張倩倩，袁 林，王雪兒，韓 婕，王學(xué)強，張 睿，張涵鳴，莫開菊,*

（1.湖北民族大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學(xué) 風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000）

2021年《中國肥胖防控倡議書》中提出，中國超過50%的成年人和近20%的兒童、青少年存在超重和肥胖問題[1]。肥胖使人患心腦血管[2]、動脈粥樣硬化[3]等慢性疾病的危險系數(shù)升高。超重使青年人、老年人壽命分別縮短8.4、0.9 年[4]。腸道是維持免疫系統(tǒng)正常的主要器官，其穩(wěn)態(tài)與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)[5]。研究顯示，膳食纖維可改變宿主腸道菌群多樣性[6]，提升擬桿菌門等益生菌豐度[7]，其可溶性部分發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可改善機體代謝異常，減少腸道對脂肪物質(zhì)的吸收，有望成為控制體質(zhì)量、治療肥胖藥物的替代品。

中國是全球柚子產(chǎn)量較高的國家，柚皮濕質(zhì)量約占全果質(zhì)量的50%，含有豐富的膳食纖維，但大多作為果蔬垃圾廢棄，不僅浪費資源，也給環(huán)境帶來了較大的壓力[8]。本研究旨在探究柚皮纖維對預(yù)防肥胖的效果，并分析腸道菌群與肥胖的關(guān)聯(lián)性，以期為提升柚皮資源利用率、減少環(huán)境污染提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

實驗動物：SPF級C57BL/6雄性黑鼠（體質(zhì)量15～18 g）購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001。

大小鼠維持飼料（生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0003）購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司；D12492型高脂飼料（生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2018-0006）購于小黍有泰（北京）生物科技有限公司。干預(yù)飼料：將D12492型高脂飼料粉碎，分別與占總質(zhì)量2.5%的果膠、不溶性膳食纖維、原料（未經(jīng)提取純化的柚皮纖維）混合均勻，制備果膠飼料、不溶性膳食纖維飼料、原料飼料粉，經(jīng)擠壓成型為直徑約1.2 cm的緊實棒狀飼料。

恩施白柚購于湖北恩施本地某超市。柚皮原料粉：新鮮柚皮去除黃皮，將白瓤成分清洗干凈后脫水粉碎，過80 目篩。柚皮果膠、柚皮不溶性膳食纖維為本實驗室自制，過程如下：柚皮原料粉→0.1 mol/L磷酸（料液比1∶20）→在超聲頻率60 kHz、超聲功率640 W、超聲溫度80 ℃條件下超聲1 h→離心（8 000 r/min、15 min）→上清液經(jīng)80%（體積分數(shù)，下同）乙醇反復(fù)沉淀，40 ℃下烘干至恒質(zhì)量，粉碎過80 目篩得可溶性膳食纖維，經(jīng)傅里葉變換紅外光譜鑒定為果膠；沉淀反復(fù)用去離子水清洗，40 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎過80 目篩得不溶性膳食纖維[9-13]。

血清甘油三酯（triglyceride，TG）、血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒 濰坊三維生物工程集團有限公司；肝素鈉一次性真空采血管 江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司；10%多聚甲醛 上海源葉生物科技有限公司；DP712 DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、高效高保真酶 美國New England Biolabs公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TG16-WS離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DW-HL1010-86 ℃超低溫冷凍儲存箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；TMS-1024i全自動生化分析儀 東莞美生實業(yè)有限公司；組織包埋機、切片機武漢俊杰電子有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Nova Seq 6000測序儀美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組與流程

健康C57BL/6雄性小鼠75 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機分為正常對照組（normal control group，NCG）、肥胖對照組（obesity control group，OCG）、果膠組（soluble dietary fiber group，SDF）、不溶性膳食纖維組（insoluble dietary fiber group，IDF）、原料組（raw material group，RMG），每組15 只。NCG組飼喂維持飼料，OCG組飼喂D12492高脂飼料，SDF、IDF、RMG組分別飼喂相應(yīng)干預(yù)飼料。實驗期67 d，小鼠自由攝食飲水，OCG組小鼠體質(zhì)量超過NCG組20%時即為實驗性肥胖鼠。試驗結(jié)束后，對小鼠禁食約12 h（不禁水），將小鼠稱質(zhì)量后麻醉解剖，眼球取血后脫臼處死，取肝、脾、腎、附睪脂肪分別稱質(zhì)量，隨后將其臟器置于福爾馬林溶液中保存?zhèn)溆?，脂肪置于專用固定液貯存，小鼠解剖后立即在超凈工作臺中取腸道內(nèi)容物于1.5 mL EP管中，置于-86 ℃冰箱中保存，采用干冰運輸。血液用一次性真空采血管收集，待全血充分靜置后4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取血清于離心管中并置于-86 ℃冰箱中備用。

