徐杰 溫云英 莫惠捷 康貽豪 陳廷速 張金蓮 姜明國(guó)

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.021

摘要：【目的】探究清耕和生草措施對(duì)沃柑根系內(nèi)生真菌多樣性的影響，為篩選和開(kāi)發(fā)促生、防病和抗逆等功能的有益內(nèi)生真菌資源提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā窟x取廣西南寧市武鳴區(qū)6個(gè)代表性沃柑果園（生草模式和清耕模式各3個(gè)），調(diào)查其土壤養(yǎng)分水平，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)沃柑根系內(nèi)生真菌ITS區(qū)進(jìn)行測(cè)定，分析沃柑根系樣品中真菌群落的多樣性及其分布規(guī)律?！窘Y(jié)果】廣西南寧市武鳴區(qū)沃柑果園的土壤為酸性，速效鉀、有機(jī)質(zhì)含量豐富。從沃柑果樹(shù)根系樣品中共檢測(cè)出內(nèi)生真菌12門42綱102目224科416屬，其中真菌在門分類水平上的主要優(yōu)勢(shì)類群是子囊菌門（Ascomycota），在屬分類水平上的主要優(yōu)勢(shì)類群為新赤殼屬（Neocosmospora）和青霉屬（Penicillium），自然生草及清耕模式下的沃柑根系內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異。典型相關(guān)分析（CCA）結(jié)果表明，沃柑果園根系真菌群落與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、土壤有機(jī)質(zhì)呈極顯著相關(guān)（P<0.01），與pH呈顯著相關(guān)（P<0.05），與速效磷、速效鉀無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）。所有試驗(yàn)果園根系中的營(yíng)養(yǎng)功能類群結(jié)構(gòu)均相似，以腐生—營(yíng)養(yǎng)型內(nèi)生真菌菌群的相對(duì)豐度最高，其次為未鑒定的功能群、病理—腐生—共生營(yíng)養(yǎng)型，其他營(yíng)養(yǎng)功能類群在不同果園中占比均較低。【結(jié)論】廣西沃柑根系內(nèi)生真菌以新赤殼屬和青霉屬為優(yōu)勢(shì)屬，該區(qū)域尺度下的沃柑根系內(nèi)生真菌群落組成與生草管理無(wú)顯著相關(guān)，但受部分土壤環(huán)境因子調(diào)控。

關(guān)鍵詞：沃柑；植物內(nèi)生真菌；群落多樣性；FUNGuild；廣西

中圖分類號(hào)：S666.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）06-1800-10

Diversity of endophytic fungi in Orah mandarin

roots in Guangxi

XU Jie1，2， WEN Yun-ying2， MO Hui-jie2， KANG Yi-hao2， CHEN Ting-su2，

ZHANG Jin-lian2*， JIANG Ming-guo1*

（1School of Marine Sciences and Biotechnology， Guangxi University for Nationalities， Nanning，Guangxi? 530008， China；

2Institute of Microbiology， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning，Guangxi? 530007， China）

Abstract：【Objective】This paper investigated the effects of clean tillage and grassing measures on the diversity of endophytic fungi in Orah mandarin roots， to provide a scientific basis for screening and developing beneficial endophytic fungal resources with functions such as growth promotion， disease prevention and stress resistance. 【Method】Six representative Orah mandarin orchards in Wuming District， Nanning City，Guangxi （three grassing mode and three clean tilla-ge mode） were selected to investigate their soil nutrient levels. And the ITS zones of endophytic fungi in Orah mandarin roots were determined using high-throughput sequencing technology to analyze the diversity of fungal communities in Orah mandarin root samples and their distribution patterns. 【Result】The soil of Orah mandarin orchards in Wuming District， Nanning， Guangxi was mainly acidic， being rich in available potassium and organic matter. Endophytic fungi were detected in endophytic fungi in Orah mandarin root samples， including 12 phylums， 42 classes， 102 orders， 224 families and 416 genera of endophytic fungi， of which the main dominant taxa at the phylum level was Ascomycota， and at the genus level were Neocosmospora， Penicillium. There was no great difference in the community structure of endophytic fungi in Orah mandarin roots under natural grassing and clean tillage modes. The results of canonical correlation analysis （CCA） showed that the? fungal communities in Orah mandarin root were highly significantly correlated with nitrate nitrogen， ammonium nitrogen and soil organic matter （P<0.01）， significantly correlated with pH （P<0.05）， and not significantly correlated with available phosphorus and available potassium （P>0.05）. The structures of nutrient functional groups in the root system were similar in all the experimental orchards， with the highest relative abundance of saprophytic-nutrient endophytic fungal communities， followed by unidentified functional groups， pathological-saprophytic-symbiotic nutrient fungal communities. And the other nutrient functional groups occupied lower proportions in different orchards. 【Conclusion】The dominant genera of fungi in Orah mandarin roots in Guangxi are dominated by the genera Neocosmospora， Penicillium. The endophytic fungal community composition in the roots of Orah mandarin at this regional scale is not significantly related to grassing management， but is regulated by some soil environmental factors.

