唐煒, 金方強(qiáng), 唐婷, 孫勤

新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生率呈逐年上升趨勢,是新生兒入院治療的常見病之一。過高的血清膽紅素可以通過血腦屏障干擾神經(jīng)細(xì)胞的正常代謝,尤其是早期新生兒,其血腦屏障通透性較高,中樞神經(jīng)系統(tǒng)對毒性物質(zhì)十分敏感,在血清未結(jié)合膽紅素水平較高的情況下極易造成神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂產(chǎn)生膽紅素腦病和膽紅素腦損傷,是臨床上新生兒致死殘疾重要原因之一[1-2]。另一方面,人體腸道為菌群提供了良好的生長和棲息環(huán)境[3]。研究表明,超過350種菌群寄生在人體腸道內(nèi),包括致病性和共生性微生物,它們相互作用和影響以保持動態(tài)平衡,在營養(yǎng)、維持生命中起著重要的作用[4-7]。在胃腸道中,菌群與宿主間相互制約、相互依存,處于動態(tài)平衡狀態(tài)[8-9],但是微生態(tài)系統(tǒng)失衡可導(dǎo)致細(xì)菌異位、免疫功能紊亂,使機(jī)體發(fā)生多種疾病[10-11]。新生兒腸道微生態(tài)始于母親子宮內(nèi),但嬰兒期是腸道菌群形成的關(guān)鍵時(shí)期,具有動態(tài)變化、對外敏感、易受刺激等特點(diǎn)[12]。包括早產(chǎn)、配方奶喂養(yǎng)、抗生素治療、分娩方式等都對腸道微生態(tài)多樣性和機(jī)體免疫功能的狀況有直接的影響[13-14]。其中,抗生素使用可造成腸道微生物群改變致使菌群定植異常,影響腸黏膜屏障保護(hù)功能[15-17]。本研究擬通過16s rRNA高通量測序方法[18]為基礎(chǔ),比較不同分娩方式和不同抗生素使用情況下高膽紅素血癥新生兒腸道菌群分布特點(diǎn),不同分娩方式高膽紅素血癥新生兒腸道菌群代謝產(chǎn)物變化,腸道微生態(tài)與新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性?；诖搜芯?通過早期分娩方式的宣傳教育和治療中抗生素應(yīng)用的規(guī)范化,旨在為預(yù)防和更好地治療新生兒高膽紅素血癥提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)支撐和臨床應(yīng)用實(shí)踐。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院2021年1～12月新生兒科入院治療的新生兒高膽紅素血癥患者90例作為研究對象,其中男47例,女43例;胎齡(38.8±1.3)周;出生體質(zhì)量(3.35±0.41)kg。

按患兒出生方式又分為剖宮產(chǎn)組57例和順產(chǎn)組33例。兩組新生兒在性別、胎齡、出生體質(zhì)量方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表1。

表1 剖宮產(chǎn)組和順產(chǎn)組患兒一般資料比較

患兒入新生兒科有部分高膽紅素血癥新生兒預(yù)防性使用了抗生素3 d,根據(jù)抗生素使用情況分為頭孢地嗪組32例,頭孢西丁組30例和空白對照組(未使用抗生素)28例。3組患兒在性別、胎齡、出生體質(zhì)量方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表2。

表2 頭孢地嗪組、頭孢西丁組和對照組患兒一般資料比較

同期選擇我院產(chǎn)科母嬰同室新生兒40例作為正常對照組。高膽紅素血癥組和正常對照組新生兒在性別、胎齡和出生體質(zhì)量方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。見表3。

表3 高膽紅素血癥和正常對照組新生兒一般資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識》中新生兒高膽紅素血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[19]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)新生兒母親為初產(chǎn)婦,年齡20～30歲,無妊娠高血壓、腎臟疾病、貧血及糖尿病等妊娠期合并癥。(2)胎兒出生時(shí)無產(chǎn)傷窒息,Apgar評分正常,出生體質(zhì)量2 500～4 000 g,胎齡37～42周,生后半小時(shí)開奶。(3)產(chǎn)后3～5 d皮膚出現(xiàn)黃染,血清總膽紅素超過Bhutani曲線95百分位數(shù),以非結(jié)合膽紅素增高為主。(4)患兒家屬知情同意,且本研究已通過江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審查(SWYXLL20200429-4)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 出生時(shí)或生后伴有呼吸窘迫、頭顱血腫、顱內(nèi)出血、新生兒出血病、咽下綜合征等。