1.3.2 小鼠日均攝食量測定

各組小鼠每日定量添加日糧至（100±2）g，定時回收并稱當(dāng)日余糧質(zhì)量，計算當(dāng)日每組小鼠食物攝取量，并據(jù)此計算每只小鼠日均攝食量。

1.3.3 體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)測定

體質(zhì)量與Lee’s指數(shù)參照涂杜[14]、王靜[15]等的方法稍作修改，實驗過程中每3 d測一次小鼠體質(zhì)量，觀察各組小鼠的體質(zhì)量增長規(guī)律。在最后一次喂食前測定小鼠的體長（鼻到肛門的距離）與體質(zhì)量，根據(jù)公式（1）計算Lee’s指數(shù)。

1.3.4 臟器指數(shù)測定

參照廉明[16]的方法，實驗結(jié)束后稱取小鼠肝、脾、腎質(zhì)量，計算臟器指數(shù)（公式（2））與附睪脂肪系數(shù)（公式（3））。

1.3.5 血脂生化指標檢測

待實驗結(jié)束，根據(jù)宋海昭[17]的方法稍作變動，對小鼠進行眼球取血。按照試劑盒說明書使用TMS-1024i全自動生化分析儀檢測小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C濃度。

1.3.6 組織病理切片分析

實驗結(jié)束后取各組動物的肝臟組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫水、固定，用蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下進行組織病理切片分析。

1.3.7 測序和數(shù)據(jù)分析

測序采用16SrRNA高通量測序技術(shù)，測序區(qū)間為16S（V3～V4），引物為341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）、806R（3’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-5’），采用溴化十六烷基三甲胺（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取樣品基因組DNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA純度和濃度；隨后取適量DNA于離心管中，并用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)擴增區(qū)域選擇使用帶編碼的特異性引物、Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用NEBNext?Ultra? IIDNA Library Prep Kit建庫，將構(gòu)建好的文庫進行Qubit和實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）檢測；文庫檢測合格后，使用Nova Seq 6000測序儀的PE250模式進行上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

理化檢測結(jié)果采用SPSS 21軟件進行單因素方差分析及偏相關(guān)分析，采用Origin 8.0軟件繪圖。高通量測序分析采用Nova Seq 6000測序儀的PE250模式處理，采用FLASH軟件對樣本序列進行拼接；采用fastp軟件進行質(zhì)控；采用Usearch軟件去除高質(zhì)量序列的嵌合體以獲得有效序列；采用QIIME2軟件中DADA2算法對有效序列進行降噪[18]，采用classify-sklearn算法對擴增子序列變異（amplicon sequence varian，ASV）物種進行注釋[19]；采用R軟件中的ade4和ggplot2進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）[20]；采用adonis和anosim函數(shù)分析組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著性；采用LEfSe軟件完成組間顯著差異性物種分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDF、IDF、RMG小鼠攝食量分析

如圖1所示，5 組小鼠中NCG小鼠攝食量遠高于各高脂膳食組，主要是因為D12492飼料含有60%脂肪，能量較高；RMG小鼠攝食量高于OCG、SDF、IDF 3 組，但高脂飲食的4 組小鼠間攝食量無明顯差異。表明膳食纖維添加量為2.5%的條件下，其對小鼠攝食量和飽腹感的影響不明顯，與向沁雪[21]的實驗結(jié)果相似。

圖1 不同組別小鼠實驗過程中攝食量的變化Fig.1 Changes in food intake of mice from different groups during the experiment