Key words： Orah mandarin； plant endophytic fungi； community diversity； FUNGuild； Guangxi

Foundation items： Guangxi Science and Technology Major Special Project （Guike AA18242026）； Special Project of Guangxi Science and Technology Bases and Talents （Guike AD20159001）； Joint Project of Xiamen University （KJ2023480B）； Basic Scientific Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences? （2023YM96）

0 引言

【研究意義】沃柑（Orah mandarin）由坦普爾桔橙和丹西紅桔雜交得到。廣西南寧市武鳴區(qū)自2012年引入沃柑進(jìn)行試種，表現(xiàn)出高糖低酸、晚熟和豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等特點(diǎn)，武鳴也發(fā)展成為全國(guó)沃柑種植面積最大的縣（區(qū)），沃柑種植面積約61333 ha，占全國(guó)沃柑種植總面積的1/3，產(chǎn)值近百億元。截至2021年，以沃柑為主的千畝以上種植企業(yè)，南寧有近30家，百畝以上的種植企業(yè)、大戶近300家（馮梓劍，2023），小面積分散種植的柑橘戶約16000戶。武鳴沃柑于2019年獲準(zhǔn)注冊(cè)為地理標(biāo)志證明商標(biāo)。沃柑生產(chǎn)中由于根毛稀少，根系分布淺，對(duì)土壤養(yǎng)分利用有效性低、較敏感，自然條件下通常與叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）真菌建立共生關(guān)系，可增加根系對(duì)磷等養(yǎng)分的吸收和植株的生長(zhǎng)（劉潔雯等，2020）。與AM真菌相比，對(duì)柑橘園根系中內(nèi)生真菌資源的研究相對(duì)較少。植物與根系內(nèi)生真菌的共生能促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)，增強(qiáng)宿主的脅迫抗性（Ren et al.，2019；Ujvári et al.，2021）。內(nèi)生真菌的群落組成及功能特性對(duì)宿主植物微環(huán)境產(chǎn)生極大影響，而區(qū)域和植被等因素也可影響內(nèi)生真菌群落多樣性（顧美英等，2022）。目前，沃柑根系內(nèi)生真菌的共生關(guān)系研究相對(duì)較少，發(fā)掘利用沃柑根系內(nèi)生真菌資源，對(duì)促進(jìn)沃柑生長(zhǎng)、抗病蟲(chóng)害及提高沃柑品質(zhì)等具有積極作用（周家喜等，2019）?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，柑橘根系共生真菌研究方面已取得了一定進(jìn)展。宋放（2018）以來(lái)自8個(gè)柑橘產(chǎn)區(qū)的柑橘實(shí)生苗為材料，鑒定了柑橘AM真菌的群落多樣性，發(fā)現(xiàn)柑橘AM真菌群落結(jié)構(gòu)受到生境和寄主基因型的顯著影響，其中生境是最主要的影響因素。Xu等（2018）對(duì)來(lái)自六大洲、不同柑橘品種的土壤和根際樣品進(jìn)行擴(kuò)增子和深鳥(niǎo)槍宏基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)7個(gè)核心根際真菌屬為核心菌群，隸屬于子囊菌屬（Ascomycetes）。Sadeghi等（2019）從健康柑橘葉、莖、干、根中分離真菌，發(fā)現(xiàn)黑酵母菌（Aureobasidium pullulans），桔青霉（Penicillium citrinum）和座囊菌屬（Dothideomycetes sp.）是最常見(jiàn)的分離株。陸鑫君（2021）比較不同地面覆蓋處理對(duì)衢州椪柑根際微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)生草處理同時(shí)增大了根際土壤細(xì)菌和真菌的豐富度與多樣性。肖力婷等（2022）以南豐蜜橘為研究對(duì)象，探究橘園不同生草條件對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能特征的影響，發(fā)現(xiàn)黑麥草處理能顯著提高真菌群落Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)，在橘園土壤中，子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）為優(yōu)勢(shì)菌門。朱文倩（2022）對(duì)果園沃柑根系健康根進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高通量測(cè)序中根系內(nèi)生真菌以子囊菌門和擔(dān)子菌門為主，健康植株白根上相對(duì)豐度最高是擔(dān)子菌門（Herpotrichiellaceae）科枝孢瓶霉屬（Cladophialophora），可培養(yǎng)分離得到的根系內(nèi)生真菌有鐮孢菌屬（Fusarium）、毛殼菌屬（Chaetomium）、二分枝毛殼屬（Dichotomopilus）、殼球孢菌屬（Macrophomina）及青霉屬（Penicillium）等。顏楨靈等（2021）從柑橘枝條和葉片中分離得到72株內(nèi)生真菌，其中優(yōu)勢(shì)屬為刺盤孢屬（Colletotrichum）、球座菌屬（Guignardia）、鏈格孢屬（Alternaria）和鐮孢菌屬?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，有關(guān)南寧武鳴沃柑根系內(nèi)生真菌多樣性及群落組成的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以廣西南寧武鳴沃柑為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)沃柑根系內(nèi)生真菌群落特征進(jìn)行分析，探究管理模式、土壤理化性質(zhì)對(duì)沃柑根系內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，為廣西沃柑根系內(nèi)生真菌多樣性的影響機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 調(diào)查地及采樣果園情況

