楊吉壘 杜艷秋 溫曉霞 劉華蔚

雷公藤甲素(Triptolide,TP)是從中藥雷公藤中提取的有效單體,具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等經(jīng)典作用[1]。隨著研究的深入,大量實驗表明雷公藤甲素還可通過各種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。研究證實雷公藤甲素能夠抑制線粒體已糖激酶II從而誘導頭頸部腫瘤焦亡[2]。在卵巢癌細胞中,雷公藤甲素能夠抑制JAK2/STAT3信號,通過ROS生成誘導致死性自噬[3]。本研究通過一系列體外實驗,研究雷公藤甲素對人舌鱗狀細胞癌自噬的影響,并研究自噬在其抗腫瘤過程中的作用以及可能的信號轉(zhuǎn)導途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞以及主要試劑

人舌鱗癌細胞系CAL-27和SCC-25(中國科學院細胞研究所);TP(Sigma公司,美國);DMEM高糖液體培養(yǎng)基、F12液體培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司,美國);四甲基偶氮唑藍(MTT)粉末(南京生興生物技術(shù)有限公司);AnnexinV-PI細胞凋亡雙染試劑盒(Becton Dickinson公司,美國);MDC熒光染色試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);ECL超敏化學發(fā)光試劑盒(南京碧云天生物技術(shù)研究所);LC3、ATG3、ATG7、PARP、cleaved PARP、Caspase-9、cleaved Caspase-9、STAT3、PIM-1、β-actin抗體、HRP 標記山羊抗鼠/抗兔 IgG(Abcam 公司,英國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CAL-27細胞使用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素),SCC-25細胞使用F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素)。恒溫CO2培養(yǎng)箱(5%CO2,37 ℃)培養(yǎng),細胞密度達到70%～85%時傳代,使用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MDC染色法測定細胞自噬情況 分別取生長狀態(tài)良好且對數(shù)生長期的CAL-27細胞和SCC-25細胞,按5×104個細胞/孔的密度接種于24 孔板爬片上,用終濃度10 μg/L的TP分別處理細胞24 h后,避光加0.05 mmol/L的MDC染液(100 μL/孔)避光室溫孵育約40 min,用抗熒光猝滅劑封片,激發(fā)波長為355 nm和發(fā)射波長為512 nm的綠色熒光進行觀察拍照。

1.2.3 MTT比色法測定細胞存活率 將CAL-27細胞接種于96 孔板(195 μL/孔),恒溫CO2培養(yǎng)箱(5%CO2,37 ℃)中孵育24 h,。細胞貼壁后,以每孔5 μL的體積加入TP(終濃度為2.5、5、10、15、20、30 μg/L),每組濃度設(shè)3 個平行孔(空白組加入5 μL的DMSO),繼續(xù)培養(yǎng)48 h。避光加入MTT工作液(5 mg/mL,20 μL/孔),在細胞培養(yǎng)箱中靜置反應(yīng)4 h。棄盡96 孔板中的溶液,向每孔中加入120～150 μL DMSO溶液,待結(jié)晶完全溶解后,使用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處檢測各孔的吸光度值。細胞增殖抑制率=(對照組A570值-TP處理組A570值)/對照組A570值100%。

