郭更新,贠建民,王彪,趙雨萱,李文輝,屈玉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730070)

麥角甾醇又稱麥角固醇,是真菌細胞膜的關鍵功能成分,對膜結(jié)構(gòu)的完整性、膜的通透性、膜結(jié)合酶的活性、細胞活力以及物質(zhì)運輸?shù)绕鹬匾饔肹1-2]。研究表明麥角甾醇具有多種藥理功能,包括預防心血管疾病、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗炎、利尿等功效[3-4];麥角甾醇是重要的醫(yī)藥化工原料,用于生產(chǎn)可的松、蕓苔素內(nèi)酯、激素黃體酮等類固醇藥物[5];麥角甾醇也是脂溶性維生素D2的前體,經(jīng)紫外線照射后轉(zhuǎn)化為維生素D2[6],可當作飼料添加劑增加畜禽的產(chǎn)蛋率和孵化率。目前,通過微生物發(fā)酵技術制備麥角甾醇的研究已有報道[7],但發(fā)酵產(chǎn)物中麥角甾醇含量低限制了其在相關領域的應用。而采用大型真菌在中草藥液體環(huán)境中發(fā)酵的方法作為一種新型蕈菌發(fā)酵技術,已在該領域得到越來越多學者的關注。

羊肚菌(Morchellaesculenta)是一種藥食兩用的珍稀真菌,富含多糖、多酚、甾醇、脂肪酸、氨基酸、維生素等成分,具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、保肝護腎等功效[8-9],具備進行活性物質(zhì)開發(fā)的潛質(zhì)。近年來我國羊肚菌產(chǎn)業(yè)化發(fā)展迅猛,已研制出飲品、食品以及保健品等相關精深加工產(chǎn)品[10],但其產(chǎn)品的開發(fā)還有很大的空間。由于羊肚菌栽培條件復雜,技術不穩(wěn)定,尚難以真正實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),目前,液體發(fā)酵成為該菌的重要開發(fā)途徑[11]。液體發(fā)酵能提供必需營養(yǎng)物質(zhì)供其生長代謝,且培養(yǎng)條件易控,生產(chǎn)周期短,產(chǎn)量穩(wěn)定,發(fā)酵液和菌絲體營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富,從中提取各類營養(yǎng)成分和活性物質(zhì),制成高附加值的食品、藥品等,能有效緩解子實體資源短缺的問題,且節(jié)約成本,提升生產(chǎn)效率[12-13]。目前,有關羊肚菌液體發(fā)酵產(chǎn)麥角甾醇的研究鮮有報道。

為此,本試驗擬以6種甘肅道地中草藥為試材,探究其對羊肚菌液體發(fā)酵麥角甾醇的影響,試圖通過其協(xié)同作用,篩選出對羊肚菌生長和麥角甾醇產(chǎn)量有促進作用的中草藥種類及適宜添加量,并通過發(fā)酵工藝優(yōu)化,建立羊肚菌在中草藥液體環(huán)境中的發(fā)酵體系,以期提高羊肚菌液體發(fā)酵產(chǎn)麥角甾醇的技術水平,為麥角甾醇在功能性食品和藥品的開發(fā)提供優(yōu)質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:羊肚菌CICC14033,中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

中草藥:黨參、紅芪、甘草、當歸、柴胡、板藍根,蘭州復興厚藥材有限責任公司。

試劑:麥角甾醇標準品,上海源葉生物科技有限公司。

儀器:Agilent 1260高效液相色譜儀,美國安捷倫公司。

1.2 中草藥提取液的制備[14]

分別稱取200 g中草藥,加水600 mL浸泡30 min,然后用文火熬煮30 min,4層紗布過濾,再將藥渣加水400 mL熬煮一遍過濾,將兩遍濾液混合定容到1 L,即制得質(zhì)量濃度為200 g/L的中草藥提取液?？芍鸺壪♂尩玫皆囼炋砑訚舛鹊奶崛∫篬提取液中還原糖含量用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法測定,多糖含量用苯酚-硫酸法測定[15]]。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20。

PDB培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200,葡萄糖20。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、維生素B110 mg、蒸餾水1 L。

