黃章程

（福建賽福食品檢測研究所有限公司，福建福州 350100）

民以食為天，當(dāng)食品發(fā)生安全問題后不僅會使社會的誠信機(jī)制受到消極影響，嚴(yán)重時還會使廣大人民群眾的生命安全遭遇威脅。進(jìn)入新時代后，為了有效保障食品安全，提升全民素質(zhì)，完善了原有的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)體系。但是，在實施過程中并不能從根本上杜絕部分商家通過非法手段從事制假、摻假、售假等違法犯罪活動。因而，在當(dāng)前階段十分有必要加強(qiáng)對食品安全評估和檢測的研討，利用先進(jìn)的檢測方法提高其評估和檢測效率及質(zhì)量，為食品安全管理提供技術(shù)支撐等。

1 蛋白質(zhì)化學(xué)檢測方法的基本原理

蛋白質(zhì)屬于大分子化合物，由氨基酸脫水而來。化學(xué)組成元素包括了C、O、N、H、S、P 及微量元素等（圖1），理化特性如下：①氨基酸特性；②高分子性質(zhì)；③水合作用；④顯色反應(yīng)等。近幾年蛋白質(zhì)化學(xué)檢測中應(yīng)用的方法主要有兩種，一種是凱氏定氮法，另一種是高效液相色譜法，兩種方法不僅在檢測原理方面存在較大差異，而且適用范圍有所不同。

圖1 蛋白質(zhì)組成元素及含量示意

1.1 以凱氏定氮法為例

該方法已有一百多年的歷史，具有可靠性高、應(yīng)用廣泛的特點。從全球范圍看，多數(shù)國家、專業(yè)檢驗檢測機(jī)構(gòu)，都將其作為蛋白質(zhì)檢測方面的標(biāo)準(zhǔn)方法，有效落實到了食品安全評估和檢測之中。目前，我國在食品安全評估和檢測中，將其作為國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的重要方法對其進(jìn)行了推廣應(yīng)用。從原理方面看，凱氏定氮法包括消化、蒸餾、滴定。具體如下：①消化環(huán)節(jié)主要是在氧化反應(yīng)的條件下把被測樣品中的含氮化合物轉(zhuǎn)化氨氣，同時以硫酸銨的形式分離出其中的氮元素。②蒸餾環(huán)節(jié)主要是把氨從消化產(chǎn)物中分離出來，并通過滴定方式定量分析溶液內(nèi)的氨離子。消化、蒸餾、滴定三大檢測步驟對應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)式如下：

1.2 以高效液相色譜法為例

高效液相色譜法（HPLC）屬于色譜法，主要是在經(jīng)典液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展出來的新型檢測方法，優(yōu)勢集中表現(xiàn)在應(yīng)用范圍大、分離速率高、準(zhǔn)確度高、靈敏度高等方面，尤其在揮發(fā)性化合物、高沸點化合物檢測方面具有較好的應(yīng)用效果。目前，在國內(nèi)的食品檢測、環(huán)境監(jiān)測方面，對其進(jìn)行了推廣應(yīng)用。從原理方面看，該方法主要是從物化性質(zhì)差異出發(fā)，以液體作為流動相，利用高壓輸液系統(tǒng)、物質(zhì)溶解度、物質(zhì)蒸氣壓等，分離物質(zhì)流動相和固定相色譜柱中的物質(zhì)組分。以液相色譜柱分離為例，假定分布系數(shù)、分離因子分別為a和k，可以根據(jù)公式對n個液相色譜柱的分離效率R進(jìn)行有效計算。具體如下：