1.2.4 Western Blot實驗測定細胞中相關(guān)蛋白表達情況 取處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的CAL-27細胞接種至六孔培養(yǎng)板中,待細胞完全貼壁后,換含有不同濃度TP(5、10、20 μg/L)的培養(yǎng)基作用不同時間(12、24、48 h)。收集細胞并提取蛋白,使用BCA法進行蛋白定量,每孔上樣30 μg,8%～12%SDS-PAGE凝膠電泳分離目標蛋白,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%現(xiàn)配脫脂奶粉室溫封閉液封閉1 h,TBST洗脫3 次,一抗(1:10 000稀釋)4 ℃孵育過夜,TBST洗脫3 次,二抗(1:1 000稀釋)室溫孵育2 h,TBST洗脫,ECL化學發(fā)光顯色,Bio-Rad凝膠成像分析儀(Gel Doc XR,伯樂,美國)中曝光,成像。使用Image J系統(tǒng)定量分析目的條帶。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 取處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的CAL-27細胞接種至六孔培養(yǎng)板中,待細胞完全貼壁后,換含有不同濃度TP(5、10、20 μg/L)的培養(yǎng)基作用不同時間(12、24、48 h)。收集培養(yǎng)基,并用無EDTA的胰酶消化細胞,終止后所得懸液與細胞原培養(yǎng)基以1 000 r/min的條件離心5 min,棄盡上清,以500 μL 1×Binding Buffer輕柔吹散細胞沉淀,每組樣品中再分別避光加入5 μL Annexin V和5 μL PI染色液?；靹蚝?避光靜置染色20 min,并在2 h內(nèi)通過流式細胞儀(Invitrogen Attune CytPix,賽默飛,美國)完成所有檢測并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié) 果

2.1 TP對舌癌細胞的自噬誘導作用

經(jīng)過TP(5 μg/L,24 h)處理的舌癌細胞出現(xiàn)明顯的空泡現(xiàn)象,這是自噬的典型表現(xiàn)之一[4]。MDC染色發(fā)現(xiàn)TP處理過的細胞熒光強度明顯增加,說明TP處理的細胞中有大量自噬泡的形成,TP可能誘導舌癌細胞發(fā)生了自噬(圖1A)。進一步驗證TP對舌癌細胞自噬的影響,分子水平Western Blot實驗顯示,隨著TP作用時間(12、24、48 h)和作用濃度(5、10、20 μg/L, 24 h)的增加,自噬標志蛋白LC3、Atg3、Atg7表達均明顯上調(diào),與對照組相比具有顯著性差異(圖1B、C)。說明TP能夠誘導舌癌細胞發(fā)生自噬,并且呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。

圖1 雷公藤甲素誘導TSCCs自噬Fig 1 Triptolide induces autophagy of TSCCs

2.2 TP對CAL-27細胞凋亡的影響

MTT實驗發(fā)現(xiàn)TP對CAL-27細胞的殺傷作用呈現(xiàn)濃度依賴性,TP作用48 h對細胞的IC50為12.39 μg/L(圖2A)。流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)TP處理后的CAL-27細胞發(fā)生凋亡,隨著TP作用時間(12、24、48 h)和作用濃度(5、10、20 μg/L,24 h)的增加,CAL-27的凋亡率不斷增加,呈現(xiàn)時間和劑量依賴性(圖2B)。隨著TP作用時間(12、24、48 h)和作用濃度(5、10、20 μg/L,24 h)的增加,凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase-9剪切體表達明顯上調(diào),與對照組有顯著性差異(圖2C～D)。以上結(jié)果充分說明,TP能夠誘導口腔癌CAL-27細胞凋亡。

圖2 雷公藤甲素誘導CAL-27細胞發(fā)生凋亡Fig 2 Triptolide induces apoptosis of CAL-27 cells

2.3 雷公藤甲素通過自噬誘導CAL-27細胞發(fā)生凋亡

自噬與凋亡均為細胞生命活動的重要調(diào)控機制,參與眾多生理病理過程,二者的關(guān)系復(fù)雜,各自的調(diào)控通路之間發(fā)生交聯(lián),形成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò),共同維持細胞內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡[8]。有文獻報道[9]自噬與凋亡的關(guān)系可分為3 種:自噬與凋亡互不干涉,自噬誘導凋亡,自噬抑制凋亡。為進一步研究TP誘導的自噬與凋亡的關(guān)系,選擇自噬抑制劑氯喹(CQ)以及巴伐洛霉素A1(BafA1)處理口腔癌CAL-27細胞,結(jié)果顯示自噬抑制劑預(yù)處理細胞2 h后,能夠減少TP(10 μg/L,24 h)誘導的細胞凋亡,與對照組相比,自噬抑制劑組細胞凋亡發(fā)生率顯著下降(圖2A),同時在分子水平得到了類似的結(jié)論,自噬抑制劑組凋亡蛋白PARP和Caspase-9剪切體表達明顯下調(diào),與對照組相比有顯著性差異(圖2B～C)。說明在口腔癌細胞中,雷公藤甲素通過自噬誘導細胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.4 雷公藤甲素通過PIM1-STAT3信號通路誘導CAL-27細胞自噬

