單增李斯特菌(ATCC191115),廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

040S超聲波清洗儀,深圳利興隆有限公司;96孔板,南通試驗(yàn)器材有限公司;LBI-375-N細(xì)菌培養(yǎng)箱,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;JIDI-20D高速離心機(jī),廣州吉迪儀器有限公司;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮儀器有限公司;UV-2450紫外分光光度計(jì)儀,日本島津公司;AGILENT 6460液質(zhì)聯(lián)用儀,美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 花生紅衣提取物(peanut scarlet extractive,PSE)的制備

將花生紅衣磨碎后,過(guò)120目篩網(wǎng),稱取5 g花生紅衣粉末浸泡于80%乙醇溶液6 h(料液比值為0.05 g/mL);采用超聲清洗儀輔助提取40 min(超聲溫度60 ℃);采用高速離心機(jī)離心10 min(6 000 r/min),使用0.22 μm的水系濾膜除去雜質(zhì),利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收提取液中的乙醇溶液,冷凍干燥后,獲得PSE,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PSE的提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 超聲時(shí)間對(duì)總多酚提取率的影響

超聲提取時(shí)間分別為20、40、60、80、100 min;超聲溫度為30 ℃,料液比值固定為0.07 g/mL。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定PSE中總多酚含量。

1.3.2.2 超聲溫度對(duì)總多酚提取率的影響

設(shè)置超聲清洗儀的溫度分別為30、40、50、60、70 ℃;超聲時(shí)間固定為30 min,料液比值固定為0.05 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定PSE中總多酚含量。

1.3.2.3 料液比值對(duì)總多酚提取率的影響

設(shè)置花生紅衣粉末質(zhì)量與70%乙醇溶液的料液比值分別為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 g/mL;超聲溫度固定為40 ℃,超聲時(shí)間固定為40 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定PSE中總多酚含量。

1.3.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總酚提取率的影響

設(shè)置提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%;超聲時(shí)間溫度分別固定為50 min與50 ℃;料液比值固定為0.03 g/mL。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定PSE中總多酚含量。

1.3.3 PSE提取工藝的優(yōu)化

基于單因素試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果,總酚含量為效應(yīng)值,利用RSM對(duì)超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比值以及乙醇體積分?jǐn)?shù)等4個(gè)因素進(jìn)行3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析,每組試驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示,通過(guò)Design-Expert 13軟件的Box Behnken設(shè)計(jì)設(shè)定RSM試驗(yàn)因子水平值,確定花生紅衣提取物最佳工藝條件。

1.3.4 PSE粗提率的測(cè)定

PSE中的總多酚含量(total polyphenols content, TPC)參照MUNOZ等[14]方法并稍作修改,將PSE超聲溶解于無(wú)水乙醇溶液中,將該溶液、福林酚試劑和20% Na2CO3溶液以不同比例混合在10 mL容量瓶中,常溫避光反應(yīng)40 min后,用紫外分光光度計(jì)(波長(zhǎng)為760 nm)測(cè)定PSE的TPC,PSE中的TPC以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示(mg/g)[15]。PSE的粗提率(E,%)計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:m1為提取前花生紅衣的質(zhì)量,mg;m2為提取后花生紅衣的質(zhì)量,mg。

1.3.5 PSE中生物活性成分的測(cè)定

參照J(rèn)AEGER等[16]的方法稍作修改,將所得PSE超聲溶解于甲醇溶液(1 mg/L)中,采用液質(zhì)聯(lián)用儀(柱溫30 ℃,流速0.3 mL/min),對(duì)PSE的化學(xué)組成進(jìn)行定性分析。其中流動(dòng)相A為乙腈溶液,流動(dòng)相B為甲醇溶液;按梯度洗脫,進(jìn)樣量15 μL,運(yùn)行時(shí)間10 min。

1.3.6 PSE自由基清除性的計(jì)算

PSE溶解于無(wú)水乙醇中,配制質(zhì)量濃度分別為500、250、125、62.5、31.25 μg/mL的PSE提取溶液,取其上清液0.5 mL與5 mL的DPPH溶液混合(DPPH配制成0.1 mmol/L的乙醇溶液),避光反應(yīng)1 h,采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品在517 nm處的吸光度,復(fù)合膜的DPPH清除活性的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:Acontrol為空白對(duì)照組的吸光度;Asample為試驗(yàn)組的吸光度。

