滕少花 肖正中 周曉情 吳柱月 馮顯鈐 周俊華 黃麗 王啟芝 王自豪

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.008

摘要：【目的】探索羅漢果渣發(fā)酵料替代部分日糧對富鳳麻雞大腸微生物群落多樣性的影響，為羅漢果渣發(fā)酵料在雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)?！痉椒ā窟x定60日齡的富鳳麻雞（母雞）20羽，隨機(jī)分成4組，使用羅漢果渣發(fā)酵料分別替代3%、6%、9%日糧，以全日糧為對照（CK），進(jìn)行為期97 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)。飼喂結(jié)束后，采集雞大腸內(nèi)容物，基于Illumina高通量測序技術(shù)探究3種替代日糧比例對富鳳麻雞大腸微生物群落多樣性的影響?！窘Y(jié)果】不同比例替代日糧處理的富鳳麻雞大腸微生物群落的Chao1指數(shù)排序?yàn)镃K>替代9%>替代3%>替代6%，Shannon指數(shù)排序?yàn)镃K>替代9%>替代3%=替代6%，Simpson指數(shù)排序?yàn)镃K=替代9%>替代3%=替代6%。經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)，各試驗(yàn)組與CK的Chao1指數(shù)無顯著差異（P>0.05，下同），表明羅漢果渣發(fā)酵料替代日糧處理對富鳳麻雞大腸細(xì)菌群落物種的豐富度均無影響。替代3%日糧的富鳳麻雞大腸微生物群落的Shannon指數(shù)顯著低于CK（P<0.05，下同），其他試驗(yàn)組的Shannon指數(shù)與CK無顯著差異；替代3%和6%日糧處理大腸微生物群落的Simpson指數(shù)顯著低于CK，而替代9%日糧的Simpson指數(shù)與CK無顯著差異。門分類水平上共注釋出29個(gè)細(xì)菌門，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是4組試驗(yàn)中的絕對優(yōu)勢菌門，擬桿菌門的相對豐度排序?yàn)樘娲?%>CK>替代3%>替代6%，厚壁菌門的相對豐度排序?yàn)樘娲?%>替代3%>CK>替代9%，變形菌門的相對豐度排序?yàn)樘娲?%>替代6%>CK>替代9%。其中，替代3%日糧處理的大腸微生物群落變形菌門相對豐度顯著高于CK，替代9%日糧處理的變形菌門相對豐度顯著低于CK，而替代6%日糧處理的變形菌門相對豐度與CK無顯著差異。屬分類水平上，變形菌屬（Proteus）的相對豐度在4組試驗(yàn)中有顯著差異，其相對豐度排序?yàn)樘娲?%>替代3%>CK>替代9%，其中，替代9%日糧處理的變形菌屬相對豐度顯著低于CK，而替代3%和6%日糧處理與CK無顯著差異?！窘Y(jié)論】基于物種豐富度、羅漢果渣的營養(yǎng)成分及變形菌門的豐度對富鳳麻雞大腸微生物群落影響的保守評估，羅漢果渣發(fā)酵料替代日糧的最佳替代比例為6%。

關(guān)鍵詞：富鳳麻雞；羅漢果渣；腸道菌群；微生物多樣性

中圖分類號：S831.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）06-1667-09

Effects of fermented Siraitia grosvenorii residue replacing part of diet on large intestinal microbial community diversity of

Fufeng Ma chickens

TENG Shao-hua， XIAO Zheng-zhong*， ZHOU Xiao-qing， WU Zhu-yue， FENG Xian-qian， ZHOU Jun-hua， HUANG Li， WANG Qi-zhi， WANG Zi-hao