為了確定雷公藤甲素誘導口腔癌細胞發(fā)生自噬的機制,Western Blot實驗檢測STAT3-PIM-1信號通路相關(guān)蛋白表達情況,結(jié)果顯示TP處理過的CAL-27細胞STAT3和PIM-1信號通路被抑制,隨著TP作用時間(12、24、48 h)和作用濃度(5、10、20 μg/L,24 h)的增加,STAT3和PIM-1蛋白表達水平顯著下調(diào)(圖4A～B),呈現(xiàn)一定的時間和劑量依賴性。說明雷公藤甲素可能通過調(diào)控PIM1-STAT3信號通路,從而誘導CAL-27細胞發(fā)生自噬。

圖4 雷公藤甲素通過PIM1-STAT3信號通路誘導CAL-27細胞自噬Fig 4 Triptolide induces autophagy of CAL-27 cells through PIM1-STAT3 signaling pathway

3 討 論

自噬是哺乳動物細胞高度保守的細胞內(nèi)能量代謝和細胞自我更新的機制,參與很多細胞生理病理過程,在機體穩(wěn)態(tài)維持過程中發(fā)揮重要作用[10]。然而,異常的自噬激活可能會導致腫瘤細胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)和細胞器的降解,而這些物質(zhì)是腫瘤細胞存活不可或缺的,這種異常的自噬最終導致自噬性細胞死亡,因此自噬可能會成為新的腫瘤治療的靶點,合理利用自噬能有效殺死腫瘤細胞,達到治療腫瘤的目的[11]。自噬所誘導的死亡屬于II型程序性死亡[12],一般認為其具體機制與凋亡有關(guān),有學者認為細胞自噬發(fā)生后進一步誘導凋亡從而引起細胞死亡,已有研究表明自噬和凋亡的調(diào)控信號通路在許多方面有相互交叉(crosstalk)[13]。本研究證實從雷公藤中提取的單體有效成分雷公藤甲素能夠誘導口腔癌細胞發(fā)生自噬,進一步通過自噬抑制劑預(yù)處理細胞考察自噬與凋亡的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)自噬位于凋亡上游,且自噬與凋亡有直接聯(lián)系,抑制自噬能減少凋亡的發(fā)生,說明本論文體系中自噬與凋亡的關(guān)系是:自噬誘導凋亡,且自噬位于凋亡上游。

原癌基因PIM1作為蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶參與調(diào)控多個信號通路,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的多個過程中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)PIM1與信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)家族存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系[14]。而STAT3信號通路也是調(diào)控腫瘤細胞自噬的經(jīng)典途徑[15]。已有研究證實,缺氧刺激后微膠質(zhì)細胞會通過STAT3信號通路激活細胞發(fā)生自噬性死亡[16],也有研究發(fā)現(xiàn)在人類成纖維細胞中,STAT3能夠被IL-27調(diào)控,進而影響細胞自噬與凋亡[17]。這充分說明PIM1與STAT3在細胞自噬以及凋亡的發(fā)生過程中有著不可忽視的生物學作用,同時也有研究表明自噬很有可能成為口腔癌治療的有效靶點,具有很大的臨床開發(fā)潛力[18]。本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素處理人口腔癌細胞后,會抑制PIM1-STAT3信號通路,誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬,進而誘導凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述,雷公藤甲素能夠誘導口腔鱗狀細胞癌細胞自噬,并進而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用,在這一過程中細胞PIM1-STAT3信號通路被明顯抑制。本研究證實了了雷公藤甲素誘導口腔鱗狀細胞癌細胞自噬與凋亡的關(guān)系,并初步探討了相關(guān)機制,為雷公藤甲素在臨床上更廣泛的使用提供了一定的理論基礎(chǔ)。