陳清愛, 李 玨, 林旭聰, 3

(1. 福建商學院 旅游與休閑管理學院, 福建 福州 350012; 2. 福州大學 化學學院, 福建 福州 350108;3. 福建省產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全檢測試劑與儀器工程技術(shù)研究中心, 福建 福州 350108)

在豐富的氨基酸、 不飽和脂肪酸等,因此在貝類毒素分析中需要對分析樣品進行高效的預處理。在DA毒素的分析中,現(xiàn)有前處理技術(shù)主要包括快速、 簡易、 廉價、 高效、 安全的樣品前處理技術(shù)QuEChERS[3]、 固相萃取[4]、 磁性固相萃取[5]等。整體柱型管內(nèi)固相微萃取(In-tube SPME)技術(shù)[6]具有自動化、 小型化和高通量等優(yōu)點,作為一種新興的在線前處理技術(shù)得到了重視。Song等[7-8]合成了一種磁增強管內(nèi)微萃取整體柱,與高效液相色譜(HPLC)-紫外光譜(UV)聯(lián)用實現(xiàn)了對有機鉛、有機錫等污染物的靈敏檢測。上述研究為In-tube SPME技術(shù)應用于DA毒素污染物的在線富集和分析提供了良好支撐,然而普通的整體柱存在的比表面積小(18.4～4.36 m2/g)[9]、 作用位點少的問題,導致整體柱對目標物的吸附作用弱, 不利于DA在柱內(nèi)的在線富集。 為了解決這個問題, 許多的功能材料可被用于改善色譜固定相的比表面。 其中, 金屬有機骨架(MOF)多孔結(jié)晶材料具有可調(diào)節(jié)的孔徑、 高度有序的骨架拓撲結(jié)構(gòu)和較大的比表面積, 越來越多地被用于改善色譜固定相的性能[10]。 目前, MOF與整體柱的結(jié)合主要是通過將MOF顆粒摻入整體柱的預聚液中, 通過一鍋法將MOF顆粒嵌入整體聚合材料[11-12], 但是導致MOF在整體柱中分布不均勻、 MOF被嚴重包埋等缺陷[13]。迄今, 在整體柱內(nèi)原位生長MOF的報道甚少,基于MOF修飾的整體柱對DA進行高效在線富集研究仍未見報道。

沸石咪唑酯骨架ZIF-8具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、 比表面積大的優(yōu)點[14],可以極大地改善整體柱聚合相表面吸附性能,并且ZIF-8結(jié)構(gòu)中豐富的Zn2+離子可以與DA毒素中羧基(—COOH)和仲氨基(—NH—)發(fā)生有效的配位作用而實現(xiàn)高效吸附[15]。本文基于整體柱柱后衍生引入咪唑基團、 ZIF-8原位生長技術(shù)[16], 在多面體低聚倍半硅氧烷(POSS-MA)和甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)共聚物表面包覆ZIF-8, 制備ZIF-8修飾整體柱, 并以此構(gòu)建一種基于ZIF-8高比表面吸附和Zn2+配位作用的DA毒素在線In-tube SPME新技術(shù),發(fā)揮MOF表面吸附和金屬配位作用的協(xié)同應用,實現(xiàn)DA在ZIF-8功能化整體柱上的高效在線富集。本文中對整體柱結(jié)構(gòu)和性能進行表征,考察整體柱的選擇性,優(yōu)化實驗條件對DA富集的影響,結(jié)合高效液相色譜-二極管陣列檢測技術(shù)(HPLC-PDA),實現(xiàn)貝類產(chǎn)品中DA的在線管內(nèi)微萃取和靈敏分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

1.1.1 試劑

甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)[純度97%(質(zhì)量分數(shù),下同)]、 多面體低聚倍半硅氧烷(POSS-MA)(純度98%)、 γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅(γ-MAPS)(純度98%)、 環(huán)己醇、 十二醇(純度98%)均購自默克Sigma Aldrich公司; 偶氮二異丁腈(AIBN)(分析純)、 六水合硝酸鋅(純度95%)、 2-甲基咪唑、 1-(3-氨基丙基)咪唑(純度99%)均購自Aladdin公司; 軟骨藻酸(純度98%)購自Across公司; 所用二次水均為科爾頓超純水系統(tǒng)處理水。

1.1.2 儀器設(shè)備

EasySep-1020LC型液相色譜泵, 美國通微技術(shù)股份有限公司; PHS-3C型精密酸度計, 上海大普儀器有限公司; DKB-501A型超級恒溫水槽, 上海精宏實驗設(shè)備有限公司; LC-20A型高效液相色譜儀,日本島津公司; XL30型掃描電子顯微鏡, 賽默飛世爾科技有限公司; Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀, 美國Nicolet公司; D8 ADVANCE A25型X射線衍射儀,德國布魯克公司。