調(diào)查地位于廣西南寧沃柑主產(chǎn)區(qū)武鳴區(qū)（東經(jīng)107°49′26″～108°37′22″、北緯22°59′58″～23°33′16″，平均海拔100～150 m），地處亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，光熱充足，雨量充沛，夏季炎熱多雨，春秋季易干旱，冬季溫暖少雨，偶有霜雪，年平均氣溫21.7 ℃。武鳴沃柑果園在實(shí)際種植中主要存在生草（SC）和清耕（QG）種植模式，為保證所選果園的真實(shí)與充分性，從現(xiàn)有果園中隨機(jī)選取2種種植模式各3個(gè)果園為調(diào)查樣地，樣地詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1. 2 果園土壤性質(zhì)測(cè)定

使用1 mol/L KCl溶液浸提后以電位法測(cè)定土壤pH（水土比為2.5∶1）；土壤硝態(tài)氮用雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定；土壤銨態(tài)氮使用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定；土壤速效磷（Avilable phosphorus，AP）用鹽酸—氟化銨浸提劑浸提后，以鉬銻抗比色法測(cè)定；土壤速效鉀（Avilable potassium，AK）用1 mol/L乙酸銨溶液浸提后，以原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定；土壤有機(jī)質(zhì)（Organic matter，OM）測(cè)定采用外加熱重鉻酸鉀氧化—容量法（鮑士旦，2000）。

1. 3 沃柑根系樣品的高通量測(cè)序

于2021年12月在每個(gè)果園內(nèi)采集5份根系樣本（選取15個(gè)采樣點(diǎn)，并將每3個(gè)點(diǎn)采集的根樣混合）。采集0～20 cm健康的沃柑白色根系，根系表面土壤一同收集，用于土壤理化性質(zhì)分析。首先以自來(lái)水清洗沃柑根段表面，然后在超凈臺(tái)上進(jìn)行消毒：75%酒精浸泡30 s，2%次氯酸鈉浸泡2 min，無(wú)菌水沖洗。取少量末次沖洗液涂布于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)4～5 d后，若基質(zhì)表面未觀察到菌落，表明表面消毒已徹底。