中草藥發(fā)酵培養(yǎng)基:在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中,根據(jù)試驗設計情況添加各中草藥提取液的量(中草藥發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖加入量=基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖量-中草藥提取液還原糖的量)。

1.4 中草藥深層發(fā)酵培養(yǎng)

1.4.1 種子液制備

在無菌條件下,將活化好的菌株挑取3塊(0.5 cm×0.5 cm)接種于PDB培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝液量100 mL),置于25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)4 d,即得種子液。

1.4.2 深層發(fā)酵培養(yǎng)

在無菌條件下,將培養(yǎng)好的種子液以8%(體積分數(shù))的接種量接入上述各發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝液量100 mL),置于25 ℃,160 r/min振蕩培養(yǎng)10 d。

1.5 中草藥及添加劑量篩選

參考武忠偉等[16]的方法,將6種供試中草藥提取液分別添加到基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別制成50、100、150、200 g/L質(zhì)量濃度梯度的中草藥發(fā)酵培養(yǎng)基,進行羊肚菌深層發(fā)酵,并以不添加中草藥提取液作為對照組,考察不同中草藥及添加劑量對菌絲體生長和麥角甾醇產(chǎn)量的影響。

1.6 液體發(fā)酵單因素條件篩選

發(fā)酵溫度篩選:在1.5節(jié)最佳中草藥及添加劑量的基礎上,發(fā)酵溫度分別設為20、22、24、26、28、30 ℃。

發(fā)酵時間篩選:在上述試驗優(yōu)化的基礎上,發(fā)酵時間分別設為4、6、8、10、12、14 d。

搖床轉(zhuǎn)速篩選:在上述試驗優(yōu)化的基礎上,轉(zhuǎn)速分別設為120、140、160、180、200 r/min。

分別考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、轉(zhuǎn)速對菌絲體生長和麥角甾醇產(chǎn)量的影響。

1.7 Box-Behnken的中心組合試驗設計

在上述單因素試驗的基礎上,根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理,選取紅芪劑量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為因素,以麥角甾醇產(chǎn)量為響應值,設計3因素3水平響應面試驗,其因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計Table 1 Design of the Box-Behnken experiment

1.8 菌絲體生物量和麥角甾醇產(chǎn)量的測定

1.8.1 生物量測定

將發(fā)酵液在4 ℃、8 000 ×g離心15 min,收集菌絲體,并用蒸餾水洗滌3次,真空冷凍干燥后稱重,生物量計算如公式(1)所示:

(1)

式中:Y為菌絲體生物量,g/L;m為菌絲體干重,g;V為發(fā)酵液體積,L。

1.8.2 麥角甾醇提取[17]

稱取1.0 g菌絲體干粉末,加入30 mL堿-醇溶液(25 g KOH,40 mL蒸餾水,甲醇定容100 mL),超聲浸提1 h(功率400 W,頻率40 kHz),8 000×g離心15 min,上清液用正己烷萃取2次,收集上層液體置于分液漏斗中,加入蒸餾水混勻,待靜置分層后,用pH計測定下層液體pH,直至中性結(jié)束水洗。用真空濃縮儀蒸干正己烷,加無水甲醇定容到25 mL。

1.8.3 麥角甾醇產(chǎn)量測定

采用HPLC測定。取上述麥角甾醇提取液1 mL,用0.22 μm的有機相微孔濾膜過濾后上樣測定。HPLC條件:色譜柱Symmetry?C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為甲醇,等度洗脫,流速1.0 mL/min,檢測波長282 nm,柱溫30 ℃,進樣量5.0 μL。以峰面積外標法對菌絲體中麥角甾醇進行定量分析(本試驗繪制的麥角甾醇標準曲線為y=8.030 9x-7.776 9,R2=0.999 3)。

(2)

式中:Ye為麥角甾醇產(chǎn)量,mg/L;Ce為菌絲體中麥角甾醇含量,mg/g;m為菌絲體干重,g;V為發(fā)酵液體積,L。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,用Design Expert 12軟件進行響應面試驗設計及數(shù)據(jù)處理與分析,并運用Origin 2021進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥中還原糖與多糖含量