2.2 SDF、IDF、RMG小鼠體質(zhì)量分析

如圖2所示，NCG小鼠飼養(yǎng)期分為生長期與平穩(wěn)期，前31 d為生長期，體質(zhì)量由18 g左右增至22.5 g，此后由生長期進入平穩(wěn)期，至實驗結(jié)束，其體質(zhì)量穩(wěn)定于24.0 g左右。在整個實驗周期內(nèi)，OCG小鼠與3 個膳食纖維干預(yù)組小鼠體質(zhì)量均快速增加，未見平穩(wěn)期。至第40天，OCG與RMG小鼠體質(zhì)量分別比NCG高20.0%、20.9%，RMG小鼠體質(zhì)量比OCG高1.3%，成為肥胖鼠，但兩組小鼠體質(zhì)量無明顯差異；IDF與SDF小鼠體質(zhì)量較低，兩組間無明顯差異，分別比NCG高13.2%、13.4%，比OCG低6.3%、6.2%。至實驗結(jié)束（第67天），OCG、RMG小鼠體質(zhì)量分別比NCG高28.0%、33.5%；IDF、SDF小鼠體質(zhì)量分別比NCG高22.1%、21.5%，比OCG低4.9%、5.1%；IDF、SDF兩組小鼠體質(zhì)量與OCG差異明顯。結(jié)果表明柚皮不溶性膳食纖維和果膠可以有效預(yù)防高脂飲食所導(dǎo)致的小鼠體質(zhì)量增加。

圖2 不同組別小鼠體質(zhì)量變化Fig.2 Changes in body mass of mice from different groups

2.3 SDF、IDF、RMG小鼠臟器指數(shù)及Lee’s指數(shù)分析

肥胖與肝臟、腎臟、附睪脂肪及體長密切相關(guān)，由表1可知，各組小鼠臟器質(zhì)量間差異顯著程度高于臟器指數(shù)，因此臟器質(zhì)量比臟器指數(shù)更能反映小鼠的肥胖程度。表征肥胖靈敏度的指標主要有肝質(zhì)量、腎質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量及Lee’s指數(shù)。NCG小鼠肝質(zhì)量比OCG、RMG降低0.8%～1.1%，比IDF、SDF高8.6%～10.2%；脾質(zhì)量、腎質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量及Lee’s指數(shù)分別比各高脂組低15.4%～20.5%、4.7%～12.1%、47.6%～71.3%、2.8%～12.64%。OCG小鼠肝質(zhì)量、腎質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量、附睪脂肪系數(shù)、Lee’s指數(shù)分別比IDF、SDF小鼠高10.4%～11.4%、5.6%～11.8%、24.3%～26.1%、0.44%～0.60%、2.47%～2.54%；RMG小鼠以上指標分別比IDF、SDF小鼠高10.4%～11.4%、8.3%～14.7%、81.4%～84.1%、1.4%～1.56%、3.74%～3.81%。RMG小鼠附睪脂肪系數(shù)、Lee’s指數(shù)分別比OCG組高0.96%、1.27%，脾質(zhì)量與IDF、SDF無顯著差異。以上結(jié)果表明，高脂飲食使臟器及附睪脂肪質(zhì)量顯著增加，柚皮不溶性膳食纖維和果膠可有效控制小鼠臟器及附睪脂肪質(zhì)量，進而控制體質(zhì)量，與文獻[22]結(jié)果相似。各臟器質(zhì)量及Lee’s指數(shù)表征肥胖的靈敏度順序為附睪脂肪質(zhì)量＞肝質(zhì)量＞腎質(zhì)量＞Lee’s指數(shù)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)RMG小鼠附睪脂肪質(zhì)量等指標均高于其余各組，該現(xiàn)象值得進行深入研究。

表1 各組小鼠臟器指數(shù)及Lee’s指數(shù)Table 1 Visceral and Lee’s indexes of mice from different groups

