劉藝璇 ，吳琴 ，張亞男 ，蔡昱哲 ，李定祥 ，鄧奕輝

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

2021年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的第十版全球糖尿病地圖數(shù)據(jù)顯示，目前我國(guó)有1.4億成人糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2045年將增至1.74億[1]。非酒精性脂肪性肝病是糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]?！吨袊?guó)成人2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病管理專家共識(shí)》推薦使用吡格列酮治療，但慎用于伴心功能不全、水腫、骨折風(fēng)險(xiǎn)的患者，臨床用藥局限[3]。中藥在降糖方面具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，能夠有效避免單一成分導(dǎo)致的不良反應(yīng)[4]。

青錢柳Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja 是一種藥食同源植物，民間常以其葉作茶飲，有降糖功效。青錢柳調(diào)節(jié)糖脂代謝的藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)及具體作用機(jī)制尚待闡明。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合分析藥物成分，有助于揭示某種特定疾病相關(guān)的靶點(diǎn)及通路[5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)青錢柳防治糖尿病性脂肪肝的主要活性成分及潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其靶點(diǎn)及信號(hào)通路，為進(jìn)一步揭示其藥效成分和藥理作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 藥物化學(xué)成分收集與活性成分篩選

由于TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、中藥材綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）等數(shù)據(jù)庫(kù)均未收錄青錢柳相關(guān)關(guān)鍵詞，故檢索青錢柳相關(guān)文獻(xiàn)獲取其化學(xué)成分[6-9]。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載獲取的成分，部分成分的分子結(jié)構(gòu)通過(guò)ChemDraw20.0軟件繪制，將全部成分的分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissADME平臺(tái)（http://www.swissadme.ch/），以“GI absorption”項(xiàng)為“high”且“Druglikeness”至少2項(xiàng)“YES”為條件對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行篩選。將結(jié)果輸入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）及Super-PRED（http://prediction.charite.de/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取潛在靶點(diǎn)。使用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲取小分子靶點(diǎn)，設(shè)定Probability≥0.05；分子量＞200 者使用Super-PRED 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶點(diǎn)。

1.1.2 藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選的活性成分重新編號(hào)，利用Cytoscape3.9軟件構(gòu)建青錢柳活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析其活性成分與靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系。

1.1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)獲取

在CNKI學(xué)術(shù)翻譯助手平臺(tái)（https://dict.cnki.net/index）輸入“2型糖尿病”“非酒精性脂肪肝”獲取疾病英文詞匯，分別得到type 2 diabetic mellitus、type 2 diabetes mellitus、type 2 diabetes、diabetes mellitus、type 2 diabetes，以及nonalcoholic fatty liver disease、nonalcoholic fatty liver、nonalcoholic steatohepatitis，將所得詞匯分別輸入TTD（http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、DrugBank（http://www.drugbank.ca/atc） 及DisGeNET （https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，將檢索結(jié)果匯總后去重、取并集，再輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://uniprot.org/），設(shè)置 類 別 為“reviewed”“human”。采 用Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對(duì)青錢柳作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，即為青錢柳治療糖尿病性脂肪肝的潛在作用靶點(diǎn)。

1.1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將青錢柳治療糖尿病性脂肪肝的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.string-db.org/），設(shè)置參數(shù)為“Multiple proteins”“Homo sapiens”，置信度≥0.4，導(dǎo)出文件后利用Cytoscape3.9軟件構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.1.5 GO和KEGG通路富集分析

利用DAVID 在線分析平臺(tái)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，并利用微生信在線平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO分析條圖及KEGG分析氣泡圖。

1.1.6 活性成分-共同靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

使用Cytoscape3.9軟件內(nèi)置的merge功能取并集，構(gòu)建藥物活性成分-共同靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)表示青錢柳活性成分、靶點(diǎn)及通路，邊表示化合物所關(guān)聯(lián)的潛在靶點(diǎn)和通路。利用Network Analyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)模型特征分析，得到連接度（degree）、網(wǎng)絡(luò)密度等參數(shù)，獲取核心活性成分及靶點(diǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物、試藥與儀器

SPF級(jí)SD雄性大鼠36只，體質(zhì)量（210±10）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004，分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，通風(fēng)良好，每日12 h照明，相對(duì)濕度（50±5）%，溫度25 ℃，自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（LL2022022306）。

