于秀明,杜 雨,汪 鵬,李 倩,王玉祥,張 博

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)具有耐鹽堿、抗旱和抗寒等優(yōu)良抗逆性狀,廣泛分布于我國北方地區(qū),在新疆北疆地區(qū)分布尤為廣泛。黃花苜蓿也是進(jìn)行苜蓿育種改良重要基因源,種群間存在著廣泛的遺傳多樣性,可以與紫花苜蓿進(jìn)行自然雜交[3-5]。

中國的黃花苜蓿資源豐富、分布廣泛且形態(tài)變異大,隨著地理環(huán)境和生態(tài)條件的不同,植株的高矮、葉片形狀和大小、莢果形狀和大小都有很大差異[6],形態(tài)差異是種質(zhì)篩選的重要依據(jù)。黃花苜蓿種群間、種群內(nèi)表型性狀差異大,具有豐富的遺傳多樣性[3,4,7]。相關(guān)研究結(jié)果表明,苜蓿類群間表型性狀的多樣性程度與生境呈正相關(guān)關(guān)系[5,8-10],同時,黃花苜蓿的遺傳多樣性不僅存在于種群間,不同雜交種之間以及不同個體之間也具有豐富表型性狀差異[11]。

核心種質(zhì)的概念最早是由Frankel等[12]提出的,是以最少數(shù)量的遺傳資源最大限度的保存整個資源群體的遺傳多樣性和整個群體的地理分布,以此來提高種質(zhì)資源的利用和基因挖掘的效率。目前已經(jīng)在許多植物上應(yīng)用,如玉米[13]、番茄[14]、菠菜[15]、大豆[16]等作物中,1995年Diwan通過從3 159份一年生苜蓿材料中選出211份材料作為核心種質(zhì),構(gòu)建了一年生苜蓿的核心種質(zhì)[17],同年,Basigalup等[18]從1 100份多年生苜蓿材料中選出200份材料作為多年生苜蓿核心種質(zhì)。

為了鑒定出優(yōu)質(zhì)的新疆野生黃花苜蓿核心種質(zhì)資源,本研究選擇70份黃花苜蓿種質(zhì),對其遺傳多樣性分析并抽取核心種質(zhì),以期為新疆黃花苜蓿育種和新品種選育提供材料基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草種質(zhì)資源與育種團(tuán)隊提供,來自哈密地區(qū)：巴里坤縣、阿格喜沃巴村和伊吾縣等地共23份,伊犁地區(qū)：特克斯縣、尼勒克縣兩地共4份,昌吉地區(qū)：瑪納斯縣、奇臺縣等地共14份,阿勒泰地區(qū)：布爾津縣、哈巴河縣、富蘊縣、吉木乃縣等地共20份,塔城地區(qū)：額敏縣、西戈壁縣、裕民縣等地共9份。

2021年7月在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院人工氣候室育苗,育苗袋尺寸為10 cm×9 cm×8.5 cm;溫度白天25℃,夜間20℃。選擇籽粒飽滿的種子并將種皮劃破從而破除休眠,播種深度為1 cm;萌發(fā)期3 d澆水一次,出苗之后5～7 d天澆水一次,生長4周之后進(jìn)行倍性檢驗試驗,后繼續(xù)生長2周,于初霜期之前移入新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪教學(xué)實踐基地,株行距均為60 cm,次年初花期值成熟期進(jìn)行形態(tài)數(shù)據(jù)采集。

1.2 試驗方法

1.2.1性狀調(diào)查方法 在黃花苜蓿初花期(50%開花)進(jìn)行數(shù)據(jù)測量,測量項目及標(biāo)準(zhǔn)如下：

株高(Plant height,PH)：從地表到植株頂部的絕對高度(cm);

節(jié)間長(Internode length,IL)：由地面向上第4個節(jié)間長度(cm);

莖粗(Stem diameter,ST)：測定節(jié)間長的同時測定基部粗度(mm);

莖節(jié)數(shù)(Number of stem nodes,NS)：測定節(jié)間長的同時測定莖節(jié)數(shù)(個);

單枝花序數(shù)(Single branch flower ordinal number,BFON)：主枝上開放的花序以及未開放的花蕾的總數(shù)(個);

單序小花數(shù)(Number of florets in single order,NFSO)：開花期測定主枝上開放花序的小花總數(shù)(個);