2.4 SDF、IDF、RMG小鼠血脂生化指標分析

血脂生化指標是反映機體肥胖與血脂健康程度的重要指標。由圖3可知，TC、TG濃度可以比LDL-C、HDL-C濃度更靈敏地展示各組間的差異。根據(jù)TC、TG濃度的顯著性分析，可將小鼠分為3 類，即NCG為一類，IDF、SDF為一類，OCG、RMG為一類，同一類中這2 個指標均無顯著性差異，但各類間均存在不同程度的差異。NCG小鼠各指標均顯著低于其余4 組，其中TC濃度比其余4 組低39.9%～49.8%，TG濃度低13.5%～23.0%，HDL-C濃度低47.7%～50.4%，LDL-C濃度低0～26.7%。IDF與SDF小鼠TC濃度分別比OCG低8.3%、11.4%，LDL-C濃度分別比OCG低14.29%、21.21%，RMG小鼠TC、LDL-C、HDL-C濃度分別比OCG小鼠高7.4%、12.5%、5.44%。這與Kim等[23]的實驗結(jié)果相似。以上結(jié)果說明，高脂飲食對血脂健康十分不利，TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度是與血脂健康相關(guān)的重要指標，柚皮不溶性膳食纖維和果膠可有效控制血脂，但未經(jīng)提取純化的柚皮纖維未顯示出控制血脂的益處。

圖3 不同處理組小鼠的血脂生化指標Fig.3 Biochemical indexes of blood lipids in mice from different groups

2.5 SDF、IDF、RMG小鼠肝臟組織觀察

肝臟是脂肪合成的主要場所，各組小鼠肝臟病理切片見圖4。NCG小鼠肝臟中脂肪滴數(shù)量明顯低于其余各組。OCG小鼠比其余各組多出大量脂肪泡，表明該組小鼠脂肪代謝異常，結(jié)合2.3節(jié)結(jié)果可知該異常導(dǎo)致了肝質(zhì)量改變。SDF、IDF小鼠脂肪滴數(shù)量介于NCG與OCG之間，明顯低于OCG，表明柚皮不溶性膳食纖維和果膠干預(yù)減少了肝臟脂質(zhì)堆積。RMG小鼠脂肪滴數(shù)量介于IDF、SDF與OCG之間，表明未經(jīng)提取純化的柚皮纖維減少肝臟脂肪堆積效果較柚皮不溶性膳食纖維和果膠差。

圖4 不同處理組小鼠肝臟組織切片組織學(xué)變化Fig.4 Histological changes in liver tissue of mice from different groups

2.6 小鼠腸道微生物Alpha多樣性分析

由表2可知，各組操作單元分類（oper ational taxonomic units，OTU）覆蓋率均超過99.9%，說明測序結(jié)果可以較好地展現(xiàn)各組小鼠腸道微生物多樣性。Chao1指數(shù)越大，Shannon、Simpson指數(shù)越高，說明樣品中細菌物種總數(shù)越多，物種均勻度越好、豐富度越高，其變化趨勢與OTU一致。5 組小鼠腸道微生物物種總數(shù)由高到底依次為SDF、RMG、IDF、NCG、OCG。SDF、IDF、RMG小鼠物種總數(shù)高于OCG小鼠，表明柚皮不溶性膳食纖維、果膠和未經(jīng)提取純化的柚皮纖維可不同程度地改善高脂飲食所致肥胖小鼠腸道菌群總數(shù)減少的現(xiàn)象。

表2 小鼠腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)分析Table 2 Statistic analysis of alpha-diversity indexes of intestinal microbes in mice

2.7 小鼠腸道微生物Beta多樣性分析

2.7.1 PCoA

由圖5可知，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對區(qū)分各組差異的貢獻度分別為59.72%、12.51%，總貢獻率為72.23%，能較好地體現(xiàn)5 組小鼠腸道群落間分布差異。NCG集中于第3象限，SDF主要集中于第1象限，OCG、RMG、IDF跨越第1、2、4象限，表明NCG、SDF與其余各組群落組成和結(jié)構(gòu)差異較大。RMG、OCG距離較近，分布情況相似，說明兩組小鼠腸道群落存在相似的組成結(jié)構(gòu)；IDF分布范圍與SDF接近，表明兩組小鼠腸道群落存在相似之處，且與RMG、OCG存在差異。

圖5 小鼠腸道微生物Beta多樣性的PCoAFig.5 PCoA plot of beta-diversity of intestinal microbes in mice

2.7.2 細菌群落差異分析

2.7.2.1 門水平細菌群落差異分析

門水平相對豐度排名前10 位的菌群分別為擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、脫硫菌門（Desulfobacterota）、環(huán)孢菌門（Campilobacterota）、螺旋體門（Spirochaetota）、脫鐵桿菌（Deferribacterota）、Patescibacteria、變形菌門（Proteobacteria）、廣古菌門（Euryarchaeota）與放線菌門（Actinobacteriota）（表3）。