采用改良的CTAB方法提取沃柑總DNA（Doyle，1991）。引物ITS1F（5'-CTTGSCCATTTAGAGGAAS CAA-3'）/ITS2R（5'-GCTGCSCTCTTCATCGATGC-3'）擴(kuò)增真菌的ITS區(qū)，采用Illumina MiSeqPE300平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序（委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成）。

1. 4 高通量測(cè)序信息處理

將高通量測(cè)序的原始數(shù)據(jù)提交到NMDC數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//nmdc.cn），接受號(hào)為PRJNA914072。原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控和拼接后，使用UPARSE（v7.1），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTUs聚類，利用RDP Classifier（v2.11）比對(duì)Unite基因數(shù)據(jù)庫(kù)（release 8.0）進(jìn)行OTUs物種分類學(xué)注釋，置信度閾值為70%，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成。

對(duì)初始OTUs進(jìn)行比對(duì)到葉綠體和線粒體序列的去除，按照最小樣本序列數(shù)進(jìn)行樣本序列抽平。采用Mothur計(jì)算α多樣性指數(shù)，并采用Wilxocon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行α多樣性的組間差異分析；使用基于Bray-Curtis距離算法的主成分分析（PCoA）檢驗(yàn)樣本間真菌群落結(jié)構(gòu)的相似性，并結(jié)合PERMANOVA非參數(shù)檢驗(yàn)分析樣本組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異是否顯著；用線性判別分析（LEfSe）（LDA>2，P<0.05）確定不同組間從門到屬分類水平相對(duì)豐度的顯著性。

基于距離的冗余分析（db-RDA）及使用abund_ jaccard距離算法，研究土壤理化指標(biāo)對(duì)根系內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。用線性回歸分析評(píng)估db-RDA中確定的主要土壤理化指標(biāo)對(duì)微生物α多樣性指數(shù)的影響，采用FUNGuild對(duì)根系內(nèi)生真菌群落功能信息從生態(tài)營(yíng)養(yǎng)型上進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2020和SPSS 27.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，分別進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比較；用Pearson法和典型相關(guān)分析（CCA）對(duì)土壤理化性質(zhì)和微生物多樣性進(jìn)行相關(guān)分析，并以Excel 2020作圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 廣西沃柑果園的土壤理化性質(zhì)

由表2可看出，廣西南寧市武鳴區(qū)沃柑果園為酸性土壤。其中生草果園SC2的土壤pH最大，為5.90，清耕果園QG2的pH最小，為4.10。生草處理果園SC2和SC3的土壤pH和有機(jī)質(zhì)含量均顯著高于清耕處理果園（P<0.05，下同）。生草與清耕處理果園間的硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、速效磷和速效鉀含量無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）。因此，生草果園SC2和SC3的土壤養(yǎng)分優(yōu)于清耕果園，果園SC1土壤養(yǎng)分綜合較差，可能與其土壤含有大量沙石有關(guān)。

2. 2 廣西沃柑根系內(nèi)生真菌的測(cè)序深度及OTU分析

稀釋曲線可用來(lái)檢測(cè)測(cè)序數(shù)據(jù)量能否反映樣品的物種多樣性及豐富程度，由圖1可看出，各處理的稀釋曲線末端基本趨于平緩，說(shuō)明取樣合理，能真實(shí)地體現(xiàn)沃柑根系內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)。

2. 3 廣西沃柑根系內(nèi)生真菌群落組成分析

在門分類水平，沃柑根系內(nèi)生真菌群落共注釋得到12個(gè)門（圖2-A）。在廣西沃柑根系內(nèi)生真菌群落中，門分類水平上占主導(dǎo)地位的真菌分別是子囊菌門（83.64%）、擔(dān)子菌門（10.18%）和羅茲菌門（Rozellomycota，1.15%），三者之和占總OTUs的94.97%。其中，子囊菌門在果園SC2和QG3中相對(duì)豐度較高，分別在其果園占比94.87%和91.27%，擔(dān)子菌門在果園SC1相對(duì)豐度最高（23.53%），羅茲菌門在果園SC3中相對(duì)豐度最高（2.35%）。相對(duì)于其他果園，果園SC3中含有被孢霉門（1.22%），果園QG1中含有較豐富的球囊菌門（Glomeromycota，1.79%），其他門類在真菌群落組成中占比很?。ㄒ讶コ醋R(shí)別門類）。