1.2 整體柱制備和在線富集檢測

ZIF-8修飾整體柱的制備過程及對DA的在線富集檢測流程如圖1所示。

1.2.1 整體柱基質(zhì)的制備

將質(zhì)量分數(shù)分別為17.5%、 12.5%的GMA單體、 POSS-MA單體溶解于由質(zhì)量分數(shù)分別為30%、 40%的環(huán)己醇、 十二醇混合而成的溶劑中,混合均勻,加入單體和致孔劑總質(zhì)量1%的引發(fā)劑AIBN,將所得的混合液渦旋混勻、 脫氣,配成聚合液。將預聚液使用容積1 mL注射器緩緩注入烯基衍生的石英毛細管中,密封兩端,平放置于60 ℃水浴中聚合反應20 h,制得整體柱基質(zhì)。使用液相色譜泵通入甲醇,洗去前體、 致孔劑以及低聚物殘留,備用。

1.2.2 ZIF-8修飾整體柱的制備

將1-(3-氨基丙基)咪唑的濃度為1 mol/L的甲醇溶液注入20 μL定量環(huán)中,體積流量為1 μL/min,通過液相色譜泵將1-(3-氨基丙基)咪唑的甲醇溶液推入裝有整體柱基質(zhì)的石英毛細管中,直到pH試紙變藍后繼續(xù)通10 min。將兩端密封,置于65 ℃水浴反應12 h。反應完成后采用液相色譜泵通入甲醇將1-(3-氨基丙基)咪唑衍生的整體柱清洗至流出液呈中性,保存。

(a)ZIF-8修飾整體柱的制備

(b)在線管內(nèi)富集-高效液相色譜(HPLC)分析流程

將硝酸鋅的濃度為20 mmol/L的甲醇溶液注入定量環(huán)中,以6.5 mPa的壓力將溶液推入1-(3-氨基丙基)咪唑衍生的整體柱中反應30 min;將濃度為20 mmol/L的2-甲基咪唑通入Zn2+衍生的整體柱,反應形成ZIF-8,完成一次生長。將整體柱清洗5 min后循環(huán)重復若干次上述反應,在整體柱內(nèi)原位生長ZIF-8。

1.2.3 在線富集檢測方法

ZIF-8修飾整體柱對DA的在線富集檢測過程包括柱上富集吸附、洗脫和檢測。

1)柱上富集吸附。 將含有DA的樣品注射入2 mL樣品環(huán), 采用計量泵將定量環(huán)中樣品溶液注入所制備的ZIF-8修飾整體柱中, 進行In-tube SPME富集。

2)洗脫。向整體柱內(nèi)繼續(xù)通入三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液,清洗背景物質(zhì)和未結(jié)合的DA分子;切換流動相,選擇濃度為10 mmol/L、 pH為6.5的磷酸鹽緩沖液為洗脫液[15], 通入整體柱中, 洗脫DA, 所得洗脫液通入HPLC系統(tǒng)六通閥的采樣管, 收集洗脫液20 μL。

3)HPLC檢測。切換六通閥到注射狀態(tài),使樣品注入HPLC中進行檢測。檢測條件如下:色譜柱為C18色譜柱(填料粒徑為5 μm,內(nèi)徑為4.6 mm,長度為250 mm), 流動相為乙酸與乙腈體積比為83∶17的水溶液, 測定波長為242 nm,體積流量為1.0 mL/min,進樣體積為20 μL。

1.2.4 貝類樣品的準備

取新鮮的花蛤、 貽貝貝肉,剪碎后勻質(zhì)。稱取1.00 g勻漿貝肉樣品放置于容積10 mL離心管內(nèi),加入2 mL提取液(甲醇與水的體積比為4∶6),渦旋混勻 2 min,以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心分離5 min,取上清液。殘渣采用1 mL提取液重復提取2次,合并上清液,混勻,離心分離;上清液用 0.22 μm濾膜過濾,置于4 ℃避光環(huán)境保存。

加標樣品: 取1.00 g勻漿貝肉品樣置于離心管中,加入不同質(zhì)量的DA,振蕩混勻。后續(xù)提取、 離心、 過濾等操作同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 整體柱制備與表征

2.1.1 結(jié)構(gòu)表征

聚合單體中GMA和POSS-MA用量、致孔劑中環(huán)己醇和十二醇的比例對整體柱基質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響如表1所示。結(jié)果表明,隨著POSS-MA用量的增加,ZIF-8修飾整體柱滲透性減弱,整體柱結(jié)構(gòu)變得致密;隨著致孔劑中十二醇用量的增加,整體柱滲透性增強。配方3所制備的整體柱滲透性適中,因此應用于后續(xù)研究。圖2為制備的ZIF-8修飾整體柱的SEM圖像。由圖可以看出,整體柱柱內(nèi)填料與柱壁結(jié)合緊密,整體聚合結(jié)構(gòu)較為均勻、 通透。