表3 門水平相對豐度排名前10 位的菌群Table 3 Relative abundance of top 10 most abundant bacterial groups at the phylum level%

NCG小鼠擬桿菌門相對豐度顯著高于其他各高脂組，厚壁菌門、脫硫菌門、脫鐵桿菌相對豐度低于其他各高脂組。與OCG小鼠相比，各膳食纖維干預(yù)組厚壁菌門、Patescibacteria、螺旋體門相對豐度均升高。RMG與IDF、SDF小鼠在門水平腸道菌群組成上存在差異。

2.7.2.2 屬水平細菌群落差異分析

屬水平相對豐度排名前10 位的菌群為Muribaculaceae、擬桿菌屬（Bacteroides）、幽門螺桿菌屬（Helicobacter）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、Dubosiella、糞桿菌屬（Faecalibaculum）、羅氏菌屬（Roseburia）、鏈球菌屬（Streptococcus）、布勞特氏菌屬（Blautia）與Mucispirillum（表4）。

表4 屬水平相對豐度排名前10 位的菌群Table 4 Relative abundance of top 10 most abundant bacterial groups at the genus level%

NCG小鼠Muribaculaceae相對豐度顯著高于各高脂組，糞桿菌屬、羅氏菌屬、布勞特氏菌屬、Mucispirillum低于各高脂組。與OCG小鼠相比，各膳食纖維干預(yù)組小鼠毛螺菌屬、Dubosiella及鏈球菌屬相對豐度均升高，羅氏菌屬相對豐度降低。RMG小鼠與IDF、SDF腸道菌群在屬水平組成上存在一定差別。

2.8 生理指標與菌群組成間的相關(guān)性分析

2.8.1 小鼠生理指標與門水平腸道菌群相關(guān)性分析

由圖6可知，擬桿菌門相對豐度對控制體質(zhì)量及肥胖（附睪脂肪質(zhì)量、附睪脂肪系數(shù)）顯著有益，但與血脂的各項指標均呈負相關(guān)，有的達到極顯著負相關(guān)，因此其對于健康的利弊不明確。厚壁菌門和脫硫菌門相對豐度與體質(zhì)量、肥胖和血脂指標有相似的相關(guān)性，二者與體質(zhì)量均呈正相關(guān)，與附睪脂肪質(zhì)量、TC及HDL-C濃度呈顯著或極顯著正相關(guān)，但與肝臟指數(shù)呈負相關(guān)。螺旋體門相對豐度與體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量、附睪脂肪系數(shù)、LDL-C濃度呈顯著正相關(guān)。

圖6 小鼠生理指標與相對豐度排名前10 位的門水平腸道菌群間相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between physiological indexes in mice and top 10 most abundant intestinal bacteria at the phylum level

如圖7所示，擬桿菌門相對豐度與肝臟質(zhì)量呈顯著正相關(guān)，與HDL-C濃度呈極顯著負相關(guān)，與LDL-C濃度呈顯著正相關(guān)，其相對豐度的升高不利于血脂健康；螺旋體門相對豐度與HDL-C濃度呈顯著負相關(guān)，其相對豐度的升高可能不利于血脂健康；厚壁菌門相對豐度與HDL-C濃度呈極顯著正相關(guān)，與LDL-C濃度呈顯著負相關(guān)，其相對豐度的升高有利于血脂健康。此外，脫鐵桿菌相對豐度的升高可能有利于血脂健康。而脫硫菌門、Patescibacteria相對豐度分別對腎臟質(zhì)量及指數(shù)、肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)有顯著影響，但是其對于健康的利弊及機理有待后續(xù)探討。

圖7 控制體質(zhì)量變量時小鼠生理指標與相對豐度排名前10 位的門水平腸道菌群間偏相關(guān)性分析Fig.7 Analysis of partial correlation between physiological indexes in mice and top 10 most abundant intestinal flora at phylum level when controlling body mass