由圖1可以看出,中草藥中還原糖與多糖含量各不相同,在試驗設計中,保持了各發(fā)酵培養(yǎng)基中能被羊肚菌速效利用的還原糖含量一致。

圖1 各中草藥還原糖與多糖含量Fig.1 Content of reducing sugar and polysaccharide in various Chinese herbal medicines注:不同小寫字母表示各中草藥還原糖含量差異顯著;不同大寫字母表示多糖含量差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同中草藥提取物對羊肚菌發(fā)酵的影響

2.2.1 不同中草藥提取物中羊肚菌發(fā)酵的外觀性狀

在添加了中草藥提取物的液體發(fā)酵體系中,羊肚菌菌絲體生長狀況和發(fā)酵液外觀性狀存在明顯差異,試驗結(jié)果見附圖1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034406),其具體差異性詳見表2。

表2 羊肚菌在不同中草藥提取物添加下菌絲體特征和發(fā)酵液性狀Table 2 Characteristics of mycelia and fermentation broth of M.esculenta in different Chinese herbal extracts

附圖1 羊肚菌在不同中草藥提取物液體發(fā)酵體系中的外觀特征Fig.S1 Appearance characteristics of M. esculenta in liquid fermentation system of different Chinese herbal extracts

2.2.2 中草藥及添加劑量篩選結(jié)果

由圖2-A和圖2-E可知,在0～150 g/L的中草藥提取物濃度范圍內(nèi),黨參、柴胡對羊肚菌菌絲體生長和麥角甾醇產(chǎn)量的促進作用成劑量關系,且在150 g/L 時達到峰值,菌絲體生物量分別為10.37 g/L、10.42 g/L,與對照組相比分別是對照組的2.77倍、2.79倍,麥角甾醇產(chǎn)量分別為39.48 mg/L和44.63 mg/L,分別是對照組的2.07倍和2.34倍,當添加劑量超過150 g/L時,生物量和麥角甾醇產(chǎn)量均出現(xiàn)下降趨勢,因此確定黨參、柴胡的適宜添加劑量為150 g/L。圖2-B顯示,紅芪提取物的適宜添加劑量為100 g/L,此時羊肚菌菌絲體生物量和麥角甾醇產(chǎn)量最大,分別為10.57 g/L、47.69 mg/L,分別是對照組的2.83倍、2.50倍。由圖2-C～圖2-F可知,甘草、當歸、板藍根提取物在50 g/L的添加劑量下,對菌絲體生長和麥角甾醇產(chǎn)量有一定的促進作用,生物量增幅在42.44%～123.44%,麥角甾醇產(chǎn)量增幅在73.87%～81.51%;當歸和板藍根添加劑量超過50 g/L 時,羊肚菌生長處于完全被抑制狀態(tài),而甘草在100 g/L添加劑量下抑制了羊肚菌生長,當超過100 g/L時完全抑制其生長。

綜上試驗結(jié)果,在供試的6種中藥材中,添加100 g/L紅芪提取物對羊肚菌發(fā)酵麥角甾醇產(chǎn)量的促進作用最為顯著,故選取紅芪提取物作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基,開展后續(xù)羊肚菌深層發(fā)酵工藝響應面優(yōu)化試驗。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵溫度對羊肚菌發(fā)酵紅芪提取物的影響

由圖3-A可知,在20～30 ℃,羊肚菌在100 g/L紅芪提取液中發(fā)酵所得到的菌絲體生物量,隨著發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當溫度為26 ℃時,菌絲體生物量和麥角甾醇產(chǎn)量均達到峰值,分別為10.33 g/L和47.96 mg/L。因此,其適宜發(fā)酵溫度為26 ℃。

A-發(fā)酵溫度;B-發(fā)酵時間;C-轉(zhuǎn)速圖3 不同發(fā)酵溫度、時間、轉(zhuǎn)速對羊肚菌菌絲體生物量和麥角甾醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different fermentation temperature, time, and shaking speed on mycelial biomass and ergosterol yield of M.esculenta