在科分類水平，沃柑根系內(nèi)生真菌群落共注釋到224個(gè)科（圖2-B）。其中叢赤殼科（Nectriaceae，45.69%）、曲霉科（Aspergillaceae，11.11%）和小皮傘科（Marasmiaceae，5.42%）是優(yōu)勢(shì)科，三者之和占總OTUs的62.22%。此外，果園SC2含有亞隔孢殼科（Didymellaceae，12.06%），果園QG1含有黑盤孢科（Melanconidaceae，12.88%）（已去除未識(shí)別科類）。

在屬分類水平，6個(gè)果園根系內(nèi)生真菌相對(duì)豐度前7位分別是新赤殼屬（Neocosmospora，37.25%）、青霉屬（14.10%）、鐮孢菌屬（9.93%）、Poaceascoma（3.72%）、黑盤孢屬（Melanconiella，3.58%）、Roussoella（2.18%）和枝孢屬（Cladosporium，1.77%）（圖2-C）。其中，新赤殼屬和青霉屬在6個(gè)果園沃柑根系內(nèi)生真菌占比均位于前列，因此認(rèn)為上述2種真菌屬是沃柑根系內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬。青霉屬在果園SC3的相對(duì)豐度（24.72%）較果園SC2（6.07%）高307.25%，新赤殼屬在果園QG3的相對(duì)豐度（55.51%）較果園QG1（19.27%）高188.06%，說(shuō)明真菌種屬在不同果園的豐度有明顯差異（已去除未識(shí)別屬類）。

由圖3可知，較清耕果園，根系內(nèi)生真菌規(guī)整霉屬（Codinaea）和瓶霉屬（Phialophora）在生草果園中的相對(duì)豐度更高；較生草果園，黑盤孢屬和枝孢屬在清耕果園中的相對(duì)豐度更高；其他屬在2種模式果園中豐度差距較小。

2. 4 廣西沃柑根系內(nèi)生真菌群落多樣性分析

2. 4. 1 α多樣性 Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映群落豐富度，均為正相關(guān)；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映群落多樣性，其中Shannon指數(shù)與群落多樣性為正相關(guān)，Simpson指數(shù)與群落多樣性為負(fù)相關(guān)。6個(gè)果園根系內(nèi)生真菌的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)無(wú)顯著差異，即沃柑果園生草及清耕管理模式下，根系內(nèi)生真菌的群落豐富度均無(wú)顯著差異（表3）。果園SC1根系內(nèi)生真菌的Shannon指數(shù)顯著低于果園QG1，反映果園SC1根系內(nèi)生真菌的多樣性低于果園QG1，其他果園間多樣性無(wú)顯著差異。綜合來(lái)看，果園SC1的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最高，而Shannon指數(shù)最低，Simpson指數(shù)最高，因此果園SC1沃柑根系內(nèi)生真菌的豐富最高，多樣性最低。

2. 4. 2 β多樣性 在屬分類水平上對(duì)不同沃柑果園根系內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行PCoA分析，前2個(gè)主成分PC1和PC2的主成分解釋度分別為17.88%和14.12%（圖4）。6個(gè)果園間的群落組成呈分散狀，同一果園的各樣本也較分散，表明不同果園間及同一果園內(nèi)各樣本的群落組成存在差異。使用abund_jaccard距離算法，結(jié)果表明各果園群落在屬水平上組成差異極顯著（P=0.001，R2=0.2053）。

2. 5 廣西沃柑根系內(nèi)生真菌群落組成差異分析

6個(gè)果園沃柑根系內(nèi)生真菌的OTUs總數(shù)為1983個(gè)，生草組特有665個(gè)OTUs，清耕組特有726個(gè)OTUs（圖5-A），其中共有的OTUs占生草組和清耕組的比率分別為47.10%和44.92%，生草和清耕組的OTUs重疊較多，說(shuō)明2種管理模式的根系內(nèi)生真菌種類具有較高的相似性。