花序長(Inflorescence length,IL)：測定花序基部至頂端之間的距離(mm);

花序?qū)?Inflorescence width,IW)：測定花序中間部位的寬度(mm);

小花長(Floret length,FL)：小花花萼基部到花冠頂端之間的垂直距離(mm);

葉長(Leaf length,LL)：主莖上從上向下數(shù)第四個葉片中間小葉長度(mm);

葉寬(Leaf width,LW)：主莖上從上向下數(shù)第四個葉片中間小葉寬度(mm);

葉面積(Leaf area,LA)：主莖上從上向下數(shù)第四個葉片中間小葉面積(mm)。

在成熟期(莢果成熟70%)進(jìn)行下列數(shù)據(jù)的測量：

莢長(Pod length,PL)：隨機(jī)選取30個成熟莢果,測量莢長(mm);

莢寬(Pod width,PW)：隨機(jī)選取30個成熟莢果,測量莢寬(mm);

莢厚(Pod thickness,PT)：隨機(jī)選取30個成熟莢果,測量莢厚(mm);

單莢種子數(shù)(Number of seeds per pod,NSPP)：測定 100 粒莢果含種子數(shù),相差小于 5%時,取平均值(粒);

種子長(Seed length,SL)：隨機(jī)選取100個成熟飽滿種子,測量種子長(mm);

種子寬(Seed width,SW)：隨機(jī)選取100個成熟飽滿種子,測量種子寬(mm);

種子厚(Seed thickness,ST)：隨機(jī)選取100個成熟飽滿種子,測量種子厚(mm);

指標(biāo)測量方法參考李志勇等[19]指定的《苜蓿種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2.2種質(zhì)資源的遺傳多樣性 計算所有性狀的均值(Mean,X)、極大值(Max.)、極小值(Min.)、極差(Range)、表型方差(Phenotypic variance)、變異系數(shù)(CV)和標(biāo)準(zhǔn)差(Standard deviation,s)等。根據(jù)計算結(jié)果將所有材料每個性狀劃分為10個等級,按第1級[Xi<(X-2 s)]到第10級[Xi≥(X+2 s)],每0.5 s為1級,每1級的相對頻率(Pi)用于計算多樣性指數(shù)。遺傳多樣性指數(shù)即Shannon-Wiener index(H’)信息指數(shù)。Xi為第i級別中的數(shù)據(jù)[20-22]。

1.2.3核心種質(zhì)庫的構(gòu)建 對新疆野生黃花苜蓿的表型性狀進(jìn)行主成分分析和聚類分析。聚類分析中遺產(chǎn)距離為歐式距離(Euclidean distance),聚類方法采用離差平方和法(Ward’s method)[23]。

根據(jù)各子集的遺傳多樣性分別采用隨機(jī)、位點優(yōu)先和偏離度取樣策略,在聚類方法和取樣策略的基礎(chǔ)上選取5個抽樣比例(10%,15%,20%,25%,30%),對以上取樣策略進(jìn)行檢驗,比較選擇出構(gòu)建新疆野生黃花苜蓿核心種質(zhì)的最終策略。

1.2.4核心種質(zhì)代表性評價 利用均值差異百分率(Mean difference percentage,MD%)、方差差異百分率(Variance difference percentage,VD%)、極差符合率(Coincidence rate of range,CR%)和變異系數(shù)變化率(Variable rate in C.V.,VR%)作為評價參數(shù)[24],利用均值、極值、極差、表型方差、變異系數(shù)等評價核心種質(zhì)的代表性[25]。

1.2.5倍性檢驗方法 使用參照Sysmex Partec GmbH Arndtstraβe 11 a-b試劑盒使用方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析,利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類及方差分析。

H′=-∑Pi×LnPi

式中Pi為某形狀第i級別內(nèi)材料分?jǐn)?shù)占總份數(shù)的百分比,

其中St是核心子集與原始群體t檢驗得到的均值差異顯著(P=0.05)的性狀數(shù),n是性狀總數(shù)。

其中SF是核心子集與原始群體F檢驗得到的方差差異顯著(P=0.05)的性狀數(shù),n是性狀總數(shù)。

其中Rc為核心種質(zhì)庫性狀的極差,Ri是原有遺傳資源性狀的極差,n是性狀總數(shù)。

其中CVc為核心種質(zhì)庫性狀的變異系數(shù),CVi是原始群體的變異系數(shù),n是性狀總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要農(nóng)藝形狀的遺傳多樣性分析