（Guangxi Vocational University of Agriculture，Nanning，Guangxi? 530007，China）

Abstract：【Objective】The objective of this study was to explore the effects of fermented Siraitia grosvenorii residue replacing part of diet on large intestinal microbial community diversity of Fufeng Ma chickens， and to provide a reference basis for the application of fermented S. Grosvenorii residue in chicken breeding production. 【Method】Twenty 60-day-old Fufeng Ma chickens （hens） were selected and randomly divided into four groups. The diets of 3%， 6%， and 9% were replaced with fermented S. grosvenorii residue respectively. The whole diet （CK replacement） was used as the control group （CK） in a feeding trial for 97 d. After feeding， the contents of the chicken large intestine were collected， and the effects of three alternative dietary proportions on the diversity of the large intestine microbial community in Fufeng Ma chickens were explored based on Illumina high-throughput sequencing technology. 【Result】The Chao1 index of the large intestinal microbial community of Fufeng Ma chickens treated with different proportions of alternative diets was ranked as CK>replacing 9%>replacing 3%>replacing 6%， the Shannon index was ranked as CK>replacing 9%>replacing 3%=repla-cing 6%， and the Simpson index was ranked as CK=replacing 9%>replacing 3%=replacing 6%. Wilcoxon test showed that there was no significant difference in the Chao1 index between the test groups and CK （P>0.05， the same below）， indicating that the treatment of fermented S. grosvenorii residue replacing diet had no effect on the species richness of large intestinal microbial community in Fufeng Ma chickens. The Shannon index of the large intestinal microbial community of Fufeng Ma chickens replacing 3% of the diet was significantly lower than CK （P<0.05， the same below）， and there was no significant difference in the Shannon index between the other test groups and CK. The Simpson index of the large intestinal microbial community in the treatment of replacing 3% and 6% diets was significantly lower than CK， while the Simpson index of replacing 9% diets was not significantly different from CK. At the phylum level， a total of 29 bacterial phyla were annotated， among which Bacteroidetes， Firmicutes， and Proteobacteria were the absolute dominant phyla in the four groups of experiments. The relative abundance of Bacteroidetes was ranked as replacing 9%>CK>replacing 3%>replacing 6%， Firmicutes was ranked as replacing 6%>replacing 3%>CK>replacing 9%， and Proteobacteria was ranked as replacing 3%>replacing 6%>CK>replacing 9%. Among them， the relative abundance of Proteobacteria in the large intestinal microbial community was significantly higher than CK in the treatment of replacing 3% of the diet， while the relative abundance of Proteobacteria in the treatment of replacing 9% of the diet was significantly lower than CK. However， there was no significant difference in the relative abundance of Proteobacteria between the treatment of replacing 6% of the diet and CK. At the level of genus classification， there were significant differences in the relative abundance of Proteus genus among the four groups of experiments， with a relative abundance ranking of replacing 6%>replacing 3%>CK>replacing 9%. Among them， the abundance of Proteus genus in the treatment of replacing 9% diet was significantly lower than CK， while there was no significant difference between the treatment of replacing 3% and 6% diet and CK. 【Conclusion】Based on the conservative assessment of the effects of species richness， nutrient composition of S. grosvenorii residue and the abundance of Proteobacteria on the large intestinal microbial community in Fufeng Ma chickens， the optimal replacement proportion of fermented S. grosvenorii residue to diet is 6%.

Key words： Fufeng Ma chicken； Siraitia grosvenorii residue； intestinal microflora； microbial diversity

Foundation items： Guangxi Key Research and Development Project （Guike AB20297012）； Guangxi Science and Technology Base and Talent Special Project （Guike AD21238004）