2.8.2 小鼠生理指標與屬水平腸道菌群相關(guān)性分析

由圖8、9可知，絨毛桿菌屬（屬擬桿菌門）相對豐度與體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量及TG、TC、HDL-C濃度呈負相關(guān)，控制體質(zhì)量變量時與肝質(zhì)量、LDL-C濃度呈正相關(guān)，擬桿菌屬（屬擬桿菌門）相對豐度與腎質(zhì)量呈負相關(guān)，表明擬桿菌門中利于控制體質(zhì)量的菌屬包括絨毛桿菌屬和擬桿菌屬，而絨毛桿菌屬可對血脂產(chǎn)生不利影響。從屬于厚壁菌門的毛螺菌屬相對豐度與附睪脂肪質(zhì)量呈正相關(guān)，Dubosiella相對豐度與腎質(zhì)量呈負相關(guān)，鏈球菌屬相對豐度與TG、HDL-C濃度正相關(guān)，與LDL-C濃度呈負相關(guān)，表明厚壁菌門中毛螺菌屬可對附睪脂肪相關(guān)指標產(chǎn)生負面影響，而Dubosiella與鏈球菌屬則分別有利于控制臟器質(zhì)量與改善血脂健康。Mucispirillum（脫鐵桿菌）相對豐度與HDL-C濃度呈正相關(guān)，與LDL-C濃度呈負相關(guān)，其相對豐度的升高有利于血脂健康。

圖8 小鼠生理指標與相對豐度排名前10 位的屬水平腸道菌群間相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between physiological indexes in mice and top 10 most abundant intestinal bacteria at the genus level

圖9 控制體質(zhì)量變量時小鼠生理指標與相對豐度排名前10 位的屬水平腸道菌群間偏相關(guān)性分析Fig.9 Analysis of partial correlation between physiological indexes in mice and top 10 most abundant intestinal flora at the genus level when controlling body mass

綜上，腸道菌群對肥胖及血脂健康影響微妙且深遠，即使其相對豐度的升高使小鼠體質(zhì)量增加，但不一定對血脂健康有不良影響，同一菌群可能對體質(zhì)量、臟器和血脂相關(guān)指標的影響并不同步，因此腸道菌群與肥胖及血脂健康的關(guān)聯(lián)需要進行更細致和深入的探究。

3 討論

腸道菌群與肥胖的關(guān)聯(lián)是探究肥胖發(fā)生機理及拓寬預(yù)防新思路的關(guān)鍵所在。血脂相關(guān)指標常伴隨機體肥胖發(fā)生變化，是研究肥胖的重要指標。研究表明，補充膳食纖維可改變腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)，從而改善脂代謝平衡，調(diào)控肥胖及血脂變化。

人體實驗中，Thompson等[24]證明補充可溶性膳食纖維可降低受試者0.41%（質(zhì)量分數(shù)，下同）的體脂，使受試者體質(zhì)量平均降低2.52 kg。Ye等[25]發(fā)現(xiàn)食用40～48 g/d全谷物膳食纖維可分別使LDL-C和TC濃度降低0.83 mmol/L和0.72 mmol/L。Mayengbam等[26]對53 名肥胖患者進行膳食纖維干預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)膳食纖維干預(yù)組患者體質(zhì)量顯著降低，腸道中毛螺菌群豐度顯著增加。動物實驗中，Andersson等[27]對C57BL/6小鼠飼喂含27%燕麥麩的飼料4 周，小鼠TC含量降低19%。Antonin等[28]對大鼠飼喂含10%豆渣的飼料，發(fā)現(xiàn)大鼠體質(zhì)量周增量降低3 g，TC質(zhì)量濃度降低14 mg/dL。Wang Haiyuan等[29]給高脂飲食小鼠喂食可溶性膳食纖維，發(fā)現(xiàn)小鼠脂肪質(zhì)量降低，腸道中擬桿菌門豐度增加。

本研究結(jié)果表明，NCG小鼠血脂指標、體質(zhì)量均顯著低于高脂飲食組，IDF、SDF小鼠上述指標介于NCG與OCG之間，各組小鼠細菌微生物組成也存在明顯差異，表明所造模型合理，補充膳食纖維有助于調(diào)控肥胖。16S rRAN高通量測序技術(shù)分析結(jié)果顯示，擬桿菌門及厚壁菌門為腸道優(yōu)勢菌群，且高脂飲食組小鼠擬桿菌門菌相對豐度降低，厚壁菌門相對豐度升高，這與Zhong Yadong[30]、Riva[31]等學(xué)者的結(jié)論一致。本研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、擬桿菌門對體質(zhì)量和血脂相關(guān)指標的影響并不同步，厚壁菌門相對豐度的升高有利于血脂健康卻不利于控制體質(zhì)量，擬桿菌門的效果與之相反，與文獻[32]的結(jié)果相似，如從屬于擬桿菌門的絨毛桿菌屬有利于控制體質(zhì)量但不利于血脂健康，從屬于厚壁菌門的鏈球菌屬、Dubosiella不利于控制體質(zhì)量但對維持血脂健康有益。此外，本研究結(jié)果顯示各高脂組小鼠脫鐵桿菌、脫硫菌門的相對豐度增加，其中脫鐵桿菌主要由Mucispirillum屬組成，與文獻[33]的結(jié)果相似，這兩個菌門可能是引起肥胖的重要菌群[34]。