2 食品安全評估和檢測中對蛋白質(zhì)化學(xué)檢測方法的應(yīng)用

自《食品安全標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測評估“十四五”規(guī)劃》實施至今，國家食品安全管理部門、監(jiān)督部門、專業(yè)檢驗檢測機(jī)構(gòu)，在食品安全評估和檢測中普遍加強(qiáng)了對凱氏定氮法和高效液相色譜法的應(yīng)用，雖然蛋白質(zhì)檢測中的兩種方法原理、優(yōu)勢、劣勢均存在差異（表1），但是在實際應(yīng)用中可以滿足大部分食品安全精準(zhǔn)檢測需求。為了論述的清晰性，下面僅對凱氏定氮法的應(yīng)用展開具體說明。

表1 蛋白質(zhì)檢測方法原理及優(yōu)勢和劣勢

2.1 應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，應(yīng)用凱氏定氮法時主要是對食品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量檢測。但是，當(dāng)參考值存在較大不確定性時，不能將該方法作為替代方法實現(xiàn)對測定對象的準(zhǔn)確評估。例如，應(yīng)用該方法建立參考值的過程中，要求檢測人員對凱氏定氮法的性能做進(jìn)一步驗證，并對其期望范圍進(jìn)行確認(rèn)。事實上，應(yīng)用該方法時牽涉三大檢測步驟，每個步驟中的化學(xué)反應(yīng)比較復(fù)雜，通常的測量時間不低于10 h，并不能滿足當(dāng)前階段食品安全評估和檢測中對快速測定的要求。為了解決該問題，在離子色譜、凱氏消化方面，可以使用抑制電導(dǎo)檢測方法，進(jìn)而使消解時間降至1 h 以內(nèi)，同時省去該方法中的其他兩個步驟，進(jìn)而使分析時間大幅度降低，達(dá)到食品安全評估和檢測中對其準(zhǔn)確度和精密度的要求。再如，部分不良商家為了牟取暴利，會選擇在食品中摻假牛奶生乳蛋白，此時檢測人員可以利用非蛋白質(zhì)氮（NPN）指數(shù)概念，將該方法與三氯乙酸沉淀法（TCA）進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，完成對一系列牛奶樣品非蛋白質(zhì)氮和蛋白質(zhì)氮的檢測。以三聚氰胺為例，當(dāng)摻假牛奶中的含量小于0.2 mg/kg 時NPN 指數(shù)可達(dá)到可辨識范圍（最小值為0.8084，最大值為1.4987）。檢測人員可以根據(jù)該條件，應(yīng)用上述兩種方法的聯(lián)合檢測方式，更為精準(zhǔn)地完成對富含氮的摻假牛奶質(zhì)量檢測工作。

2.2 實驗分析

2.2.1 實驗材料

儀器主要包括UV-1800紫外可見分光光度計，石墨消解儀。試劑如下：實驗試劑為聚乙烯醇，基準(zhǔn)物為氯化銨、碳酸鈉，分析純包括過氧化氫（30%），溴甲酚綠，甲基紅，鹽酸，氫氧化鈉，硼酸，硫酸銅、硫酸鉀，硫酸，碘化汞（CP），碘化鉀。實驗食品共計7種，分別為清蒸豬肉、原法鯖魚、蠶豆、午餐肉、紅燒肉、咖啡雞、菜籽粕。

2.2.2 實驗方法

首先，實驗人員按0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL、2.8 mL、4.0 mL，吸取含N 量為40 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)氯化銨溶液，通過聚乙烯醇液（0.1 mg/mL）對其進(jìn)行稀釋處理后，量取奈氏試劑1 mL，加入稀釋液，加入量以25 mL 為準(zhǔn)，然后采用比色法在460 nm 位置進(jìn)行比色，獲取蛋白質(zhì)過氧化凱氏定氮法標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.034 2x+0.121 6，R2=0.9989。

其次，采用電子天平秤取0.25 g 樣品，將其置于凱氏定氮管中，然后添加硫酸4 mL，置于石墨消解儀上300℃加熱3 min 后，以2 mL/min 的速度添加消化劑15 mL（過氧化氫和硫酸比例為4：1）繼續(xù)在石墨消解儀上350℃溫度加熱2 min，完成對過氧化劑的處理后，取出消解管，冷卻后轉(zhuǎn)移并定容至100 mL。按照比色法吸取0.4 mL 樣品進(jìn)行比色。