0 引言

【研究意義】由于羅漢果（Siraitia grosvenorii）提取物及其制劑具有很高臨床治療價(jià)值，眾多研究者熱衷于羅漢果甜苷成分和黃酮的功能研究。然而，羅漢果活性成分提取或加工成制劑、含片、飲料后的羅漢果渣卻沒有得到更充分的利用。根據(jù)《廣西羅漢果優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)集群建設(shè)方案（2020—2022年）》，2022年廣西羅漢果產(chǎn)量達(dá)27.42萬t，可利用羅漢果渣達(dá)21.94萬t。羅漢果渣的主要營養(yǎng)成分包含8.94%粗蛋白質(zhì)、89.54%干物質(zhì)、22.48%粗纖維、0.99%粗脂肪、73.20%酸性洗滌纖維、88.35%中性洗滌纖維、1.30%粗灰分、0.22%磷及0.25%鈣；其粗蛋白含量與象草相當(dāng)，高于甘蔗尾葉和玉米秸稈，粗脂肪含量比甘蔗尾葉、玉米秸稈和象草低65%左右，中性洗滌纖維含量是甘蔗尾葉、玉米秸稈和象草的1.18倍以上，酸性洗滌纖維含量則是甘蔗尾葉、玉米秸稈和象草的1.6倍以上?？梢姡_漢果渣非常適合作為非糧飼料資源予以開發(fā)（王啟芝等，2018）。腸道微生物對畜禽的生產(chǎn)性能、健康和飼糧的消化吸收等均具有重要意義，日糧、基因型及養(yǎng)殖環(huán)境等也影響腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能特性。因此，研究日糧成分組成、養(yǎng)殖環(huán)境和飼養(yǎng)方式等對畜禽腸道微生物的影響，對進(jìn)一步調(diào)控腸道微生物及提高畜禽生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】日糧的成分組成對家禽腸道微生物的影響目前已有許多報(bào)道。采食不含纖維日糧的腸道微生物中含有比較低的產(chǎn)丁酸菌（Faecalibacterium prausnitzii屬和Roseburia spp.）；而來自產(chǎn)丁酸菌的丁酸鹽有利于結(jié)腸黏膜屏障功能的完整性（Benus et al.，2010）。提高日糧中粗蛋白含量可能會(huì)增加產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量，而產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素可導(dǎo)致動(dòng)物和人致命的出血性腸炎（Delphine et al.，2013；張嵩等，2018）。富含n-3多不飽和脂肪酸的飲食可顯著提高小鼠腸道內(nèi)乳酸菌和雙歧桿菌等益生菌的含量；n-3多不飽和脂肪酸可能通過影響腸道菌群間接影響基因的合成從而達(dá)到減肥的目的（喬立君等，2014）。高油脂低碳水化合物日糧相比于低油脂可顯著提高斷奶豬仔盲腸和結(jié)腸中大腸桿菌的數(shù)量，同時(shí)降低乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量；降低日糧中碳水化合物與植物性脂肪能值比對腸道微生物菌群及代謝物更有利（于文雅等，2015）。劉夢蕓等（2016）報(bào)道，游離的中鏈脂肪酸因與禽畜胃腸道內(nèi)的細(xì)菌病原體細(xì)胞膜具有相同的極性，可跨膜進(jìn)入病原體細(xì)胞，其在細(xì)胞內(nèi)的酸化及其降解形成的飽和脂肪酸（由6～12個(gè)碳原子構(gòu)成）可阻斷病原體的DNA復(fù)制，從而起到抑制病原菌及調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的作用。發(fā)酵底物更多及發(fā)酵時(shí)間更長可能是碳水化物中的可溶性纖維增加雞腸道細(xì)菌的數(shù)量和多樣性的主要原因；機(jī)械刺激腸道、增加排空速度、減少腸道發(fā)酵時(shí)間及降低病原菌黏附腸道是不溶性纖維降低或增加病原菌的原因；過量的不可溶性纖維可能會(huì)機(jī)械損傷腸道完整性及影響營養(yǎng)物質(zhì)分配，導(dǎo)致病原菌增加（張嵩等，2018）。以上研究表明，日糧中的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪均對家禽腸道微生物產(chǎn)生影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，有關(guān)日糧中非糧飼料資源的添加對雞腸道微生物群落結(jié)構(gòu)特征及消化功能的影響已有較多報(bào)道（孫艷發(fā)等，2016；張倩雲(yún)，2021），而鮮見以羅漢果渣為營養(yǎng)來源替代部分日糧對雞腸道微生物多樣性影響的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以富鳳麻雞的大腸內(nèi)容物細(xì)菌菌落的DNA為研究對象，利用高通量測序技術(shù)（Next generation sequencing）對細(xì)菌菌落16S rRNA擴(kuò)增子的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行測序，通過生物信息學(xué)方法分析菌落的物種組成及相對豐度差異，探索羅漢果渣發(fā)酵料替代部分日糧對雞腸道微生物多樣性的影響，同時(shí)評估羅漢果渣發(fā)酵料替代日糧的最佳比例，為羅漢果渣發(fā)酵料在雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 羅漢果渣發(fā)酵料制備

羅漢果渣購自桂林同盛生態(tài)養(yǎng)殖有限公司。將羅漢果渣進(jìn)行粉碎后，添加由江西宜春強(qiáng)微生物科技有限公司生產(chǎn)的增香青貯微貯劑，充分混合后裝罐壓實(shí)，經(jīng)35 d發(fā)酵后使用。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于廣西畜牧研究所實(shí)驗(yàn)雞場選定遺傳背景相近、體況良好的自繁60日齡的富鳳麻雞（母雞）20羽，隨機(jī)分成4組，每組5羽。其中，3個(gè)試驗(yàn)組分別以羅漢果渣發(fā)酵料替代日糧的比例，依次為3%、6%和9%，全日糧試驗(yàn)組為對照（CK）。試驗(yàn)為期97 d，其中，預(yù)飼期7 d，正式期90 d。

1. 3 飼養(yǎng)管理

雞采食日糧原料組成和營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)雞群自由飲水、自由采食，其他管理按雞場正常生產(chǎn)管理進(jìn)行。

1. 4 樣品采集及DNA提取

將各組試驗(yàn)雞靜脈放血處死，5%新潔爾滅消毒液浸泡5 min全身消毒，無菌操作，剖開腹腔，玻璃棒刮取大腸腸壁內(nèi)容物迅速放入經(jīng)過滅菌的離心管內(nèi)，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法對各樣本的雞大腸內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌菌群的DNA進(jìn)行提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取的質(zhì)量，同時(shí)采用Qubit（Invitrogen，美國）對DNA進(jìn)行定量。

1. 5 16S rDNA擴(kuò)增子測序及多樣性分析

根據(jù)細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增V3和V4區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，正向引物341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'，反向引物805R：5'-GACTACHVGGGTATCTAA TCC-3'，并在引物上添加測序通用接頭和樣本特異性Barcode序列，進(jìn)而對該區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃ 10 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行回收，回收采用AMPure XT beads回收試劑盒。對純化后的PCR產(chǎn)物使用Agilent 2100生物分析儀（Agilent，美國）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美國）的文庫定量試劑盒進(jìn)行評估，合格的文庫濃度在2 nmol/L以上。將合格的各上機(jī)測序文庫（Index序列不可重復(fù)）梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量按相應(yīng)比例混合，經(jīng)NaOH變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測序。使用NovaSeq 6000測序儀進(jìn)行2×250 bp的雙端測序，相應(yīng)試劑為NovaSeq 6000 SP Reagent Kit（500 cycles）。