2.3.2 發(fā)酵時間對羊肚菌發(fā)酵紅芪提取物的影響

由圖3-B可知,羊肚菌在100 g/L紅芪提取液中,發(fā)酵初期菌絲體生長速度較緩,從第6天起菌絲體快速生長,在第10天時,菌絲體生物量和麥角甾醇產(chǎn)量均達到峰值,分別為10.63 g/L和48.37 mg/L,此后隨著發(fā)酵時間的延長,菌絲體生物量和麥角甾醇產(chǎn)量均保持相對穩(wěn)定。因此,其適宜發(fā)酵時間為10 d。

2.3.3 搖床轉(zhuǎn)速對羊肚菌發(fā)酵紅芪提取物的影響

由圖3-C可知,在120～160 r/min的搖床轉(zhuǎn)速下,菌絲體生物量和麥角甾醇產(chǎn)量呈現(xiàn)上升趨勢,在160～200 r/min的轉(zhuǎn)速下,菌絲體生物量和麥角甾醇產(chǎn)量均比較高,各處理組間差異不顯著(P>0.05),在180 r/min時,麥角甾醇產(chǎn)量最大為48.51 mg/L。因此,其適宜轉(zhuǎn)速選擇為180 r/min。

2.4 響應面試驗分析

2.4.1 響應面回歸模型的建立與檢驗

按照Box-Behnken中心組合試驗方案開展試驗,各組麥角甾醇產(chǎn)量見表3。經(jīng)多元回歸擬合模型對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理,得到回歸方程為:麥角甾醇產(chǎn)量=56.88-2.07A-0.979 3B+2.88C+0.339 8AB+3.64AC-0.182 6BC-7.44A2-6.26B2-3.57C2。

表3 Box-Behnken試驗設計及其結(jié)果Table 3 Design and results of the Box-Behnken tests

方差分析見表4,本回歸模型有明顯的差異顯著性(P<0.01),失擬項無顯著差異(P=0.420 4),其中R2=0.985 8,RAdj2=0.967 6,說明該模型有較好的擬合度?；貧w方程中一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2差異顯著(P<0.05),表明羊肚菌在深層發(fā)酵產(chǎn)麥角甾醇的過程中,紅芪劑量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對麥角甾醇產(chǎn)量具有顯著影響,其影響順序為C>A>B,即發(fā)酵時間>紅芪劑量>發(fā)酵溫度;交互項AC的P值為0.000 4,表明麥角甾醇產(chǎn)量受到紅芪劑量和發(fā)酵時間交互作用的顯著影響,交互項AB、BC的P值大于0.05,表明麥角甾醇產(chǎn)量不受紅芪劑量和發(fā)酵溫度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間交互作用的顯著影響。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

由圖4可知,AB、BC交互作用圖坡度較緩且等高線為圓形,表明紅芪劑量和發(fā)酵溫度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的交互作用對麥角甾醇產(chǎn)量影響不顯著;AC交互作用等高線為橢圓形且響應面坡度較陡,表明紅芪劑量和發(fā)酵時間的交互作用對麥角甾醇產(chǎn)量影響顯著。這一結(jié)果與方差分析結(jié)果完全一致。

A-AB交互作用;B-AC交互作用;C-BC交互作用圖4 發(fā)酵條件交互作用圖Fig.4 Interaction diagram of fermentation conditions

2.4.2 最佳發(fā)酵工藝參數(shù)的確定及回歸模型的驗證

通過軟件分析得到羊肚菌發(fā)酵紅芪提取物產(chǎn)麥角甾醇的最佳工藝為紅芪劑量97.60 g/L,發(fā)酵溫度25.83 ℃,發(fā)酵時間10.76 d,接種量8%,轉(zhuǎn)速180 r/min,麥角甾醇最大預測產(chǎn)量為57.52 mg/L。結(jié)合實際操作的可行性,調(diào)整發(fā)酵溫度為26 ℃,發(fā)酵時間為11 d,在此條件下進行5組平行試驗,得到麥角甾醇實際產(chǎn)量均值為59.16 mg/L,與預測值相對誤差小于5%,表明預測值和實際值之間擬合性良好。