青錢柳由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)翦雨青研究員鑒定為胡桃科植物青錢柳Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja 的干燥葉。青錢柳水提物制備方法：取1 kg 青錢柳，加入12倍水，煮沸2 h，過(guò)濾，濾渣再加10倍水，煮沸1 h，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得濃縮液1 L（1 mL濃縮液含1 g原藥材），于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩｛}酸吡格列酮片（杭州中美華東制藥有限公司，批號(hào)2101401A），于研缽中碾成粉末后溶于生理鹽水，配制成1 mg/mL藥液。

Anti-mTOR（phospho S2448）抗體、Anti-Akt1（phospho S124）抗體（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為ab109268、ab81283），Akt1抗體、m-TOR抗體、PI3K抗體、GAPDH抗體（美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)分別為10176-2-AP、66888-1-Ig、20584-1-AP、10494-1-AP），p-PI3K抗體（北京博奧森公司，貨號(hào)bs-5570r），HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（中國(guó)Abiowell 公司，貨號(hào)AWS0002），ECL Plus超敏發(fā)光液（中國(guó)Abiowell公司，貨號(hào)AWB0005），顯影液、定影液（中國(guó)上海佳信公司，貨號(hào)分別為BW-61、BW-62），蘇木素染液、電鏡固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)分別為G1004、G1102），812 包埋劑（SPI 公司，貨號(hào)90529-77-4）。

Chemray 800全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技），BioPrep-24 生物樣品均質(zhì)儀（中國(guó)杭州奧盛），ChemiScope 6100 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國(guó)勤翔），Epoch酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek），HT7800/HT7700透射電子顯微鏡（日本HITACHI）。

1.2.2 造模

30 只SD 大鼠予高脂高糖飼料（59%普通飼料、18%豬油、20%蔗糖和3%蛋黃）喂養(yǎng)，并于第4周末腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg誘導(dǎo)2型糖尿病模型，72 h后尾部取血，用血糖儀測(cè)定血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L為模型制備成功。成模率為70%，共納入21只成模大鼠。1周后，隨機(jī)選取3只大鼠進(jìn)行肝臟組織HE染色，可見(jiàn)肝臟脂肪變性。血糖指標(biāo)與肝臟病理變化均滿足上述條件者即為糖尿病性脂肪肝模型[10-11]。

1.2.3 分組及給藥

將18 只成模大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、吡格列酮組（10 mg/kg）、青錢柳組（0.54 g/kg），每組6只。6只普通飼料喂養(yǎng)大鼠作為空白組。青錢柳臨床推薦用量70 kg成人為6 g/d，按人與大鼠體表面積折算，大鼠給藥劑量為0.54 g/kg。各給藥組予相應(yīng)藥物灌胃，空白組灌胃生理鹽水，體積均為1 mL/100 g，每日1次。4周后取材并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.4 血脂、血糖、肝功能指標(biāo)檢測(cè)

用10%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，從腹正中線皮膚切開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血4 mL，4 ℃、3 500 r/ min離心15 min，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用全自動(dòng)生化分析儀分別測(cè)定血脂[總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）]、血糖[血糖（GLU）、糖化血清蛋白（GSP）]及肝功能指標(biāo)[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）]。

1.2.5 HE染色

腹主動(dòng)脈取血后，用眼科剪沿大鼠肝臟外緣取下完整肝臟，置于4 ℃生理鹽水中浸洗，在冷凍臺(tái)上用刀片切取右葉肝組織并固定于4%多聚甲醛中，24 h后將肝組織依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、染色及封片，鏡下觀察并采集圖像進(jìn)行分析。

1.2.6 透射電鏡觀察自噬體

將大鼠肝組織置于預(yù)冷好的冷凍機(jī)上，生理鹽水沖洗后分離右葉組織，切取1 mm×1 mm×1 mm 組織塊，固定于2.5%戊二醛溶液中，經(jīng)鋨酸固定、梯度脫水、浸透、包埋、切片、修切、染色后，在透射電鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)及自噬體。