通過對Reads拼接、過濾、操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類，并與SILVA（Release 132）和NT-16S數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，獲得分類學(xué)上物種注釋。根據(jù)物種注釋的結(jié)果，選取每組樣本在門和屬水平上相對豐度排名靠前的物種進(jìn)行比較分析。計(jì)算OTUs的α多樣性指數(shù)，比較樣品間的差異并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。其中，多組間差異采用Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)，兩組間差異采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。測序與生物信息學(xué)分析委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2. 1 富鳳麻雞大腸微生物群落OTU分析

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行雙端拼接、質(zhì)量控制及嵌合體過濾后，從全日糧及替代3%、6%和9%日糧處理組的總DNA中獲得的平均有效序列數(shù)目分別為71765、76980、75088和66750條。4個(gè)試驗(yàn)組總共獲得長度為400～500 bp的序列為2478189條，占所有序列的99.86%。采用Vsearch算法按照97%的序列相似度將有效序列聚類成為同一OTU（Blaxter et al.，2005），全日糧及替代3%、6%和9%日糧試驗(yàn)組分別獲得3686、3087、3228和3472個(gè)OTUs，特有的OTUs分別為2222、1612、1742和2121個(gè)，共有OTUs 609個(gè)（圖1）。

由圖2可知，替代0%、3%、6%和9%日糧試驗(yàn)組的OTUs稀釋曲線均隨測序數(shù)據(jù)量的增大而趨于平坦，表明樣本的高通量測序數(shù)據(jù)量合理，測序數(shù)據(jù)量足夠反映樣品中物種的組成特征，繼續(xù)增加測序通量只會(huì)產(chǎn)生少量的新OTUs。

2. 2 富鳳麻雞大腸微生物群落的α多樣性分析

從表2可知，全日糧及替代3%、6%和9%日糧處理的Goods coverage指數(shù)均達(dá)100%，說明測序深度能全面反映樣品的細(xì)菌多樣性。Chao1指數(shù)表征群落物種豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)反映群落結(jié)構(gòu)多樣性。不同比例替代日糧處理的富鳳麻雞大腸微生物群落的Chao1指數(shù)排序?yàn)镃K>替代9%>替代3%>替代6%，Shannon指數(shù)的排序?yàn)镃K>替代9%>替代3%=替代6%，Simpson指數(shù)的排序?yàn)镃K=替代9%>替代3%=替代6%。各替代組與CK的Chao1指數(shù)無顯著差異（P>0.05，下同）；替代3%日糧處理的Shannon指數(shù)顯著低于CK（P<0.05，下同），其他試驗(yàn)組的Shannon指數(shù)與CK均無顯著差異；替代3%和6%日糧處理的Simpson指數(shù)顯著低于CK，而替代9%日糧處理的Simpson指數(shù)與CK無顯著差異。因此，羅漢果渣發(fā)酵料替代3%、6%和9%日糧對雞大腸細(xì)菌菌落物種的豐富度無影響，替代3%和6%日糧均降低雞大腸細(xì)菌菌落的多樣性，替代日糧比例達(dá)9%不影響雞大腸細(xì)菌菌落的多樣性。

2. 3 羅漢果渣發(fā)酵料替代部分日糧對富鳳麻雞大腸細(xì)菌門分類水平的影響

如表3所示，富鳳麻雞大腸微生物群落的所有OTUs共注釋出29個(gè)細(xì)菌門。其中，擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度之和在全日糧及替代3%、6%和9%日糧處理中的占比分別為82.87%、88.77%、86.23%和81.26%，是絕對優(yōu)勢菌門。對多組間的每一菌門的相對豐度進(jìn)行差異分析及Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)，擬桿菌門、變形菌門和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度在4組處理中有顯著差異。其中，不同比例替代日糧處理的富鳳麻雞大腸微生物群落的擬桿菌門相對豐度均值排序?yàn)樘娲?%>CK>替代3%>替代6%，變形菌門相對豐度均值排序?yàn)樘娲?%>替代6%>CK>替代9%，酸桿菌門相對豐度均值排序?yàn)樘娲?%>替代3%>CK>替代9%。對替代組與CK兩組間菌門的相對豐度進(jìn)行差異分析并經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，各替代組中擬桿菌門和酸桿菌門與CK均無顯著差異；替代3%日糧處理的變形菌門相對豐度顯著高于CK，替代9%日糧處理的變形菌門相對豐度顯著低于CK，而替代6%日糧處理的變形菌門相對豐度與CK無顯著差異。說明變形菌門是引起替代組與CK菌落多樣性改變的主要細(xì)菌門。