1.5 研究方法

1.5.1 標(biāo)本采集、保存和處理 采集高膽紅素血癥組新生兒入院第1天治療前、治療后第3天及產(chǎn)科正常對照組新生兒糞便標(biāo)本,-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 腸道菌群檢測 (1)以16s rRNA高通量測序?yàn)闄z測依據(jù)。提取納入研究的新生兒糞便標(biāo)本gDNA,通過Onedrop檢測gDNA濃度和純度,瓊脂糖凝膠檢測其質(zhì)量;檢測合格后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物的濃度和質(zhì)量,MD酶標(biāo)儀檢測產(chǎn)物濃度,QiagenQIAquick PCR purification kit回收產(chǎn)物,Aglient 2200 Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)控;合格后予IlluminaMiseq高通量測序儀進(jìn)行測序。

(2)生物信息學(xué)分析:對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼濾后得到有效數(shù)據(jù),基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行operational taxonomic units(OTUs)聚類和物種分類分析,并將OTU和物種注釋結(jié)合,從而得到每個樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果。再對OTUs進(jìn)行豐度分析,菌群屬水平相對豐度計(jì)算公式=該菌的基因拷貝數(shù)/總拷貝數(shù)。

1.6 高未結(jié)合膽紅素血癥腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測 操作人員戴無菌手套和口罩,用無菌離心管采集高膽紅素血癥和正常對照組新生兒納入研究治療前的糞便標(biāo)本,每一例收集約10 g糞便,-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測糞便上清液中細(xì)菌代謝產(chǎn)物變化,比較高膽紅素血癥和正常新生兒腸道菌群代謝產(chǎn)物變化,分析與高膽紅素血癥相關(guān)的代謝標(biāo)志物。

液相色譜為美國Thermo公司超高效液相色譜系統(tǒng),色譜柱為(BEH)C18柱,流動相A為超純水,流動相B為色譜純乙腈,流動相中加入0.1%(V/V)甲酸,流速0.3 mL/min;以線性梯度洗脫,初始條件為2%的流動相B保持0.5 min,2%～50%流動相B(0.5～9 min);50%～98%流動相B(9～12 min),98%流動相B(12～13 min),98%～2%流動相B(13～14 min),平衡色譜柱1 min后采集下一個樣品。每次進(jìn)樣量為4 μL,柱溫40 ℃,自動進(jìn)樣器溫度維持在4 ℃。電噴霧電離源正負(fù)離子電離模式。離子源溫度120 ℃,脫溶劑溫度300 ℃,脫溶劑氮?dú)饬魉?50 L/h,錐孔反吹氮?dú)?0 L/h。正離子和負(fù)離子模式毛細(xì)管電離電壓分別為3.0 kV和2.8 kV,錐孔電壓為27 eV,碰撞能為6 eV,四極桿掃描范圍50～1 500 m/z。

運(yùn)用非參數(shù)單變量檢驗(yàn)方法——秩和檢驗(yàn)篩選高膽紅素血癥和正常新生兒之間顯著差異性代謝物;使用錯誤發(fā)生率檢測法對結(jié)果進(jìn)行檢測,以降低上一步中篩選出的差異性代謝物假陽性率;運(yùn)用主成分分析法和最小二乘判別分析法對差異性代謝物進(jìn)一步篩選,結(jié)合人類代謝物數(shù)據(jù)庫和京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫查找上述篩選出的代謝物來源及涉及的代謝通路,同時(shí)分析是否存在來源于人類腸道菌群參與的代謝通路。

2 結(jié)果

2.1 新生兒腸道菌群主成分分析 高膽紅素血癥組新生兒腸道菌群屬水平相對豐度前96%的菌屬,比較正常新生兒和高膽紅素血癥新生兒腸道菌屬之間的差異,結(jié)果顯示,共檢出46種差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的細(xì)菌,其中腸球菌屬、埃希菌屬、未分類的腸桿菌科等細(xì)菌在高膽紅素血癥新生兒腸道內(nèi)含量明顯高于正常新生兒,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);擬桿菌屬、未分類的毛螺菌科、普雷沃菌屬等細(xì)菌在正常新生兒腸道內(nèi)含量明顯高于高膽紅素血癥新生兒,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 高膽紅素新生兒和正常新生兒腸道菌群分析[M(P25,P75)]

基于所有菌屬,完成高膽紅素血癥新生兒腸道菌群主成分分析。結(jié)果顯示,剖宮產(chǎn)出生和順產(chǎn)出生高膽紅素血癥新生兒腸道菌群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且剖宮產(chǎn)出生的新生兒更容易發(fā)生高膽紅素血癥,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。入院治療后,頭孢地嗪組、頭孢西丁組和空白對照組高膽紅素血癥新生兒腸道菌群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同分娩方式和不同抗生素干預(yù)高膽紅素血癥