1.2.7 Western blot檢測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白表達(dá)

取大鼠肝組織，迅速放入-80 ℃冰箱中凍存，實(shí)驗(yàn)前取出解凍，取黃豆大小，放入1.5 mL EP管中，加入蛋白裂解液提取總蛋白，利用蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白含量。以40 μg 蛋白/泳道上樣，經(jīng)SDS-PAGE 后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，加PI3K 一抗（1∶1 000）、Akt1 一抗（1∶5 000）、mTOR 一抗（1∶5 000）、p-PI3K 一抗（1∶2 000）、p-Akt1 一抗（1∶5 000）、p-mTOR一抗（1∶5 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），置于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min，加HRP標(biāo)記二抗孵育。按1∶1比例配制化學(xué)發(fā)光液，將膜放在曝光板上，膜上滴適量發(fā)光液，將曝光后的底片用Quantity One專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布以±s表示，組間比較采用方差分析；不滿足正態(tài)分布用M（QR）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 青錢柳活性成分及有效靶點(diǎn)

通過(guò)查閱文獻(xiàn)共獲得青錢柳化學(xué)成分124個(gè)，運(yùn)用SwissADME平臺(tái)篩選后保留活性成分46個(gè)，并對(duì)其進(jìn)行重新編號(hào)，見(jiàn)表1。使用SwissTargetPrediction 及Super-PRED 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取活性成分靶點(diǎn)，經(jīng)篩選、匯總、去重后，共獲得599個(gè)靶點(diǎn)。

表1 青錢柳活性化合物

2.1.2 青錢柳活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將青錢柳活性成分和有效靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，獲得的藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共包含646個(gè)節(jié)點(diǎn)、2 169條邊?；诖司W(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，degree 值前6 位活性成分為pterolactone、5S-5-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥苯基)-3-庚酮、六氫姜黃素、槲皮素、山柰酚、3,6,3＇,5＇-四甲氧基-5,7,4＇-三羥基黃酮醇，degree值分別為108、107、104、104、104、104，推測(cè)上述成分可能是青錢柳的重要活性成分。

2.1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)

通過(guò)TTD、DrugBank 及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)得到2 型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)2 382個(gè)，去重后為2 195個(gè)；非酒精性脂肪肝相關(guān)靶點(diǎn)829個(gè)，去重后為816個(gè)。將疾病相關(guān)靶點(diǎn)與599個(gè)青錢柳靶點(diǎn)取交集，得到共同靶點(diǎn)101個(gè)。

2.1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將101 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 平臺(tái)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析。該網(wǎng)絡(luò)共101個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 053條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為20.851，聚類系數(shù)為0.598，見(jiàn)圖1。靶蛋白節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深其degree值越高，表明該靶點(diǎn)越重要。計(jì)算靶點(diǎn)degree值及中介中心度（BC）、接近中心度（CC），以三者均不低于其相應(yīng)中位數(shù)（degree≥15、BC≥0.001 8、CC≥0.607 1）為條件進(jìn)行篩選，得到青錢柳治療糖尿病性脂肪肝的關(guān)鍵靶點(diǎn)15 個(gè)，分別為PPARG、MTOR、

圖1 青錢柳治療糖尿病性脂肪肝核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

PPARA、AKT1、STAT3、EGFR、TLR4、VEGFA、HIF1A、 MMP9、 IL6、 TNF、 CASP3、 PTGS2、ESR1。其中degree值最高的是AKT1，能與70個(gè)蛋白發(fā)生相互作用，可能發(fā)揮重要作用。將上述關(guān)鍵靶點(diǎn)名稱輸入DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)的拓?fù)湫再|(zhì)信息，見(jiàn)表2。

表2 青錢柳治療糖尿病性脂肪肝關(guān)鍵靶點(diǎn)及其拓?fù)湫再|(zhì)