2. 4 羅漢果渣發(fā)酵料替代部分日糧對富鳳麻雞大腸細(xì)菌屬分類水平的影響

富鳳麻雞大腸微生物群落的所有OTUs共注釋出509個(gè)屬。相對豐度均值前50的菌屬如表4所示，相對豐度均值>1%的18個(gè)菌屬隸屬于4個(gè)門（圖3）。其中，擬桿菌屬（Bacteroides）、理研菌科RC9腸道菌（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、擬桿菌目未知菌屬（Bacteroidales_unclassified）、普雷沃氏菌科UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、Muribaculaceae_unclassified、擬桿菌門未知菌屬（Bacteroidetes_unclassified）和副擬桿菌屬（Parabacteroides）隸屬于擬桿菌門；變形桿菌屬（Proteus）和脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）隸屬于變形菌門；糞桿菌屬（Faecalibacterium）、梭菌目未知菌屬（Clostridiales_vadinBB60_group_unclassified）、巨單胞菌屬（Megamonas）、瘤胃菌科UCG-014（Ruminococcaceae_UCG-014）、巨球形菌屬（Megasphaera）、毛螺菌科未知菌屬（Lachnospiraceae_unclassified）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus］_torques_ group）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）隸屬于厚壁菌門；WCHB1-41_unclassified隸屬于kiritimatiellaeota門。對相對豐度均值>1%的菌屬進(jìn)行相對豐度的多組間差異分析并經(jīng)Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)，僅變形桿菌屬的相對豐度在4個(gè)處理中有顯著差異。變形桿菌屬在不同比例替代日糧處理中的相對豐度均值排序?yàn)樘娲?%>替代3%>CK>替代9%。對兩組間的變形桿菌屬的相對豐度進(jìn)行差異分析并進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)，替代9%日糧處理顯著低于CK，而替代3%和9%日糧處理與CK無顯著差異。說明變形桿菌屬是引起替代組與CK菌落多樣性改變的主要菌屬。

3 討論

雞消化道微生物是由大量的革蘭氏陽性菌組成，以擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門（王晶等，2020）。Wei等（2013）對公共數(shù)據(jù)庫中3184個(gè)雞（肉仔雞、蛋雞）腸道微生物的16S rRNA序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門（70%）、擬桿菌門（12.3%）和變形菌門（9.3%）的豐度約占全部序列的90%以上，為雞腸道中的優(yōu)勢菌門；梭菌屬、瘤胃球菌屬、乳酸桿菌屬和擬桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。本研究中，擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門的相對豐度之和在全日糧及替代3%、6%和9%日糧處理組的占比分別為82.87%、88.77%、86.23%和81.26%，是各處理中的優(yōu)勢菌門；梭菌屬、瘤胃菌屬、乳酸桿菌屬和擬桿菌屬也位列于相對豐度>1%的菌屬中，與上述文獻(xiàn)報(bào)道的雞腸道優(yōu)勢菌比較一致。結(jié)合替代組的Chao1指數(shù)與CK無顯著差異的結(jié)果來評價(jià)，用羅漢果渣發(fā)酵料替代3%、6%和9%的日糧并不改變雞腸道菌落的物種組成。動(dòng)物的消化系統(tǒng)對營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的能力部分依賴于腸道的微生物群落的分布（物種豐富度）和總量（豐度）；腸道微生物群落的物種豐富度決定了腸道代謝過程的范圍，微生物的相對豐度決定了腸道代謝過程的程度（王金全等，2005）。添加羅漢果渣發(fā)酵料的日糧，其主要營養(yǎng)成分并不改變，僅在營養(yǎng)成分的含量上有改變。以添加羅漢果渣發(fā)酵料的日糧作為最終代謝底物，雞消化系統(tǒng)所依賴的腸道微生物物種組成的穩(wěn)定保證了腸道代謝范圍的一致，其中原因可能是日糧中添加3%、6%和9%的羅漢果渣發(fā)酵料不改變富鳳麻雞大腸微生物群落的物種組成。