2.1.2 紅外光譜和物相表征

圖3為整體柱基質(zhì)、 ZIF-8、 ZIF-8修飾整體柱的紅外光譜和X射線衍射(XRD)譜圖。由圖3(a)的紅外光譜可以看出,相比于整體柱基質(zhì),ZIF-8修飾整體柱在波數(shù)421 cm-1處出現(xiàn)了明顯的Zn—N鍵的吸收峰以及位于波數(shù)1 153、 1 572 cm-1的咪唑基團的吸收峰,這些譜峰與ZIF-8的特征峰一致,表明ZIF-8在整體柱表面進行有效修飾。

表1 整體柱基質(zhì)的配方及滲透性

圖2 沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱的掃描電子顯微鏡圖像

(a)紅外光譜(b)XRD譜圖圖3 整體柱基質(zhì)、 沸石咪唑酯骨架ZIF-8、 ZIF-8修飾整體柱的紅外光譜和X射線衍射(XRD)譜圖

由圖3(b)的 XRD譜圖可看出,在ZIF-8修飾整體柱中,位于衍射角2θ為7.3°、 10.36°、 12.72°、 14.72°、 16.5°、 18.039°、 22.16°、 24.52°、 24.72°等處的衍射峰對應于ZIF-8的(011)、 (002)、 (112)、 (022)、 (013)、 (222)、 (114)、 (233)、 (134)等晶面的衍射峰,表明ZIF-8在整體柱聚合相中成功合成。

2.1.3 比表面積表征

整體柱基質(zhì)、 ZIF-8修飾整體柱的氮氣吸附-脫附曲線如圖4所示。由圖可見,ZIF-8修飾整體柱聚合相的基于靜態(tài)氮氣多層吸附的比表面積大幅度增加。整體柱基質(zhì)的比表面積為25.16 m2/g,整體柱基質(zhì)表面原位修飾ZIF-8之后,比表面積大幅增長到了230.92 m2/g。整體柱表面被ZIF-8修飾后比表面積的大幅增加,并引入了更多的結(jié)合位點,可以有效提高整體柱的吸附性能。

2.2 性能

2.2.1 pH的影響

ZIF-8與DA的結(jié)合是通過Zn2+與DA分子中的羧基發(fā)生螯合作用產(chǎn)生的。DA分子中存在著3個羧基和1個仲氨基,羧基的解離常數(shù)pKa分別為2.10、3.72、 4.97,DA在溶液中的存在形態(tài)受溶液pH影響較大,導致DA分子中的羧基質(zhì)子化,與Zn2+的螯合效率受到影響。

圖4 沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱和整體柱基質(zhì)的氮氣吸附-脫附曲線

pH對ZIF-8修飾整體柱在線富集DA效率的影響如圖5所示。可以看出,隨著pH由6.0增大到7.0,ZIF-8修飾整體柱在線富集DA的效率逐漸提高,其原因是,隨著pH增大,DA分子中羧基的解離程度逐漸增大,而ZIF-8上的Zn2+正電性受影響較小,DA分子中的負電荷羧基與Zn2+結(jié)合程度增大。隨著pH由7.0增大到8.0,整體柱在線富集DA的效率顯著下降,主要原因是ZIF-8上的Zn2+結(jié)合OH-,使得整體柱表面的正電性降低,Zn2+與DA分子中羧基結(jié)合效率降低,整體柱對DA的回收率隨之下降。

圖5 pH對沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱在線富集軟骨藻酸效率的影響

2.2.2 流動相流量的影響

流動相流量對ZIF-8修飾整體柱在線富集DA性能的影響如圖6所示。通過在定量環(huán)前并聯(lián)反壓閥,調(diào)整柱前壓力為0.5～7.5 mPa,從而調(diào)節(jié)流動相的流量。隨著流動相流量的變化,整體柱對DA的回收率保持在92.4%～95.7%,流動相流量的變化未對整體柱在線吸附DA的效率產(chǎn)生明顯影響。