為了測(cè)定PSE的ABTS陽(yáng)離子自由基清除效果,取0.737 mL ABTS的甲醇溶液(7.4 mmol)和1.43 mL過(guò)硫酸鉀水溶液(2.6 mmol)的混合物避光反應(yīng)12 h,將原液用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后,使混合物在734 nm處的吸光度保持在0.7不變;然后將5 mL混合溶液與0.5 mL PSE乙醇溶液混合,避光反應(yīng)10 min,使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定734 nm處的吸光度,復(fù)合膜ABTS清除活性的計(jì)算如公式(3)所示。

(3)

式中:Acontrol為空白對(duì)照組的吸光度;Asample為試驗(yàn)組的吸光度。

1.3.7 PSE的抑菌測(cè)定

1.3.7.1 細(xì)菌培養(yǎng)

選取革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌:金黃色葡萄球菌(S.aureus)和單增李斯特細(xì)菌(L.monocytgenes),革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(E.coli)和鼠傷寒桿沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)作為試驗(yàn)菌株。將上述4種細(xì)菌凍干粉溶解后加入至LB肉湯中,在37 ℃的恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基(MH培養(yǎng)基)中進(jìn)行復(fù)蘇。在后續(xù)接種步驟中,再次使用滅菌后的接種環(huán)將培養(yǎng)基中細(xì)菌接種到LB肉湯(50 mL)中,將培養(yǎng)液振蕩24 h(37 ℃,110 r/min)使其生長(zhǎng)。

1.3.7.2 最小抑菌濃度測(cè)定

選取S.aureus、E.coli、S.typhimurium、L.monocytogenes作為試驗(yàn)菌株,稱取冷凍干燥后的PSE溶解于蒸餾水中。采用二倍稀釋法[17]將PSE溶液質(zhì)量濃度分別稀釋為9.6、4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15 mg/mL;吸取上述500 μL的PSE溶液、25 μL細(xì)菌懸液(菌濃度為105CFU/mL)以及500 μL的LB培養(yǎng)基至96孔板中,以磷酸緩沖液(PBS,pH值為7.4)為陽(yáng)性對(duì)照,不含細(xì)菌懸液和PSE溶液的孔板為陰性對(duì)照,每組試驗(yàn)平行3次,最后將上述孔板放入恒溫振蕩器中(37 ℃,110 r/min)振蕩培養(yǎng)24 h,記錄溶液中細(xì)菌生長(zhǎng)情況。將孔內(nèi)溶液渾濁的樣品編號(hào)記為“+”,表明溶液中有細(xì)菌繁殖;將孔內(nèi)溶液澄清的樣品記為“-”,表明溶液無(wú)細(xì)菌繁殖,并將該樣品濃度記為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)[18]。

1.3.7.3 抗菌活性(瓊脂擴(kuò)散)測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定PSE的抗菌活性,利用PBS(pH值為7.4)溶液將細(xì)菌濃度稀釋至107CFU/mL,用玻璃涂布棒將菌懸液(100 μL)均勻涂布于培養(yǎng)基上,采用鑷子夾取滅菌后的牛津杯平穩(wěn)放置于培養(yǎng)基上,每個(gè)牛津杯注入不同濃度的PSE溶液,最后將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)24 h后,測(cè)量其抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSE提取參數(shù)優(yōu)化(單因素試驗(yàn))

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)PSE中總多酚提取率的影響

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.001～0.006 μg/mL的吸光度具有良好的線性關(guān)系(y=47.94x-0.011,R2=0.997);PSE中的TPC以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示(mg/g)。超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響如圖1-A 所示,當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí),TPC與粗提率值最大,分別為114.25 mg/g,35.86%;隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng),TPC逐漸降低,這是因?yàn)榛ㄉt衣在恒定功率條件下,長(zhǎng)時(shí)間受熱造成提取物中多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞,分解失活[19],降低了提取物的TPC含量。因此,最佳超聲時(shí)間為40 min。

A-超聲時(shí)間;B-超聲溫度;C-料液比;D-乙醇體積分?jǐn)?shù)圖1 單因素試驗(yàn)對(duì)多酚提取率的影響Fig.1 Effect of single factor experiment on the extraction rate of polyphenols