70份黃花苜蓿種質(zhì)資源各性狀變異系數(shù)范圍為14.23%～34.66%,平均變異系數(shù)為24.05%(表1)。其中,單枝花序數(shù)的變異系數(shù)最大為34.66%,變異幅度為8.0～32.0個,葉長的變異系數(shù)最小為14.23%,變異幅度為4.94～15.80 mm。19個性狀的遺傳多樣性指數(shù)分布在1.459 8～2.051 3之間,平均遺傳多樣性指數(shù)為1.924 6,遺傳多樣性指數(shù)最高的為葉寬2.051 3,最低的為單莢種子數(shù)1.459 8。材料具有較大的變異幅度、較高的遺傳多樣性,因此,本研究所選種質(zhì)資源間的遺傳差異大,資源類型豐富,利于特異種質(zhì)的篩選和核心種質(zhì)的抽提。

2.2 主要農(nóng)藝性狀主成分分析

對19個主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分分析,提取到特征值大于1的主成分6個,累計貢獻(xiàn)率為74.131%,反映出表型性狀的變異存在多向性,主成分的特征值分別為3.393,2.136,1.936,1.787,1.288,1.206,包含了19個主要農(nóng)藝性狀的絕大部分信息,表明這5個主成分能夠反映所調(diào)查性狀的基本特征(表2)。

其中第1主成分的貢獻(xiàn)率為21.096%,其中株高、單枝花序數(shù)、花序長、花序?qū)捄蛦涡蛐』〝?shù)的特征向量絕對值較高,表明第1主成分主要反映花部性狀特征;第2主成分的貢獻(xiàn)率為14.856%,其中葉長、葉寬、葉面積的特征向量絕對值較大,表明第2主成分反映葉片性狀特征;第3主成分貢獻(xiàn)率11.24%,其中小花長、種子長、種子寬的特征向量絕對值較大,三者屬于結(jié)實特征因子;第4主成分貢獻(xiàn)率10.19%,其中種子寬和種子厚特征向量絕對值最高,二者為果實特征因子;第5主成分貢獻(xiàn)率9.404%,單莢種子數(shù)特征向量絕對值最高,此為種子產(chǎn)量特征因子;第6主成分貢獻(xiàn)率7.345%,莢長和莢厚特征向量絕對值相對較高,二者可稱為莢果特征因子。

表1 黃花苜蓿種質(zhì)資源性狀的一般性描述及變異情況Table 1 General description and variation of traits of Medicago falcata L. germplasm resources

表2 黃花苜蓿種質(zhì)資源主要農(nóng)藝性狀的主成分分析Table 2 Principal component analysis of major agronomic traits of M. falcata L.germplasm resources

2.3 構(gòu)建核心種質(zhì)的取樣策略

3種取樣策略和5取樣比例中,所得種質(zhì)資源庫的均值差異百分率均低于20%,極差符合率均大于80%[26-28];通過比較變異系數(shù)變化百分率(表3),位點優(yōu)先取樣策略明顯優(yōu)于其他兩種取樣策略,在位點優(yōu)先取樣策略中,取樣比例為30%時,所得種子資源庫最優(yōu);使用離差平方和法進(jìn)行聚類,遺傳距離為歐氏距離,取樣策略為位點優(yōu)先取樣,取樣比例為30%時,構(gòu)建的核心種質(zhì)能夠較好的保留原始種質(zhì)的表型性狀并有效降低遺傳冗余度。通過上述最優(yōu)方法選擇出初級核心種質(zhì)19份。

倍性檢驗共得到68份四倍體材料,1份二倍體材料和1份復(fù)合體材料,由于二倍體和復(fù)合體材料相對稀少,故將二者編入核心種質(zhì)中,得出核心種質(zhì)共21份,如表4所示。

表3 不同策略取樣的種質(zhì)資源與原種質(zhì)性狀差異Table 3 Trait differences between germplasm resources sampled by different strategies and the original germplasm