6個(gè)果園根系內(nèi)生真菌共有屬56個(gè)，果園SC1、SC2、SC3、QG1、QG2和QG3特有屬分別為23、32、21、32、43和18個(gè)（圖5-B），果園QG2的特有屬較果園QG3多138.89%。不同果園特有屬的相對(duì)豐度也有所差別，果園QG3特有的根系內(nèi)生真菌相對(duì)豐度最低（8.00%），果園QG2特有的根系內(nèi)生真菌相對(duì)豐度最高（19.11%）。

6個(gè)果園共有屬中優(yōu)勢(shì)屬為新赤殼屬（24.35%）、青霉屬（8.22%）和鐮孢菌屬（5.21%）。果園SC1、SC2、SC3、QG1、QG2和QG3中，相對(duì)豐度≥5%的真菌屬分別有2、5、6、4、4和6個(gè)，其中，馬利亞霉屬（Mariannaea）、枝氯霉屬（Ramichloridium）、無(wú)莖真菌屬（Acaulium）、亞隔孢殼屬（Didymella）、Hawksworthiomyces和嗜熱鏈球菌屬（Mycothermus）分別是上述果園特有優(yōu)勢(shì)屬。可見(jiàn)，6個(gè)沃柑果園根系內(nèi)生真菌群落的組成和相對(duì)豐度不同，果園SC3和QG3的根系內(nèi)生真菌菌群相對(duì)豐度≥5%的真菌屬最多，具有更高的偏好性。

2. 6 廣西沃柑根系內(nèi)生真菌群落組成和土壤因子的相關(guān)分析

從CCA分析結(jié)果（圖6）可看出，大多數(shù)果園內(nèi)生真菌聚集在靠近坐標(biāo)原點(diǎn)的位置，果園SC1和QG1的真菌群落與土壤有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)；果園SC2的真菌菌落與硝態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)；果園SC1的真菌菌落與銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)。廣西沃柑果園根系真菌群落與土壤pH存在顯著相關(guān)，與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)存在極顯著相關(guān)（P<0.01），與速效磷、速效鉀無(wú)顯著相關(guān)（表4）。

2. 7 廣西沃柑根系內(nèi)生真菌群落的FUNGuild功能類群預(yù)測(cè)

基于FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)解析廣西沃柑根系內(nèi)生真菌的生態(tài)功能類別，僅選擇可信等級(jí)為極可能（Highly probable）的OTU和分類單元進(jìn)行分析。生態(tài)營(yíng)養(yǎng)型及各營(yíng)養(yǎng)型在不同沃柑果園根系內(nèi)生真菌中的豐度信息（圖7）顯示，以腐生營(yíng)養(yǎng)型（Saprotroph）內(nèi)生真菌菌群的相對(duì)豐度最高，為各樣品的優(yōu)勢(shì)類群，在果園SC1、SC2、SC3、QG1、QG2和QG3中的相對(duì)豐度分別為40.01%、33.39%、42.59%、48.34%、36.58%和59.41%；其次為未鑒定（Unassigned）的功能群，分別為45.67%、39.58%、43.89%、41.06%、49.40%和37.69%；病原菌—腐生—共生營(yíng)養(yǎng)型（Pathogen-saprotroph-symbiotroph）功能菌群在果園SC1、SC2和QG2中較為豐富，相對(duì)豐度分別為11.20%、10.59%和10.92%；果園SC2沃柑根系含有12.97%的病理—腐生營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph-saprotroph）功能群，其他營(yíng)養(yǎng)功能類群在不同果園中占比較低（相對(duì)豐度≤6%）。