2.1.5 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果

對(duì)15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，得到270個(gè)條目，以P＜0.05、FDR＜5%為條件，共篩選出81個(gè)條目，包括66個(gè)生物過(guò)程（Biological process）、2個(gè)細(xì)胞 組 分（Cellular component）、 13 個(gè) 分 子 功 能（Molecular function）。主要生物過(guò)程包括蛋白結(jié)合（protein binding）、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路（cytokine-mediated signaling pathway）、基因表達(dá)的正調(diào)控（positive regulation of gene expression）、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控及DNA模板化（positive regulation of transcription，DNA-templated）、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控（positive regulation of smooth muscle cell proliferation）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、肽基-絲氨酸磷酸化的正調(diào)節(jié)（positive regulation of peptidyl-serine phosphorylation）、對(duì)缺氧的反應(yīng)（cellular response to hypoxia）、基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控（negative regulation of gene expression）、凋亡過(guò)程的正調(diào)控（positive regulation of apoptotic process）、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控（negative regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱpromoter）等；主要細(xì)胞組分包括大分子復(fù)合體（macromolecular complex）與細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）；主要分子功能包括相同的蛋白質(zhì)結(jié)合（identical protein binding）、酶的結(jié)合（enzyme binding）、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性及配體激活的序列特異性DNA結(jié)合（RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity， ligandactivated sequence-specific DNA binding）、NO合成酶調(diào)節(jié)活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（protein kinase binding）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、RNA聚合酶Ⅱ抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合（RNA polymerase Ⅱ repressing transcription factor binding）、轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合（transcription coactivator binding）、轉(zhuǎn)錄因子活性及序列特 異 性DNA 結(jié) 合（transcription factor activity，sequence-specific DNA binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、轉(zhuǎn)錄激活活性（transcriptional activator activity）、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域序列特異性結(jié)合（RNA polymerase Ⅱ transcription regulatory region sequence-specific binding）。見(jiàn)圖2。

圖2 青錢柳治療糖尿病性脂肪肝關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析

對(duì)15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P＜0.05為條件，共篩選出89個(gè)信號(hào)通路，前21條通路見(jiàn)圖3。靶點(diǎn)數(shù)靠前的信號(hào)通路為糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications Insulin resistance）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、丙型肝炎（Hepatitis C）、胰島素抵抗（Insulin resistance）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease）、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路（Adipocytokine signaling pathway）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、癌癥的途徑（Pathways in cancer）等?？梢?jiàn)，青錢柳治療糖尿病性脂肪肝是多靶點(diǎn)、多通路相互影響的結(jié)果。

圖3 青錢柳治療糖尿病性脂肪肝關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.1.6 活性成分-共同靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape3.9軟件構(gòu)建青錢柳治療糖尿病性脂肪肝活性成分-共同靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)。其中degree值較大的成分是5S-5-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥苯基)-3-庚酮、2α-羥基烏蘇酸、六氫姜黃素、2α, 3α, 20β, 23-tetrahydroxyurs-12-en-28-ursolic acid、2a-羥基熊果酸，degree值較大的靶點(diǎn)有STAT3、AKT1、MTOR、TLR4、PIK3CA、EGFR等，見(jiàn)表3。

表3 青錢柳治療糖尿病性脂肪肝核心活性成分及靶點(diǎn)

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 青錢柳對(duì)模型大鼠一般情況的影響

空白組大鼠反應(yīng)靈活，毛發(fā)光澤，糞便、尿液正常；模型大鼠反應(yīng)欠靈敏、皮毛晦黯無(wú)光澤，尿量明顯增多并有爛蘋果味，部分出現(xiàn)顯著的“三多一少”表現(xiàn)；與模型組比較，青錢柳組大鼠一般情況明顯改善。與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、肝濕重明顯升高；與模型組比較，青錢柳組大鼠體質(zhì)量、肝濕重明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕重比較（±s，g，每組6只）

表4 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕重比較（±s，g，每組6只）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

肝濕重17.50±1.04 28.00±2.67*19.60±0.87#20.39±1.80組別空白組模型組青錢柳組吡格列酮組體質(zhì)量461.50± 9.98 582.00±13.42*463.00±40.34#480.75±38.40

2.2.2 青錢柳對(duì)模型大鼠血脂、血糖、肝功能指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組大鼠TC、LDL、GLU、GSP、ALT、AST含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，吡格列酮組大鼠LDL、GLU、GSP、ALT、AST含量下降，青錢柳組大鼠TC、GLU、GSP、ALT、AST含量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠血脂、血糖、肝功能指標(biāo)比較

2.2.3 青錢柳對(duì)模型大鼠肝組織形態(tài)的影響

正常組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無(wú)脂肪變，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞內(nèi)有大小不一的脂滴空泡，細(xì)胞核邊緣化，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；青錢柳組和吡格列酮組大鼠肝細(xì)胞脂肪變顯著減輕，炎癥細(xì)胞顯著減少。見(jiàn)圖4。