2.1.2 超聲溫度對(duì)PSE中總多酚提取率的影響

如圖1-B所示,當(dāng)溫度<60 ℃時(shí),花生紅衣多酚提取率隨著溫度升高而增加,當(dāng)溫度>60 ℃時(shí),PSE中的TPC為126.82 mg/g,粗提率為34.93%;隨著溫度逐漸增大,其TPC逐漸降低,這是因?yàn)樘崛∪軇┰诟邷貢r(shí)易揮發(fā),PSE中的多酚物質(zhì)易分解造成的[20]。因此最佳超聲溫度為60 ℃。

2.1.3 料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)PSE中總多酚提取率的影響

如圖1-C、圖1-D所示,當(dāng)料液比值為0.05 g/mL時(shí),PSE中的TPC含量最大為122.50 mg/g,粗提率為35.75%;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí),PSE中的多酚提取率最大。因此,選擇料液比值為0.05 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%作為最佳提取工藝參數(shù)。

2.2 PSE的提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化

基于單因素優(yōu)化條件,通過(guò)Design-expert 13軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果(TPC)進(jìn)行分析(表2),優(yōu)化了PSE提取工藝條件,構(gòu)建了PSE多酚提取的模型[21],并對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,所得二次回歸函數(shù)的模型方程為y=134.35+2.27A-0.498B-0.336 7C-0.117 0D+7AB+4.58AC+3.73AD-5.28BC+10.68BD+7.36CD-42.88A2-19.30B2-13.38C2-25.85D2;經(jīng)計(jì)算可得,模型的P值≤0.000 1,說(shuō)明該回歸方程顯著,失擬項(xiàng)為0.052 1(不顯著),回歸系數(shù)R2=0.973 3,表明方程與響應(yīng)值吻合度達(dá)到了95.43%,結(jié)果還表明該函數(shù)方程可對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行良好的評(píng)估和預(yù)測(cè),適合花生紅衣多酚的提取工藝參數(shù)優(yōu)化,其影響因素由大到小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲溫度>超聲時(shí)間>料液比,結(jié)果值預(yù)測(cè)有效。進(jìn)一步優(yōu)化分析可得,花生紅衣提取最佳工藝參數(shù)分別為超聲時(shí)間40 min,超聲溫度60 ℃,料液比值為0.05 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,預(yù)測(cè)提取得到的TPC最大為148.17 mg/g,最小為120.53 mg/g;而實(shí)際測(cè)量值為137 mg/g,與預(yù)測(cè)的平均提取多酚得率偏差1.97%,該結(jié)果表明優(yōu)化后的工藝參數(shù)對(duì)于花生紅衣中多酚的提取具有指導(dǎo)性意義。

表2 制備PSE的Box-Behnken設(shè)計(jì)因子及響應(yīng)值Table 2 The Box-Behnken design factors and response values of PSE

2.3 PSE主要化學(xué)組成

采用LC-MS研究了PSE的主要化學(xué)成分,如圖2 所示。采用Compoud Discoverer 2.1軟件進(jìn)行總峰面積比數(shù)據(jù)(樣品/對(duì)照)對(duì)PSE進(jìn)行化學(xué)組成分析。PSE中主要多酚活性化學(xué)成分為百里香酚[質(zhì)量/電荷比(m/e)7 962.537,保留時(shí)間為10.501 min]和兒茶素(m/e2 607.77,保留時(shí)間為4.714 min);同時(shí)在提取物中還存在對(duì)苯二甲酸(m/e10.416,保留時(shí)間為0.327 min)、龍膽酸(m/e36.168,保留時(shí)間為0.429 min)、紫蘇酸(m/e100.312,保留時(shí)間為11.039 min)、槲皮素(m/e2.341,保留時(shí)間為8.667 min)、4-仲丁酚(m/e43.464,保留時(shí)間為0.429 min)與根匍柄菌素(m/e11.237,保留時(shí)間為16.969 min),以及其他含量較多的糖類脂肪類物質(zhì)。前人報(bào)道發(fā)現(xiàn)紅色花生品種中主要多酚成分為原花青素、兒茶素、沒(méi)食子酸等多酚物質(zhì)[22],而對(duì)黑色花生外皮而言,主要為花青素、阿魏酸和槲皮素等多酚物質(zhì)[23]。這主要是因?yàn)槌巳軇┓N類、濃度、提取方式的影響外,花生種類也是造成化學(xué)組成差異的原因[24]。