3 討論

發(fā)酵是利用微生物的生長代謝或生物催化反應體系,獲得菌體本身或其代謝產(chǎn)物的過程,通過一定的技術手段選擇菌種和控制發(fā)酵工藝,可以實現(xiàn)目標產(chǎn)物的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[18]。微生物發(fā)酵技術因其反應特異性強、反應條件溫和、副產(chǎn)物少、安全性高、清潔高效等優(yōu)點[19],在傳統(tǒng)食品發(fā)酵、抗生素醫(yī)藥和功能性食品行業(yè)中都占據(jù)了重要地位,在生物活性藥物生產(chǎn)領域的應用也越來越廣泛[20]。

在添加中藥材的微生物發(fā)酵體系中,由于中草藥含有多種活性成分(生物堿、皂苷、黃酮、多糖等),其中某些成分可能對微生物的生長代謝及活性物質(zhì)的產(chǎn)生有促進或抑制作用,微生物在中草藥特殊環(huán)境中可能改變自身的代謝途徑,從而產(chǎn)生新的活性物質(zhì)或改變各活性物質(zhì)間比例[21]。羊肚菌代謝產(chǎn)物可能與中草藥中某些有效成分發(fā)生協(xié)同增效作用,使羊肚菌在中草藥提取物的環(huán)境中加速生成麥角甾醇的產(chǎn)量,并增加其生物活性,從而具有更強的預防、保健或治療功效[22]。

麥角甾醇是真菌細胞膜上的主要固醇分子,其生物合成途徑是多種酶參與的復雜代謝過程,至少涉及到15種酶的參與、23步反應以及25個結(jié)構(gòu)基因,相關酶活性的高低以及相關基因的表達量都影響著麥角甾醇的合成代謝[23]。本研究結(jié)果表明,在黨參、紅芪、柴胡3種中草藥的協(xié)同作用下,其能夠顯著促進菌絲體生長和麥角甾醇產(chǎn)量積累,證實這3種中草藥提取物中有效成分對羊肚菌麥角甾醇合成代謝產(chǎn)生了增效作用,可能與麥角甾醇合成途徑的相關酶活性提高有關,或作為前體物質(zhì)促進了麥角甾醇生物合成。工藝優(yōu)化后的驗證試驗表明,羊肚菌在紅芪提取物中發(fā)酵麥角甾醇的產(chǎn)量為59.16 mg/L,這一結(jié)果與杜嬌[24]對猴頭菌發(fā)酵麥角甾醇產(chǎn)量57.77 mg/L的結(jié)果接近;但與戴肖東等[25]篩選到一株野生猴頭菇菌株液體發(fā)酵麥角甾醇產(chǎn)量21.51 mg/L相比,產(chǎn)量提高了175.03%,與羅立津等[26]利用蟬擬青霉液體發(fā)酵制備麥角甾醇產(chǎn)量47.57 mg/L相比,產(chǎn)量提高了24.36%?？梢?紅芪提取物可以作為羊肚菌生長促進因子,應用于液體發(fā)酵麥角甾醇具有一定的可行性。當然,有關中草藥促進羊肚菌生長及麥角甾醇合成的代謝機理,以及此類中草藥的添加是否對其他生物活性物質(zhì)也存在促進作用等問題,尚有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究以6種甘肅道地中草藥為試材,篩選適合羊肚菌液體發(fā)酵的中草藥種類,并采用單因素試驗結(jié)合響應面法,優(yōu)化了發(fā)酵紅芪提取物的工藝條件。結(jié)果表明,黨參、紅芪、柴胡3種中草藥可顯著促進羊肚菌菌絲體生長和麥角甾醇產(chǎn)量,其中紅芪的效果最佳,在100 g/L的添加劑量下,菌絲體生物量達到10.57 g/L,麥角甾醇產(chǎn)量達到47.69 mg/L。優(yōu)化的工藝條件為紅芪劑量97.60 g/L,發(fā)酵溫度26 ℃,發(fā)酵時間11 d,接種量8%,轉(zhuǎn)速180 r/min,該條件下麥角甾醇產(chǎn)量可達到59.16 mg/L,與工藝優(yōu)化前麥角甾醇產(chǎn)量48.51 mg/L相比,其產(chǎn)量提高了21.95%。因此,該發(fā)酵技術可為羊肚菌麥角甾醇等生物活性物質(zhì)的規(guī)?；a(chǎn)提供一定的參考。