相比于甘蔗尾葉、玉米秸稈和象草的營養(yǎng)成分，羅漢果渣略高的粗蛋白質(zhì)含量、低65%左右的粗脂肪含量、高于1.18倍以上的中性洗滌纖維和高于1.6倍以上的酸性洗滌纖維含量是本研究中評估影響富鳳麻雞腸道菌落多樣性的重要因素。粗蛋白可能會(huì)增加產(chǎn)氣莢膜梭菌的豐度。產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）又稱魏氏梭菌（Clostridium welchii），隸屬于厚壁菌門中的梭菌屬。本研究在種分類水平上未檢測（或注釋）到產(chǎn)氣莢膜梭菌，僅發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌所隸屬的梭菌屬和厚壁菌門在替代組和CK中并無顯著差異，可能與本研究中僅采用16S rRNA擴(kuò)增子的V3和V4可變區(qū)序列對物種進(jìn)行比對與注釋有關(guān)。因此，本研究并不能在種的水平上評估羅漢果渣略高的粗蛋白質(zhì)含量是否對產(chǎn)氣莢膜梭菌的豐度產(chǎn)生影響。脂肪含量的高低可能對腸道內(nèi)的乳酸桿菌、大腸桿菌和雙歧桿菌產(chǎn)生影響。本研究中，乳酸桿菌的相對豐度>1%，其相對豐度在替代組和CK中無顯著差異。大腸桿菌的相對豐度極低，且其在各試驗(yàn)組中的相對豐度差異不顯著。雙歧桿菌是一種具有改善營養(yǎng)元素代謝、抗腐敗菌和致病菌、維持腸道平衡和預(yù)防腸道疾病的益生菌，具有重要生物學(xué)功能（賈子堂和李艷霞，2014）。本研究中，雙歧桿菌雖然相對豐度排名在50名外，但其相對豐度在4個(gè)不同比例替代日糧處理中有顯著差異，其相對豐度排序?yàn)槿占Z>替代9%>替代3%>替代6%。其中，替代3%日糧處理與CK無顯著差異，替代6%和9%日糧處理顯著低于CK。試驗(yàn)組中的替代3%日糧處理可能是因?yàn)樘砑颖壤^低，因此未對雙歧桿菌產(chǎn)生影響。替代6%和9%日糧處理的雙歧桿菌屬相對豐度均顯著低于CK，表明6%和9%的替代比例會(huì)抑制雙歧桿菌的豐度，可能是羅漢果渣粗脂肪含量遠(yuǎn)低于其他非糧飼料資源所引起。纖維可能對腸道產(chǎn)丁酸菌產(chǎn)生影響。本研究中，產(chǎn)丁酸菌Faecalibacterium prausnitzii和Roseburia spp.的相對豐度極低，且在各處理中無顯著差異，表明日糧中添加3%、6%和9%的羅漢果渣均不影響產(chǎn)丁酸菌的豐度。因此，羅漢果渣中含量高于其他非糧飼料資源的中性洗滌纖維及酸性洗滌纖維并不影響富鳳麻雞腸道中的產(chǎn)丁酸菌。

變形菌門是本研究中唯一引起差異的優(yōu)勢菌門。其中，替代3%日糧處理的變形菌門相對豐度（22.26%）顯著高于CK（14.55%），替代9%日糧處理（10.94%）顯著低于CK，而替代6%日糧處理（21.65%）與CK無顯著差異。隨著羅漢果渣替代比例的遞增，變形菌門的相對豐度值遞減，說明羅漢果渣添加比例的增加會(huì)抑制變形菌門的增長。羅漢果提取物的抑菌作用已有報(bào)道。何怡（2020）對黔產(chǎn)羅漢果的抗炎抑菌研究中發(fā)現(xiàn)5個(gè)極性羅漢果提取物體內(nèi)體外均有不同程度的抗炎抑菌作用，其中對大腸桿菌抑制作用最為顯著；對于糞腸球菌，羅漢果提取物中只有水、甲醇、乙醇和正丁醇提取物對其具有抑制作用；對于銅綠假單胞桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌有3個(gè)極性提取物有抑菌活性。羅漢果渣也能抑制變形菌門的增長，可能與羅漢果活性成分提取不完全，果渣中仍殘留有少量的藥效活性成分有關(guān)。

有關(guān)腸道變形菌門豐度的高低對宿主的影響僅在人體的研究中有過報(bào)道。人腸道菌群中的4個(gè)主要菌門（厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門）中，變形菌門最不穩(wěn)定（Faith et al.，2013）。作為一線應(yīng)答者，變形菌門對飲食等環(huán)境因素反應(yīng)敏感（Shin et al.，2015）。臨床上認(rèn)為腸道中變形菌門的擴(kuò)張可反映腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，且這種不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)可在非疾病狀態(tài)（新生兒期和胃旁路手術(shù)后）和疾病狀態(tài)下（代謝紊亂和腸道炎癥中）觀察到（Morgan et al.，2012；Fei and Zhao，2013；Liou et al.，2013；Jakobsson et al.，2014）。目前有關(guān)腸道變形菌門豐度的高低對雞腸道的影響的研究尚未見有報(bào)道。羅漢果渣抑制變形菌門的增長是否對雞的生長性能、免疫或疾病發(fā)生產(chǎn)生影響尚需驗(yàn)證?；诒Ｊ氐脑u估，6%的替代比例不改變富鳳麻雞大腸中變形菌門的豐度，是3個(gè)比例中的最佳添加比例。

4 結(jié)論

用羅漢果渣發(fā)酵料替代3%、6%和9%的日糧飼喂富鳳麻雞，不影響雞大腸細(xì)菌群落的物種豐富度。3%和6%的替代比例降低雞大腸細(xì)菌群落的多樣性，而9%的替代比例對雞大腸細(xì)菌群落多樣性無影響。6%的替代比例降低雞大腸中益生菌雙歧桿菌的豐度，但對變形菌門的豐度無影響?；谖锓N豐富度、羅漢果渣的營養(yǎng)成分及變形菌門的豐度對富鳳麻雞大腸微生物群落影響的保守評估，羅漢果渣發(fā)酵料替代日糧的最佳替代比例為6%。