3 討論

3. 1 廣西沃柑果園的土壤理化性質(zhì)及對(duì)根系內(nèi)生真菌群落的影響

根系是植物與微生物相互作用的重要場(chǎng)所，蘊(yùn)含大量的內(nèi)生真菌（江尚燾等，2023）。根據(jù)全國(guó)第二次土壤普查養(yǎng)分分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，本研究中廣西沃柑果園（SC1、SC2、SC2、QG1和QG3）土壤中速效鉀處于一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（>200 mg/kg，極高），果園QG2土壤處于二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（150～200 mg/kg，較高），速效鉀含量的豐富，可能與鉀肥可提高柑橘的單果重和產(chǎn)量有關(guān)（張績(jī)，2020）。土壤有機(jī)質(zhì)累積程度是土壤肥力的重要特征，3個(gè)清耕處理果園土壤中的有機(jī)質(zhì)含量處于三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（20～30 g/kg，中等），生草處理果園SC2和SC3土壤有機(jī)質(zhì)含量處于一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（>40 g/kg，豐富），除果園SC1外，生草處理果園土壤的有機(jī)質(zhì)含量高于清耕處理果園。在果園行間種植鼠茅草、百喜草（蒙正兵等，2016）、長(zhǎng)柔毛野豌豆（姜莉莉等，2019）也可明顯改善果園土壤有機(jī)質(zhì)的含量。本研究中果園特有真菌的存在受地理因素影響，沃柑果園根系真菌群落與土壤pH存在顯著相關(guān)，與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有機(jī)質(zhì)存在極顯著相關(guān)，與速效磷、速效鉀無(wú)顯著相關(guān)。

3. 2 廣西沃柑果園根系內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬

對(duì)廣西武鳴沃柑果園根系內(nèi)生真菌群落組成和優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行分析，結(jié)果表明武鳴沃柑果園中蘊(yùn)含著豐富的內(nèi)生真菌群，各果園的OTUs數(shù)量在192～311個(gè)。門分類水平上，子囊菌門和擔(dān)子菌門屬于優(yōu)勢(shì)真菌門?？品诸愃?，叢赤殼科、曲霉科和小皮傘科是優(yōu)勢(shì)科。屬分類水平上，除優(yōu)勢(shì)屬新赤殼屬和青霉屬外，還包括鐮孢菌屬、Poaceascoma、黑盤孢屬、Poussoella、枝孢屬等。朱文倩（2022）對(duì)健康沃柑根系樣本的真菌種類多樣性進(jìn)行調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)該樣地果園內(nèi)沃柑根系內(nèi)生真菌相對(duì)豐度最高的屬分別是枝孢瓶霉屬、Phialocephala和鐮孢菌屬，健康沃柑白根根系內(nèi)生真菌相對(duì)豐度最高的屬分別是鐮孢菌屬、隔球囊霉屬（Septoglomus）和根孢囊霉屬（Rhizophagus）。由此可見(jiàn)，不同地區(qū)及不同種植模式均會(huì)影響柑橘根系內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)特征。其中，新赤殼屬被劃分為未定義腐生菌，在不同果園中的占比范圍為8.99%～36.43%。也有研究發(fā)現(xiàn)新赤殼屬真菌具有抗腫瘤和抗瘧疾的活性，以及清除或淬滅活性氧（ROS）的能力（Matsuo et al.，2020；樊銳鋒等，2021）。此外，其他一些種類的內(nèi)生真菌在沃柑根系也不可忽視，如青霉屬在不同果園中的占比范圍為1.91%～11.17%。淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）是對(duì)柑橘木虱具有強(qiáng)致病性的病原真菌（閆建全等，2022），淡紫擬青霉的存在可能在沃柑的生長(zhǎng)發(fā)育中起到一定保護(hù)作用。

在屬分類水平上，各果園中根系內(nèi)生真菌相對(duì)豐度≥5%以上屬的數(shù)量有所差異，表明不同果園的沃柑根系內(nèi)生真菌群落組成及相對(duì)豐度有差異，與大多數(shù)果園相比，果園SC3和QG3的根系內(nèi)生真菌菌群具有更高的偏好性。除了共有的真菌群落外，一些果園中還含有更多特有的真菌類群，如果園QG2特有的根系內(nèi)生真菌屬種類多于其他沃柑果園，可能是該果園陽(yáng)光充足、土壤疏松，土壤理化因子處于適量水平，更有利于根系內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。