2.2.4 青錢柳對(duì)模型大鼠肝臟自噬體的影響

透射電鏡觀察顯示，自噬體是由單層膜或典型雙層膜將一小部分細(xì)胞質(zhì)包圍而成的結(jié)構(gòu)。與空白組比較，模型組大鼠肝細(xì)胞自噬體數(shù)量有減少趨勢(shì)；與模型組比較，青錢柳組大鼠肝細(xì)胞自噬體數(shù)量明顯增多，見(jiàn)圖5。

2.2.5 青錢柳對(duì)模型大鼠關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt1、p-mTOR蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，青錢柳組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt1、p-mTOR蛋白表達(dá)下降，吡格列酮組大鼠肝組織p-Akt1、p-mTOR蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖6、表6。

表6 大鼠肝組織PI3K、Akt1、mTOR、p-PI3K、p-Akt1、p-mTOR蛋白表達(dá)各組比較（±s，每組3只）

表6 大鼠肝組織PI3K、Akt1、mTOR、p-PI3K、p-Akt1、p-mTOR蛋白表達(dá)各組比較（±s，每組3只）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

蛋白PI3K p-PI3K Akt1 p-Akt1 mTOR p-mTOR吡格列酮組0.48±0.03 0.16±0.02 0.49±0.02 0.14±0.02#0.42±0.01 0.11±0.02#空白組0.48±0.04 0.04±0.01 0.47±0.03 0.03±0.00 0.45±0.00 0.05±0.01模型組0.45±0.03 0.22±0.03**0.45±0.03 0.22±0.02**0.40±0.02 0.24±0.05*青錢柳組0.45±0.04 0.09±0.02#0.46±0.04 0.07±0.01#0.41±0.01 0.08±0.00#

3 討論

目前，青錢柳的相關(guān)研究多集中于化學(xué)成分、藥理作用及有效部位提取工藝，尚未對(duì)其作用機(jī)制開(kāi)展深入研究。因此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討青錢柳發(fā)揮治療作用的途徑，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，青錢柳可以通過(guò)多個(gè)生物學(xué)過(guò)程對(duì)糖尿病性脂肪肝發(fā)揮治療作用，其核心作用靶點(diǎn)可能是AKT1，并且涉及PI3K/Akt1/mTOR信號(hào)通路。研究表明，該通路參與自噬分子機(jī)制、信號(hào)調(diào)控，以及細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等過(guò)程，其中PI3K屬于脂質(zhì)激酶，是細(xì)胞膜的關(guān)鍵組成部分，分為3種亞型[12]，主要是Ⅰ型PI3K參與該通路信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)作用于下游Akt，使磷酸化的Akt激活下游mTOR，從而負(fù)性調(diào)節(jié)自噬。mTOR 由2 種不同蛋白mTORC1和mTORC2組成，前者與自噬密切相關(guān)，對(duì)經(jīng)典的抑制劑雷帕霉素敏感[13]，后者與自噬的關(guān)系尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟自噬在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，自噬失調(diào)會(huì)導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)淤積增加，且肝內(nèi)脂質(zhì)淤積可進(jìn)一步加重代謝功能障礙，從而形成惡性循環(huán)，促使疾病發(fā)生和進(jìn)展[14]。通過(guò)調(diào)控自噬靶向改善非酒精性脂肪肝肝臟脂質(zhì)積累的策略可能是防治糖尿病性脂肪肝新的干預(yù)手段。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以高糖高脂飼料喂養(yǎng)+鏈脲佐菌素腹腔注射方法構(gòu)建糖尿病性脂肪肝大鼠模型，通過(guò)青錢柳水提物連續(xù)灌胃4周后取材，對(duì)PI3K/Akt1/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，青錢柳能夠降低模型大鼠GLU、GSP、TC水平，減輕肝功能損傷，與以往研究結(jié)果[15-16]一致；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，青錢柳可下調(diào)模型大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt1、p-mTOR蛋白表達(dá)，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)肝臟自噬體增多。

綜上所述，青錢柳可有效降低糖尿病性脂肪肝大鼠血脂、血糖水平，減輕肝功能損傷，對(duì)肝臟有一定保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制PI3K/Akt1/mTOR信號(hào)通路以增強(qiáng)自噬有關(guān)。