參考文獻(xiàn)：

何怡. 2020. 黔產(chǎn)羅漢果抗炎抑菌譜效關(guān)系研究［D］. 貴陽：貴州大學(xué). ［He Y. 2020. Study on anti-inflammatory and bacteriostatic spectrum-effect relationship of Siraitia grosvenorii in Guizhou［D］. Guiyang：Guizhou University.］

賈子堂，李艷霞. 2014. 雙歧桿菌功能與應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］. 當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，（10）：6-8. ［Jia Z T，Li Y X. 2014. Advance in the function and application of Bifidobacterium［J］. Modern Animal Husbandry，（10）：6-8.］ doi：10.14070/j.cnki.15-1150.2014.10.051.

劉夢蕓，趙豪斌，鄧伶俐，趙敏潔，張輝，馮鳳琴. 2016. 中鏈脂肪酸在雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］. 中國家禽，38（15）：43-47. ［Liu M Y，Zhao H B，Deng L L，Zhao M J，Zhang H，F(xiàn)eng F Q. 2016. Application of medium-chain fatty acids in chicken breeding［J］. China Poultry，38（15）：43-47.］ doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2016.15.009.

喬立君，鄭征，馬文慧，蘆庭秀，蓋曉英，葛銀林. 2014. 多不飽和脂肪酸對大鼠腸道菌群及脂肪代謝相關(guān)基因的影響［J］. 食品科學(xué)，35（17）：231-235. ［Qiao L J，Zheng Z，Ma W H，Lu T X，Gai X Y，Ge Y L. 2014. Effect of PUFA-containing diet on gut microbiota and fat metabolism-related genes in rats［J］. Food Science，35（17）：231-235.］ doi：10.7506/spkx1002-6630-201417044.

孫艷發(fā)，李焰，張敏，張茂，李虹儀，許衛(wèi)華，黃其春，盧永恒，莊翔玲，范伯全. 2017. 日糧添加茶籽餅粕對肉雞脂肪代謝、免疫功能和腸道微生物的影響［J］. 飼料研究，（3）：1-5. ［Sun Y F，Li Y，Zhang M，Zhang M，Li H Y，Xu W H，Huang Q C，Lu Y H，Zhuang X L，F(xiàn)an B Q. 2017. Effects of adding tea seed cake cypress to diet on fat metabolism， immune function and intestinal microorganisms in broilers［J］. Feed Research，（3）：1-5.］ doi：10. 13557/j.cnki.issn1002-2813.2017.03.001.

王金全，蔡輝益，周巖華，劉國華，張姝，印遇龍. 2005. 小麥日糧非淀粉多糖和木聚糖酶對肉仔雞腸道微生物區(qū)系的影響［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，36（10）：1014-1020. ［Wang J Q，Cai H Y，Zhou Y H，Liu G H，Zhang S，Yin Y L. 2005. Effects of wheat NSP and xylanase on intestinal microbial population and microbial diversity in broilers［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，36（10）：1014-1020.］ doi：10.3321/j.issn：0366-6964.2005.10.007.

王晶，戴東，武書庚，張海軍，齊廣海. 2020. 雞腸道微生物演替與早期定植的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，36（2）：1-8. ［Wang J，Dai D，Wu S G，Zhang H J，Qi G H. 2020. Advances in successional development and early establishment of the chicken intestinal microbiota［J］. Biotechnology Bulletin，36（2）：1-8.］ doi：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-1197.

王啟芝，黃光云，梁琪妹，周俊華，黃麗霞，黃香，周志揚(yáng)，羅鮮青，孫俊麗，唐承明，李紹波，何仁春. 2018. 廣西17種非糧飼料資源營養(yǎng)價(jià)值監(jiān)測［J］. 糧食與飼料工業(yè)，（4）：47-50. ［Wang Q Z，Huang G Y，Liang Q M，Zhou J H，Huang L X，Huang X，Zhou Z Y，Luo X Q，Sun J L，Tang C M，Li S B，He R C. 2018. Nutritional value monitoring of 17 kinds of non-grain feed resources in Guangxi［J］. Cereal & Feed Industry，（4）：47-50.］ doi：10.7633/j.issn.1003-6202.2018.04.012.

于文雅，孫澤威，劉飛飛，孫會(huì)，王富貴. 2015. 日糧碳水化合物與油脂能值比對斷奶仔豬腸道微生物的影響［J］. 中國畜牧雜志，51（17）：35-38. ［Yu W Y，Sun Z W，Liu F F，Sun H，Wang F G. 2015. Influence of diet ary ratio of CEV to FEV on intestinal microbial flora of weaned pigs［J］. Chinese Journal of Animal Science，51（17）：35-38.］ doi：10.3969/j.issn.0258-7033.2015.17.008.