圖6 流動相流量對沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱在線富集軟骨藻酸效率的影響

2.2.3 共存金屬離子和氨基酸的影響

以色氨酸和金屬離子(K+、 Ca2+、 Na+、 Mg2+)為干擾物,將DA和干擾物按質(zhì)量比為1∶100混合,對DA進行富集洗脫,考察DA回收率來衡量ZIF-8修飾整體柱對DA吸附性能的影響,結(jié)果如圖7所示。從色氨酸和金屬離子作為干擾物時的洗脫液色譜圖可以看出,兩者中均出現(xiàn)了明顯的DA的色譜峰,回收率分別為無干擾物情況下的(93.4±1.5)%和(91.2±1.3)%(重復3次)。由于DA分子中有3個pKa不同的羧基,相比氨基酸,DA與Zn2+有更強的結(jié)合能力,因此ZIF-8與DA結(jié)合能力比對高濃度色氨酸的強。貝肉樣品中常見的堿金屬和堿土金屬與DA中羧基作用弱,對ZIF-8上Zn2+結(jié)合DA的作用不產(chǎn)生干擾。

2.2.4 方法檢測限、 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

采用所制備的ZIF-8修飾整體柱, 對DA進行100倍富集, 聯(lián)用HPLC-PDA, 對DA標準溶液進行測定, 方法的檢測限(LOD)(信噪比(S/N)為3)達到0.03 ng/mL, 定量限(LOQ)(S/N為10)為0.05 ng/mL。 鑒于貝類樣品提取液中存在較多的共存物質(zhì), 樣品處理過程中1.0 g貝肉采用4 mL提取液提取后進行分析, 貝肉樣品中DA的檢測限分析結(jié)果如圖8所示。 可以看出, 貝類樣品中DA經(jīng)過100倍富集后的檢測限 (S/N=3)為0.3 μg/kg,方法靈敏。

所制備的ZIF-8修飾整體柱在線富集檢測DA的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性結(jié)果見表2。 ZIF-8修飾整體柱對DA在線富集檢測的日內(nèi)、 日間、 批次間的回收率均在92%以上,3次重復測試的相對標準偏差(RSD)

(a)色氨酸(b)金屬離子(c)無干擾物圖7 色氨酸、 金屬離子為干擾物及無干擾物條件下軟骨藻酸(DA)萃取洗脫液色譜圖

圖8 貝肉樣品中軟骨藻酸(DA)的檢測限

分別為1.2%～1.9%、 1.6%～2.6%、 1.7%～3.2%, 表明整體柱具有良好的重現(xiàn)性。 進一步考察ZIF-8修飾整體柱的穩(wěn)定性以及使用壽命, 對同一根整體柱進行同上操作, 連續(xù)使用30 d后的回收率仍大于86%, ZIF-8鍵合整體柱具有良好的使用壽命。

2.3 在線檢測DA應用

將花蛤和貽貝的貝肉樣品分別經(jīng)ZIF-8修飾整體柱富集、 洗脫, 聯(lián)用HPLC-PDA進行DA檢測(簡稱本文方法), 結(jié)果見表3。 由表可見: 對于未加標的空白樣品, 均沒有檢測到DA的色譜峰; 對不同濃度DA的加標樣品, DA的檢出信號隨著DA濃度的增大而增大, 所制備的ZIF-8修飾整體柱聯(lián)用HPLC-PDA對樣品中的DA有較好的富集和檢出能力, 在加標質(zhì)量濃度為0.4～4.0 μg/kg時, 方法回收率為(91.4±2.4)%～(94.5±1.0)%, 與采用C18填料萃取柱進行固相萃取(SPE)前處理的液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)方法相比, 兩者檢測結(jié)果基本一致, ZIF-8修飾整體柱聯(lián)用HPLC-PDA在線富集檢測貝肉樣品中DA的結(jié)果良好。

表2 沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱在線富集檢測軟骨藻酸的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

3 結(jié)論

基于整體柱柱后衍生引入咪唑基團、 ZIF-8原位生長技術(shù), 本文中制備了ZIF-8修飾整體柱, 聯(lián)用HPLC-PDA, 實現(xiàn)了DA的在線富集及靈敏分析。 結(jié)果表明, ZIF-8修飾整體柱的比表面積達到230.92 m2/g, DA分子中的羧基與ZIF-8表面的Zn2+發(fā)生配位作用, 對DA的在線吸附效果顯著,對DA標準溶液的檢測限為0.03 ng/mL, 對貝肉提取液的檢測限達到0.3 μg/kg, 對DA分析靈敏度高;

表3 貝類樣品中軟骨藻酸的回收率(重復3次)

對DA在線富集檢測的日內(nèi)、 日間、 批次間的回收率均在92%以上,3次重復檢測RSD分別為1.2%～1.9%、 1.6%～2.6%、 1.7%～3.2%,具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。應用于花蛤和貽貝樣品分析,DA回收率分別達到了(92.4±2.5)%～(94.5±1.0)%、 (91.4±2.4)%～(92.6±1.5)%,結(jié)果良好,可為貝類產(chǎn)品中DA毒素在線高效富集和靈敏檢測提供了一種新的技術(shù)。