2.2 不同分娩方式高膽紅素血癥新生兒腸道菌群分析 剖宮產(chǎn)組和順產(chǎn)組高膽紅素血癥新生兒腸道菌群屬水平相對豐度前96%的菌屬,比較兩組新生兒腸道菌屬之間的差異,結(jié)果顯示,高膽紅素血癥新生兒中順產(chǎn)組與肉食桿菌屬、紫單胞菌科呈正相關(guān)(P<0.05),剖宮產(chǎn)組與未分類的腸桿菌科呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖1和表5。

表5 剖宮產(chǎn)組和順產(chǎn)組高膽紅素血癥新生兒組腸道差異菌群相關(guān)性分析

2.3 不同抗生素使用組高膽紅素血癥新生兒腸道菌群分析 頭孢地嗪組、頭孢西丁組和空白對照組高膽紅素血癥新生兒腸道菌群屬水平相對豐度前96%的菌屬存在明顯差異。結(jié)果顯示,高膽紅素血癥新生兒中頭孢地嗪組、頭孢西丁組與雙歧桿菌呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),空白對照組與肉食桿菌屬、腸球菌和乳桿菌屬呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),空白對照組與浮絲藻屬和韋永球菌屬呈正相關(guān)(P<0.05),頭孢地嗪組與未分類的腸桿菌科和韋永球菌屬呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見圖1和表6。

表6 頭孢地嗪組、頭孢西丁組和空白對照組高膽紅素血癥新生兒組腸道差異菌群相關(guān)性分析

2.4 抗生素使用高膽紅素血癥新生兒腸道代謝產(chǎn)物特征 與正常對照組新生兒相比,抗生素使用組高未結(jié)合膽紅素血癥新生兒代謝變化主要在磷酸戊糖途徑(P<0.01),主要代謝通路是丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝(P<0.01)。腸球菌和肉食桿菌屬與差異代謝產(chǎn)物琥珀酸呈正相關(guān)(rs=0.692 3,0.521 7,P<0.01)。