張倩雲(yún). 2021. 早期日糧添加大豆?jié)饪s蛋白對肉雞生產(chǎn)性能、氨基酸表觀消化率、腸道發(fā)育和腸道微生物及其代謝產(chǎn)物的影響［D］. 南寧：廣西大學(xué). ［Zhang Q Y. 2021. Effects of soy protein concentrate in starter phase diet on growth performance， apparent digestibility of amino acids， intestinal development， intestinal microorganisms and metabolites of broilers［D］. Nanning：Guangxi University.］

張嵩，羅正，程軍波. 2018. 日糧因素對肉雞腸道菌群的影響研究進(jìn)展［J］. 中國家禽，40（19）：49-52. ［Zhang S，Luo Z，Cheng J B. 2018. Effects of dietary compositions on intestinal microflora in broiler chicken［J］. China Poultry，40（19）：49-52.］ doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2018. 19.011.

Benus R F J，van der Werf T S，Welling G W，Judd P A，Taylor M A，Harmsen H J M，Whelan K. 2010. Association between Faecalibacterium prausnitzii and dietary fibre in colonic fermentation in healthy human sujects［J］. British Journal of Nutrition，104（5）：693-700. doi：10.1017/S000 7114510001030.

Blaxter M，Mann J，Chapman T，Tomas F，Whitton C，F(xiàn)loyd R，Abebe E. 2005. Defining operational taxonomic units using DNA barcode data［J］. Philosophical transactions of the Royal Society of London，360（1462）：1935-1943. doi：10.1098/rstb.2005.1725.

Delphine A，Marianne W，Michel P，Katharina D，Stephan C. 2013. Clostridium perfringens beta-toxin induces necrostatin-inhibitable， calpain-dependent necrosis in primary porcine endothelial cells［J］. PLoS One，8（5）：e64644. doi：10.1371/journal.pone.0064644.

Faith J J，Lelwala-Guruge J，Charbonneau M，Subramanian S，Seedorf H，Goodman A L，Clemente J C，Knight R，Heath A C，Leibel R L，Rosenbaum M，Gordon J I. 2013. The long-term stability of the human gut microbiota［J］. Science， 341（6141）：1237439. doi：10.1126/science. 1237439.

Fei N，Zhao L P. 2013. An opportunistic pathogen isolated from the gut of an obese human causes obesity in germfree mice［J］. The ISME Journal，7：880-884. doi：10.1038/ismej.2012.153.

Jakobsson H E，Abrahamsson T R，Jenmalm M C，Harris K，Quince C，Jernberg C，Bj?rkstén B，Engstrand L，Andersson A F. 2014. Decreased gut microbiota diversity， delayed Bacteroidetes colonisation and reduced Th1 responses in infants delivered by caesarean section［J］. Gut，63（4）：559-566. doi：10.1136/gutjnl-2012-303249.

Liou A P，Paziuk M，Luevano J M Jr，Machineni S，Turnbaugh P J，Kaplan L M. 2013. Conserved shifts in the gut microbiota due to gastric bypass reduce host weight and adiposity［J］. Science Translational Medicine，5（178）：178ra41. doi：10.1126/scitranslmed.3005687.

Morgan X C，Tickle T L，Sokol H，Gevers D，Devaney K L，Ward D V，Reyes J A，Shah S A，Leleiko N，Snapper S B，Bousvaros A，Korzenik J，Sands B E，Xavier R J，Huttenhower C. 2012. Dysfunction of the intestinal microbiome in inflammatory bowel disease and treatment［J］. Genome Biology，13（9）：R79. doi：10.1186/gb-2012-13-9-r79.

Shin N R，Whon T W，Bae J W. 2015. Proteobacteria： Microbial signature of dysbiosis in gut microbiota［J］. Trends in Biotechnology，33（9）：496-503. doi：10.1016/j.tibtech. 2015.06.011.

Wei S，Morrison M，Yu Z. 2013. Bacterial census of poultry intestinal microbiome［J］. Poultry Science，92（3）：671-683. doi：10.3382/ps.2012-02822.

（責(zé)任編輯 鄧慧靈）

收稿日期：2022-06-08

基金項(xiàng)目：廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB20297012）；廣西科技基地和人才專項(xiàng)（桂科AD21238004）

通訊作者：肖正中（1985-），https：//orcid.org/0000-0002-0929-8734，高級畜牧師，主要從事畜禽生態(tài)養(yǎng)殖與動(dòng)物營養(yǎng)研究工作，E-mail：269449090@qq.com

第一作者：滕少花（1969-），https：//orcid.org/0000-0003-4553-9619，研究員，主要從事南方牧草選育與生態(tài)治理研究工作，E-mail：tsh088@126.com