A-正離子色譜圖;B-負(fù)離子色譜圖圖2 PSE的色譜圖Fig.2 Chromatogram of PSE

2.4 PSE抗氧化性能

PSE的抗氧化性如圖3所示,隨著PSE濃度增加,對(duì)DPPH自由基的清除率升高,而在相同的測(cè)定濃度范圍內(nèi),高濃度PSE對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率并未有顯著的差異。當(dāng)PSE質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時(shí),PSE對(duì)2種自由基的最大清除率分別為93.93%(DPPH)與99.62%(ABTS),該結(jié)果還表明PSE對(duì)ABTS清除效果優(yōu)于DPPH。這是因?yàn)镻SE中多酚化合物的苯環(huán)上含有大量羥基,可通過(guò)氫原子從活性基團(tuán)上轉(zhuǎn)移到自由基上來(lái)清除自由基;CAO等[25]發(fā)現(xiàn)花生紅衣中的二苯乙烯類化合物反式白藜蘆醇的供氫(或原子脫氫)反應(yīng)是其具有優(yōu)異自由基清除能力的原因。酚羥基在對(duì)位羥基上供氫(或原子脫氫)的反應(yīng),以及苯氧基4位上未配對(duì)的電子與二苯乙烯骨架的π電子之間發(fā)生π共軛效應(yīng),所生成穩(wěn)定半醌自由基,導(dǎo)致了提取物具有較強(qiáng)的自由基清除能力[26]。

A-DPPH自由基清除率;B-ABTS陽(yáng)離子自由基清除率圖3 PSE的DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率Fig.3 The DPPH and ABTS radical scavenging activity of PSE

2.5 PSE最小抑菌濃度與抗菌效果

不同濃度PSE提取物對(duì)4種革蘭氏陽(yáng)(陰)細(xì)菌的最小抑菌濃度如表3所示。

表3 PSE對(duì)4種細(xì)菌的MICTable 3 MIC of PSE to 4 kinds of bacteria

PSE對(duì)S.aureus與S.typhimurium的最小抑菌濃度為1.4 mg/mL;對(duì)E.coli與L.monocytogenes的最小抑菌濃度為2.8 mg/mL。研究表明花生紅衣與花生殼的提取物對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌活性大于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[27],但也有研究報(bào)道花生及其副營(yíng)養(yǎng)物(花生殼、花生紅衣)提取物對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌有更好的抑菌效果[28]。為了進(jìn)一步探究PSE對(duì)細(xì)菌的抑菌效果,采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定了不同濃度PSE的抑菌效果,抑菌直徑如圖4所示,當(dāng)PSE濃度小于MIC時(shí),對(duì)細(xì)菌并未產(chǎn)生任何抑菌效果,隨著PSE的濃度增大,對(duì)細(xì)菌的抑制效果越為明顯,這與MIC結(jié)果一致。抑菌直徑的結(jié)果表明PSE對(duì)4種細(xì)菌的抑菌效果為S.typhimurium>S.aureus>E.coli>L.monocytogenes。

培養(yǎng)皿上的數(shù)字1～6分別代表PSE的質(zhì)量濃度為0.175、0.35、0.7、1.4、2.8、5.6 mg/mLA-S.aureus;B-E.coli;C-S. typhimurium;D-L. monocytogene圖4 不同濃度的PSE對(duì)菌株的抑菌效果Fig.4 The bacteriostatic effects of PSE with different concentrations on strains

3 結(jié)論

花生紅衣多酚提取工藝參數(shù)影響因素由大到小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比,結(jié)果值預(yù)測(cè)有效;最優(yōu)工藝參數(shù)分別為超聲時(shí)間40 min,超聲溫度60 ℃,料液比值為0.05 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,最終提取的TPC為137 mg/g。LC-MS 結(jié)果表明,PSE中多酚活性化學(xué)成分主要為百里酚(m/e7 962.537)和兒茶素(m/e2 607.77)等;PSE對(duì)DPPH與ABTS均具有優(yōu)異的抗氧化能力,當(dāng)PSE質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí),PSE對(duì)2種自由基的最大清除率分別為93.93%(DPPH)與99.62%(ABTS)。PSE對(duì)S.aureus與S.typhimurium的MIC為1.4 mg/mL,對(duì)E.coli與L.monocytogenes的MIC為2.8 mg/mL;瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果表明PSE對(duì)4種細(xì)菌的抑菌效果依次為S.typhimurium>S.aureus>E.coli>L.monocytogenes。