3 討論

本研究顯示,剖宮產(chǎn)和順產(chǎn)出生高膽紅素血癥新生兒腸道菌群存在明顯差異,肉食桿菌屬、紫單胞菌科與順產(chǎn)組高膽紅素血癥新生兒存在正相關(guān)性,未分類的腸桿菌科與剖宮產(chǎn)組高膽紅素血癥新生兒存在正相關(guān)性。剖宮產(chǎn)出生的新生兒更容易發(fā)生高膽紅素血癥,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。順產(chǎn)分娩的新生兒腸道菌群的多樣性明顯多于剖宮產(chǎn)分娩的新生兒。研究表明,嬰兒出生前腸道呈無菌狀態(tài),出生第1周內(nèi),其腸道菌群的首次演替受母體腸道微生態(tài)、分娩方式、喂養(yǎng)類型[20-21],因此在新生兒腸道定植的微生物來源于母體的產(chǎn)道和腸道[22]。相比較,順產(chǎn)分娩的新生兒腸道有益微生物總占比更高,腸道菌群具有更高的多樣性,但剖宮產(chǎn)的新生兒要相對單一。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),剖宮產(chǎn)新生兒腸道差異菌群未分類的腸桿菌科屬于醫(yī)院環(huán)境中常見的微生物,幾乎從臨床各科感染標(biāo)本中都能分離培養(yǎng)出腸桿菌科的細(xì)菌。其中,革蘭陰性桿菌感染近年來呈現(xiàn)增長趨勢,約占醫(yī)院感染的60%～65%。同時(shí),腸桿菌科在院內(nèi)感染中除自身感染或醫(yī)療過程中導(dǎo)管、插管、輸液、手術(shù)等交叉感染外,與醫(yī)院環(huán)境中醫(yī)護(hù)人員手、物體表面等可能也有一定關(guān)系,具有潛在的致病性,抗生素耐藥性的可能性也更高。因而我們可以預(yù)判,超過80%的剖宮產(chǎn)嬰兒都會攜帶那些在醫(yī)院中廣泛存在的機(jī)會性致病菌,且伴隨時(shí)間變化,嬰幼兒腸道內(nèi)菌群種類由需氧菌和兼性厭氧菌向厭氧菌轉(zhuǎn)變,腸道菌群從無到有、從簡單到復(fù)雜、從不穩(wěn)定到穩(wěn)定發(fā)生進(jìn)一步轉(zhuǎn)變。另一方面,本研究通過入院治療中使用頭孢地嗪組,頭孢西丁組和對照組相比較,高膽紅素血癥新生兒腸道菌群存在明顯差異,雙歧桿菌與頭孢地嗪組和頭孢西丁組高膽紅素血癥新生兒存在負(fù)相關(guān)性,肉食桿菌屬、腸球菌和乳桿菌屬與對照組高膽紅素血癥新生兒存在負(fù)相關(guān)性,浮絲藻屬和韋永球菌屬與對照組高膽紅素血癥新生兒存在正相關(guān)性,未分類的腸桿菌科與頭孢地嗪組高膽紅素血癥新生兒存在負(fù)相關(guān)性。根據(jù)前期研究,約47%的新生兒接受過一種及以上抗生素,其使用合理性仍然存疑[23-24]。例如,抗生素的早期使用與炎癥性腸病有相關(guān)性[25-26],新生兒即使只接受一次阿莫西林療程也會擾亂腸道微生物群的組成[27]。本研究表明,抗生素使用會使大便菌群多樣性降低,增加腸道潛在致病的腸球菌、肉食桿菌等的百分比,同時(shí)降低益生菌雙歧桿菌的比例[28-29],新生兒期抗生素暴露與腸道微生態(tài)存在密切聯(lián)系[30]。同時(shí),腸道微生物在膽紅素的腸肝循環(huán)和膽紅素的排泄中起著重要的作用。在剖宮產(chǎn)出生和抗生素使用的新生兒腸道微生物群中,益生菌明顯減少,有害細(xì)菌明顯增加。這些有害細(xì)菌可能通過半乳糖代謝途徑參與膽紅素代謝,導(dǎo)致微生物群失衡[31]。在膽紅素代謝中,新生兒正常腸道菌群可以轉(zhuǎn)化偶聯(lián)膽紅素轉(zhuǎn)化為糞膽紅素原,其中大部分隨糞便排出。當(dāng)新生腸道菌群發(fā)生失衡,膽紅素腸肝循環(huán)加速,導(dǎo)致新生兒高膽紅素血癥。微生物多樣性減少是生態(tài)失調(diào)的主要特征。腸道物種多樣性的降低會影響膽紅素代謝。代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),與空白對照組新生兒相比,抗生素使用組高膽紅素血癥新生兒代謝變化主要在磷酸戊糖途徑,丙氨酸,天門冬氨酸和谷氨酸代謝。腸球菌和肉食桿菌屬與差異代謝產(chǎn)物琥珀酸呈正相關(guān)。新生兒血清膽紅素水平的升高可出現(xiàn)患兒全身多器官的功能損害,腸道菌群在膽紅素的代謝過程中起到了至關(guān)重要的作用,腸道菌群代謝需要的碳水化合物主要來自食物和機(jī)體蛋白質(zhì)、肽和消化酶,機(jī)體葡萄糖、氨基酸和脂肪的代謝會影響腸道菌群的代謝;同時(shí),腸道細(xì)菌同時(shí)又能參與機(jī)體代謝,完成數(shù)種宿主細(xì)胞不能催化進(jìn)行的酶反應(yīng),腸道菌群及其代謝產(chǎn)物影響宿主的代謝穩(wěn)態(tài),機(jī)體代謝功能的障礙與腸道菌群的變化密切相關(guān)。腸道菌群還可通過改變肝功能調(diào)節(jié)膽紅素的代謝,完善免疫系統(tǒng),提高肝酶活性,促進(jìn)膽紅素的結(jié)合和排泄。

綜上,本研究顯示了高膽紅素血癥和正常新生兒腸道菌群存在差異,順產(chǎn)組和剖宮產(chǎn)組高膽紅素血癥新生兒以及頭孢地嗪組、頭孢西丁組和空白對照組高膽紅素血癥新生兒腸道菌群存在差異,且不同抗生素使用后高膽紅素血癥新生兒腸道菌群代謝產(chǎn)物變化。腸道微生物及其代謝產(chǎn)物對于維持血清膽紅素水平有很大的作用,加強(qiáng)腸道代謝有助于降低新生兒血清膽紅素水平?？股厥褂媒M高膽紅素血癥腸道內(nèi)的差異菌群參與或影響機(jī)體葡萄糖、氨基酸等重要物質(zhì)的代謝,而機(jī)體本身的各種相關(guān)代謝又可以影響腸道菌群的變化,這些代謝過程的變化可能直接或間接影響膽紅素代謝。本研究顯示了高膽紅素血癥和正常新生兒差異腸道菌群、分娩方式和抗生素的使用對高膽紅素血癥新生兒腸道菌群及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響,這些研究結(jié)果是證明人體腸道菌群可以影響血清膽紅素水平的有力證據(jù),探討了腸道微生態(tài)與新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性,對于預(yù)測新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生具有指導(dǎo)意義,通過早期分娩方式的宣教和治療中抗生素應(yīng)用的規(guī)范化,以及標(biāo)志性腸道菌群在新生兒以及高膽紅素血癥新生兒預(yù)防和治療中的使用,為新生兒高膽紅素血癥的早期發(fā)現(xiàn)、早期預(yù)防和早期治療提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。