沈想 王陳飛 張敏 梅幼敏

II型糖尿病是牙周病的主要誘發(fā)因素之一,而牙周病是成年人失牙的主要原因,也是諸多全身性疾病的重要危險(xiǎn)因素,如何預(yù)防T2DM患者的牙周病的發(fā)生成為近年來(lái)關(guān)注的熱點(diǎn)[1-3]。環(huán)狀RNA(CircRNA)是一種非編碼RNA,在糖尿病及其并發(fā)癥的病理過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用,并與牙周組織炎癥密切相關(guān)[4-6]。NLRP3炎癥小體是Nod 樣受體家族中一類含有 pyrin 結(jié)構(gòu)域的蛋白3功能復(fù)合體,已被發(fā)現(xiàn)在牙周組織炎癥的發(fā)生中扮演著重要角色[7],但相關(guān)機(jī)制仍不明確,因此本研究初步探討在T2DM環(huán)境下,BMDMs中circRNA_TRMP7對(duì)NLRP3炎癥小體激活的調(diào)控作用,并檢測(cè)分析相關(guān)炎癥因子的表達(dá),為T2DM牙周組織炎癥的病因?qū)W研究及精準(zhǔn)預(yù)防提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液(天津?yàn)?;DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO公司,美國(guó));胎牛血清(HYCLONE公司,美國(guó));Murine M-CSF(Peprotech,美國(guó));RNA提取試劑盒(上海生工);PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM(大連TaKara公司);兔源NLRP3、Caspase-1 p20多克隆抗體(Abcam,美國(guó));IL-1β、IL-18-Elisa試劑盒(Novus,美國(guó));熒光分光光度儀(F-7000,日立,日本);基因PCR擴(kuò)增儀(Mastercycle X50,Eppendorf公司,德國(guó));實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(7300 Realtime PCR system,Applied Biosystems公司,美國(guó));SDS-PAGE電泳儀(1645050,Bio-Rad公司,美國(guó))。

1.2 人血PMBCs提取和全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

本研究選取2020 年1 月～2022 年1 月南通大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科16 例T2DM患者(年齡35～62 歲)作為實(shí)驗(yàn)組(根據(jù)《中國(guó)2型糖尿病防治指南》中的T2DM 診斷標(biāo)準(zhǔn)),選取南通大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心21 例健康人作為對(duì)照組(年齡35～65 歲)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)牙周病(根據(jù)2018 年牙周病國(guó)際新分類)及影響牙周病的其他系統(tǒng)性疾病(如艾滋病、風(fēng)濕及腫瘤等);(2)吸煙史;(3)3 個(gè)月內(nèi)有全身性抗菌藥物、類固醇及非甾體類抗炎藥物應(yīng)用史。研究對(duì)象對(duì)所有治療過(guò)程知情同意,并簽署知情同意書。本研究獲得南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):2021-L088)。

提取外周血至分離液液面上,離心,吸取單個(gè)核細(xì)胞層與清洗液混勻,離心棄上清收集PBMCs。PBMCs去除核糖體RNA,片段化處理、建庫(kù)、測(cè)序獲得RNA序列信息。利用kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異的circRNA進(jìn)行Pathway分析和超幾何分布檢驗(yàn),尋找與差異circRNA可能相關(guān)的信號(hào)通路。

1.3 T2DM小鼠建模

隨機(jī)選取4 周齡C57BL/6小鼠10只,對(duì)照組是非糖尿病的正常小鼠,以高脂飲食喂養(yǎng)4 周,STZ溶液(80 mg/kg)腹腔注射,高脂飲食喂養(yǎng)2 周,測(cè)血糖;成功標(biāo)準(zhǔn):隨機(jī)血糖值>16.7 mmol/L、多飲多食多尿,體重減輕。

1.4 BMDMs的極化誘導(dǎo)和siRNA干擾

取6～8 周C57BL/6小鼠脛骨和股骨骨髓,裂紅細(xì)胞重懸,高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)(含murine M-CSF)5 d,收集BMDMs。更換培養(yǎng)液(含50 ng/mL的LPS和10 ng/mL的IFN-γ)誘導(dǎo)24 h,收集M1型巨噬細(xì)胞。雙鏈小分子RNA(siRNA,銳博生物科技有限公司)轉(zhuǎn)染M1型巨噬細(xì)胞,抑制circRNA_TRMP7的表達(dá)。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

提取細(xì)胞總RNA,測(cè)定濃度(純度1.6～1.8),RNA逆轉(zhuǎn)錄,實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增cDNA,2-ΔΔCT統(tǒng)計(jì)分析各組circRNA的表達(dá)(β-actin內(nèi)參)。

1.6 免疫組化實(shí)驗(yàn)

提取小鼠下頜骨脫鈣制片、封閉、一抗孵育過(guò)夜、二抗孵育、顯色封片。每張切片隨機(jī)選擇不重疊的5 個(gè)視野(×40),Image J軟件分析陽(yáng)性著色區(qū)域的面積百分比,每組5 張不同切片,進(jìn)行組間比較。

1.7 Western blot和ELISA檢測(cè)

SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉、洗滌,一抗孵育過(guò)夜,二抗孵育1 h,洗膜曝光成像。應(yīng)用ELISA試劑盒和酶標(biāo)儀(設(shè)定540 nm校正波長(zhǎng))檢測(cè)各組細(xì)胞上清中的IL-18和IL-1β的濃度水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CircRNA在人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn),較對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組有38 個(gè)下調(diào)和36 個(gè)上調(diào)的circRNA(圖1)。選取上調(diào)前10的circRNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示circRNA_2562(circRNA_TRMP7)差異表達(dá)最為明顯,在放線菌素D作用下結(jié)構(gòu)也較為穩(wěn)定(圖2)。通過(guò)KEGG分析發(fā)現(xiàn)circRNA_TRMP7可能參與NOD樣受體相關(guān)的信號(hào)通路。