分析小鼠理化指標結(jié)果及其與腸道菌群之間的關(guān)聯(lián)性，總結(jié)柚皮膳食纖維對預(yù)防肥胖及調(diào)節(jié)腸道菌群影響的結(jié)果如下：

補充柚皮膳食纖維對預(yù)防肥胖有效，其機理并不全是通過增加飽腹感以抑制攝食量，與前人研究結(jié)果相似，其主要是通過影響腸道微生物豐度從而影響宿主的生理健康。本研究中柚皮不溶性膳食纖維、果膠可控制體質(zhì)量，與OCG小鼠相比，SDF和IDF小鼠體質(zhì)量分別降低5.1%、4.9%。而未經(jīng)提取純化的柚皮纖維卻導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量增加。但RMG小鼠攝食量與IDF、SDF相比略高，體質(zhì)量明顯增加，甚至高于OCG，未經(jīng)提取純化的柚皮纖維導(dǎo)致體質(zhì)量增加的原因值得深入研究。

補充柚皮膳食纖維可有效降低肥胖小鼠臟器質(zhì)量，減少附睪脂肪堆積并維持血脂健康。與OCG小鼠相比，IDF、SDF小鼠臟器指數(shù)、臟器質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、TC濃度、LDL-C濃度降低，HDL-C濃度升高，說明補充柚皮不溶性膳食纖維、果膠可有效控制血脂，而未經(jīng)提取純化的柚皮纖維卻未顯示出控制血脂的益處。

補充柚皮膳食纖維可有效改善肥胖小鼠腸道菌群物種多樣性。SDF、IDF小鼠擬桿菌門及厚壁菌門中毛螺菌屬相對豐度增加，從而抵抗宿主肥胖，這與朱宏斌等[35]發(fā)現(xiàn)肥胖宿主體內(nèi)擬桿菌門豐度顯著降低，厚壁菌門、脫鐵桿菌豐度顯著升高，毛螺菌屬可顯著抵抗肥胖，及Chen Tingting[36]、Petia[37]等發(fā)現(xiàn)柚皮不溶性膳食纖維、可溶性膳食纖維顯著增加豬腸道中擬桿菌門豐度的結(jié)論一致。補充柚皮不溶性膳食纖維、果膠可降低可能導(dǎo)致肥胖的脫硫菌門、脫鐵桿菌及厚壁菌門的相對豐度，這與Fleissner等[38]發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠體內(nèi)擬桿菌們含量降低，厚壁菌門含量升高的現(xiàn)象一致。

腸道菌群對體質(zhì)量、臟器質(zhì)量及血脂相關(guān)指標的調(diào)控并不同步。擬桿菌門及其從屬菌相對豐度的升高利于控制小鼠體質(zhì)量，但不利于控制血脂；厚壁菌門相對豐度的變化對小鼠體質(zhì)量影響不明顯，但其相對豐度的升高有利于降低血脂；脫硫菌門、脫鐵桿菌相對豐度的升高不利于控制體質(zhì)量，但對血脂具有正面影響；脫鐵桿菌調(diào)控血脂相關(guān)指標的能力可能與Mucispirillum具有抵御沙門氏菌引發(fā)的腸道炎癥相關(guān)[33]。

綜上，本研究證實補充柚皮膳食纖維可有效預(yù)防肥胖且改善小鼠腸道菌群穩(wěn)態(tài)，同時揭示了部分腸道菌群相對豐度與血脂、肥胖間的關(guān)聯(lián)性，尤其補充柚皮不溶性膳食纖維、果膠效果較好，這使靶向預(yù)防肥胖成為可能，但其代謝通路、作用機制及有效劑量仍需深入研究。