第三，根據(jù)GB 5009.5—2016標(biāo)準(zhǔn)要求，應(yīng)用過氧化凱氏定氮法對樣品中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。為了說明該方法的測定優(yōu)勢，實驗人員同時應(yīng)用常規(guī)凱氏定氮法對樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了測定，記錄了相關(guān)測定數(shù)據(jù)，比較了常規(guī)法、過氧化法的精密度等。

2.2.3 實驗結(jié)果和討論

實驗結(jié)果顯示，在7 個樣品中，應(yīng)用過氧化法測定的蛋白質(zhì)含量在37.62%～38.71%，CV 為0.44%。常規(guī)法測定下的對應(yīng)數(shù)據(jù)為28.0%～38.5%、0.53%。應(yīng)用F 檢驗比較后發(fā)現(xiàn)，兩種方法的精密度不具有顯著差異，基本相同。但是，通過對清蒸豬肉、原法鯖魚、蠶豆、午餐肉、紅燒肉、咖啡雞、菜籽粕七種食品的蛋白質(zhì)含量測定后，發(fā)現(xiàn)二者的對應(yīng)差值，分別為+0.19、+0.73、+0.16、+0.38、-0.45、+0.70、-22。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計理論，對兩種方法進(jìn)行比較分析：①當(dāng)測定次數(shù)增多后，兩種方法測定值減差值應(yīng)等于0；②在有限測定次數(shù)內(nèi)，二者的減值不一定等于0，而且與0之間不存在顯著差異。對應(yīng)到統(tǒng)計檢驗方面，檢驗假定條件是H0：u=u0，備樣假設(shè)條件為H1：u≠u0。假定顯著性水平α=0.05，那么，本例中的拒絕域|t|＞t0.05，6=2.45，由此說明檢驗假定條件成立，兩種方法的測定結(jié)果趨于一致。

但是，在測定結(jié)果影響方面，應(yīng)用過氧化劑（ 按0 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL）后，消化時間在2.5～15.0 min，蛋白質(zhì)含量范圍在27.98%～29.98%。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過氧化劑使用量為5 mL，滴速為2 mL/min 時，菜籽粕蛋白質(zhì)量含量測定結(jié)果方面，基本趨于恒定。對其他樣品進(jìn)行測定后，發(fā)現(xiàn)15 mL 的過氧試劑應(yīng)用效果相對較好，在滴速不變的情況下消化時間約在7.5 min。從樣品氮回收率方面看，硫酸與過氧化氫發(fā)生反應(yīng)后，主要生成的水和HS03OOH 的，根據(jù)文獻(xiàn)報道和本次實驗經(jīng)驗看，按4：1的比例應(yīng)用30%過氧化氫和氧化劑硫酸，能夠起到較好的氧化效果，加速消化速度。

2.2.4 實驗結(jié)論

通過實驗結(jié)果與討論說明，在食品蛋白質(zhì)含量測定中，應(yīng)用過氧化法，有利于提高凱氏定氮法的應(yīng)用效率，實用性相對較高。

3 結(jié)束語

食品安全評估和檢測在當(dāng)前階段已變得十分重要，成為食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)體系的核心內(nèi)容。建議在實踐中選擇蛋白質(zhì)化學(xué)檢測方法時，先對不同方法下的基本原則全面分析，再根據(jù)不同方法的適用范圍對其進(jìn)行應(yīng)用。建議在食品評估和檢測實踐中，一方面選擇凱氏定氮法對食品蛋白質(zhì)質(zhì)量進(jìn)行檢測，另一方根據(jù)面高效液相色譜法的適用范圍，將其應(yīng)用到對食品蛋白質(zhì)含量檢測方面，進(jìn)而提高該方法的應(yīng)用效果。