3. 3 不同植被管理模式對(duì)廣西沃柑根系內(nèi)生真菌多樣性的影響

本研究中選取生草及清耕管理模式的沃柑果園為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)2種管理模式下根系內(nèi)生真菌的多樣性并未出現(xiàn)規(guī)律性變化趨勢(shì)。自然生草模式和清耕模式的根系內(nèi)生真菌共有218個(gè)屬，自然生草模式較清耕模式的屬數(shù)降低15.89%。而相關(guān)研究表明，生草栽培有利于土壤中微生物增多，如對(duì)渭北旱地蘋果園采取行間生草處理后可提高果園微生物群落的豐富度和功能多樣性（劉富庭等，2014）；人工種草可顯著提高微生物群落豐富度和多樣性，優(yōu)化土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)（肖力婷等，2022）。根系內(nèi)生真菌由于長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，其對(duì)不同生草模式的影響較土壤真菌影響較小（張玉平，2007）。廣西不同果園中沃柑根系內(nèi)生真菌群落多樣性、組成及相對(duì)豐度無(wú)顯著差異。果園SC1的豐富度最高，多樣性較低；果園SC2的豐富度較低，果園QG1較各果園的多樣性較高。采樣的武鳴區(qū)6個(gè)果園的沃柑根系內(nèi)生真菌群落α多樣性與有無(wú)植被無(wú)顯著關(guān)系，對(duì)于β多樣性，各果園群落組成分布較分散且同一果園的各樣本也并非未完全聚在一起，說(shuō)明不僅果園間存在差異，同一果園內(nèi)也存在差異。

3. 4 廣西沃柑根系內(nèi)生真菌的FUNGuild功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果

FUNGuild功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，沃柑根系內(nèi)生真菌腐生營(yíng)養(yǎng)型的相對(duì)豐度最高。由于土壤中腐生真菌的種類相當(dāng)廣泛（周雯娟等，2022），在長(zhǎng)期的相互作用過(guò)程中，土壤中的腐生真菌更有機(jī)會(huì)選擇性地進(jìn)入根內(nèi)成為內(nèi)生真菌（張哲超，2022）。FunGuild是基于已有的文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)真菌功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，目前只注釋到病原、共生和腐生三大營(yíng)養(yǎng)功能類群，其準(zhǔn)確性和全面性在未來(lái)還有待進(jìn)一步提高（Simons et al.，2021）。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)沃柑根系內(nèi)生真菌群落組成和多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了大量未分類的OTUs，其一，與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法相比，利用高通量測(cè)序技術(shù)可鑒定到更多的內(nèi)生真菌；其二，沃柑根系內(nèi)生真菌中存在大量未分類的真菌群落，受限于真菌數(shù)據(jù)庫(kù)，無(wú)法對(duì)這些真菌群類進(jìn)行功能分類；其三，很多未被發(fā)掘的真菌類群可能難以進(jìn)行人工分離培養(yǎng)，需要通過(guò)改良分離培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)一步發(fā)掘內(nèi)生真菌資源。

4 結(jié)論

廣西沃柑根系內(nèi)生真菌以新赤殼屬和青霉屬為優(yōu)勢(shì)屬，該區(qū)域尺度下的沃柑根系內(nèi)生真菌群落組成與生草管理無(wú)顯著相關(guān)，但受部分土壤環(huán)境因子調(diào)控。

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（責(zé)任編輯 鄧慧靈）

收稿日期：2023-02-06

基金項(xiàng)目：廣西科技重大專項(xiàng)（桂科AA18242026）；廣西科技基地和人才專項(xiàng)（桂科AD20159001）；廈門大學(xué)聯(lián)合項(xiàng)目（ KJ2023480B）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（2023YM96）

通訊作者：張金蓮（1978-），https：//orcid.org/0000-0002-0375-5121，博士，主要從事叢枝菌根真菌研究工作，E-mail：zhangjinlian1@126.com；姜明國(guó)（1973-），https：//orcid.org/0000-0003-2279-5740，博士，教授，主要從事微生物生物技術(shù)研究工作，E-mail：mzxyjiang@gxun.edu.cn

第一作者：徐杰（1997-），https：//orcid.org/0000-0002-6307-5486，研究方向?yàn)槲⑸锱c植物互作，E-mail：1329426926@qq.com