圖1 CircRNA在PBMSs的差異性表達(dá)及生物信息學(xué)分析Fig 1 The differential expression of circRNA PBMSs and bioinformatic analysis

圖2 結(jié)合全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選目標(biāo)circRNAFig 2 Screening the targeted circRNA based on transcriptome sequencing

2.2 NLRP3炎癥小體相關(guān)指標(biāo)在小鼠牙周組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果表明與對(duì)照組小鼠相比,NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白在T2DM小鼠的牙周組織中高表達(dá)(圖3A～E),兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖3C～F)。

圖3 小鼠牙周組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18免疫組化染色結(jié)果Fig 3 Immunohistochemical staining results of NLRP3 and Caspase-1 in the periodontal tissue of mice

2.3 巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的表達(dá)

RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組小鼠相比在T2DM小鼠M1型巨噬細(xì)胞中Caspase-1、NLRP3的表達(dá)較高 (圖4B～C);Elisa實(shí)驗(yàn)證實(shí),T2DM小鼠的M1型巨噬細(xì)胞上清中的IL-1β和IL-18含量較多(P<0.05)。提示T2DM可能促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體的激活(圖4D～E)。

圖4 Caspase-1、NLRP3在小鼠M1型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)以及IL-1β、IL-18在細(xì)胞上清中的含量Fig 4 Expression of Caspase-1 and NLRP3 in M1 macrophages and the content of IL-1β and IL-18 in cell supernatant of the mice

2.4 干預(yù)circRNA_TRMP7的表達(dá)對(duì)NLRP3炎癥小體激活的影響

應(yīng)用siRNA-circRNA_TRMP7轉(zhuǎn)染T2DM小鼠來(lái)源的M1型巨噬細(xì)胞,抑制circRNA_TRMP7的表達(dá),通過(guò)Western-blot和Elisa實(shí)驗(yàn)證實(shí)siRNA可以減弱M1型巨噬細(xì)胞中Caspase-1和NLRP3的表達(dá),降低細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18的含量(P<0.05)(圖5)。

3 討 論

牙周病的發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,同時(shí)也影響血糖控制,還可能誘發(fā)心血管疾病、腎病等其他并發(fā)癥。然而,因?yàn)門2DM患者牙周病變的發(fā)生較為隱蔽,在臨床上難以把握早期預(yù)防的時(shí)機(jī)[8-9]。2011年首次提出了“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”的概念,作為其重要分支之一,口腔精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)要求對(duì)口腔疾病發(fā)生的分子機(jī)制做深入研究,以實(shí)現(xiàn)對(duì)口腔疾病的“精準(zhǔn)預(yù)防”[10]。而口腔精準(zhǔn)預(yù)防的核心目標(biāo)之一即是對(duì)“口腔亞健康”狀態(tài)的檢測(cè)[11-12]。因此,在T2DM環(huán)境下的牙周組織中探尋炎癥的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。巨噬細(xì)胞是牙周組織中的一種免疫細(xì)胞,T2DM會(huì)誘發(fā)巨噬細(xì)胞的激活,促進(jìn)炎癥因子的分泌,在牙周炎癥發(fā)生的初始階段至關(guān)重要[13-14]。由此提示巨噬細(xì)胞可能是精準(zhǔn)預(yù)防T2DM牙周組織炎癥發(fā)生的重要細(xì)胞之一。

circRNA是一種單鏈內(nèi)源性的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)。大量研究表明,circRNA在不同疾病中可呈現(xiàn)特異性表達(dá),并具有重要的調(diào)節(jié)功能。

有研究報(bào)道,在體外模擬牙周炎的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,circRNAMAP3K11會(huì)促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞增殖并抑制其凋亡;circRNA在牙周組織的再生修復(fù)和炎癥反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用[15-17]。本研究也證實(shí)在T2DM患者外周血來(lái)源的PBMCs中,circRNA_TRMP7的表達(dá)明顯增高。通過(guò)KEGG分析發(fā)現(xiàn)circRNA_TRMP7與NOD樣受體相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān),而NLRP3是該受體家族的重要成員之一,與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),從而提示circRNA_TRMP7可能參與T2DM牙周組織炎癥的發(fā)生。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3識(shí)別受體蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和半胱天冬酶-1前體(pro-caspase-1)組成,廣泛地存在于大量免疫細(xì)胞中。誘導(dǎo)炎癥小體的激活和caspase-1的活化,會(huì)引發(fā)炎癥因子IL-1β、IL-18的切割成熟和分泌[18-19]。有學(xué)者報(bào)道,在牙周炎患者牙周組織中,巨噬細(xì)胞內(nèi)的NLRP3和IL-1β表達(dá)明顯增高[20]。本研究發(fā)現(xiàn)在口內(nèi)檢查未發(fā)生牙周病的T2DM小鼠牙周組織中,NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18表達(dá)較高。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí),NLRP3和Caspase-1在T2DM小鼠的M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)較高,細(xì)胞上清中的IL-1β和IL-18分泌較多。提示在小鼠口腔亞健康狀態(tài)下,NLRP3炎癥小體已被激活。通過(guò)siRNA干預(yù)證實(shí),circRNA_TRMP7對(duì)NLRP3炎癥小體激活具有正向調(diào)控作用。綜上所述,circRNA_TRMP7和NLRP3炎癥小體可能成為精準(zhǔn)預(yù)防T2DM牙周組織炎癥發(fā)生的生物標(biāo)記物。