表4 核心種質(zhì)來源及倍性信息Table 4 Source and ploidy information of core germplasm

2.4 核心種質(zhì)代表性的評價

核心種質(zhì)的均值差異百分率(MD%)為0.00%,各性狀均不存在顯著差異;各性狀的極差符合率(CR%)為97.14%,表明核心種質(zhì)保留了原始群體中的特殊種質(zhì);各性狀指標(biāo)的變異系數(shù)變化率(VR%)為115.87%,變異系數(shù)均高于原始群體,表明核心種質(zhì)具有良好的異質(zhì)性;各項指標(biāo)方差差異百分率(VD%)為5.26%,除株高、莖節(jié)數(shù)、莢長、莢寬、莢厚、單莢種子數(shù)外,其余方差顯著高于原始群體,表明核心種質(zhì)獲得了較大的變異(表5)。

表6所示,利用主成分分析對21份黃花苜蓿核心種質(zhì)資源與原種質(zhì)資源比較分析,二者均有6個主成分特征值大于1,包含各性狀74%以上的遺傳多樣性信息,并且二者累計貢獻(xiàn)率差異不明顯,也證明所構(gòu)建的核心種質(zhì)資源代表性和可靠性較高。

表5 原始種質(zhì)與核心種質(zhì)間P值的比較Table 5 Comparison of P values between original germplasm and core germplasm

表6 原種質(zhì)資源與核心種質(zhì)資源主成分比較Table 6 Comparison of principal components of original germplasm resources and core germplasm resources

3 討論

表型性狀差異是遺傳多樣性最直觀的表現(xiàn),基于表型進(jìn)行遺傳多樣性分析,能夠直觀展示種質(zhì)資源群體的遺傳結(jié)構(gòu),有助于種子的選擇和利用[25]。一般建立核心種質(zhì)資源庫步驟為：數(shù)據(jù)的收集整理,對收集數(shù)據(jù)進(jìn)行分組,種質(zhì)的抽樣,核心種質(zhì)確定及有效性檢驗,即首先通過對收集材料進(jìn)行分組,在組內(nèi)通過合適的抽樣策略和抽樣比例篩選核心種質(zhì),通過一定的統(tǒng)計參數(shù)檢驗核心種質(zhì)庫的代表性[29-30]。

黃花苜蓿在抗旱、耐鹽堿、抗寒等方面均有相應(yīng)的研究[31-34],新疆具有豐富的野生黃花苜蓿資源,但是開展的研究卻很少,主要因為新疆幅員遼闊,黃花苜蓿未進(jìn)行系統(tǒng)化的收集整理工作,無法高效的對其進(jìn)行開展研究。本研究基于70份新疆野生黃花苜蓿種質(zhì)資源的19個表型性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)材料的變異系數(shù)高于10%,則樣本間差異顯著[35-37],本研究中19個性狀的變異系數(shù)均大于10%,性狀之間差異明顯;多樣性指數(shù)能反映遺傳多樣性的豐富度,遺傳多樣性指數(shù)越高,則表明性狀多樣性豐富度越高[37],研究中19個性狀的平均遺傳多樣性指數(shù)為1.9246,遺傳多樣性指數(shù)較高,表明所選用的材料具有較高的離散程度,資源類型豐富。

按照MD%≤20%、CR%≥80%原則,VR%和CR%越大就越能夠代表原種質(zhì)群體的遺傳多樣性[26-28],本研究抽取的核心種質(zhì)MD%=0.00%,CR%=97.14%符合上述原則,且VR%=115.87%,說明所選核心種質(zhì)能夠基本上代表全部種質(zhì)資源的遺傳多樣性。通過主成分分析比較核心種質(zhì)與原種質(zhì)資源的累計貢獻(xiàn)率,發(fā)現(xiàn)二者的累計貢獻(xiàn)率均大于74%,也從另一方面也說明所篩選的核心種質(zhì)具有一定的代表性。

目前,遺傳多樣性分析和主成分分析等方法已成為分析種質(zhì)資源表型多樣性的常用手段,被廣泛應(yīng)用在種質(zhì)資源的鑒定和評價中[38]。本研究的不足之處在于僅對材料樣本的表型性狀進(jìn)行了研究,形態(tài)學(xué)指標(biāo)具有局限性,如環(huán)境變化可能會導(dǎo)致材料形態(tài)發(fā)生變化,后續(xù)應(yīng)結(jié)合分子層面的相應(yīng)技術(shù)手段,多方面多層次的對新疆野生黃花苜蓿種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定,從而提高鑒定的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究中通過表型性狀的遺傳多樣性和倍性檢驗手段構(gòu)建了新疆野生黃花苜蓿的核心種質(zhì),共篩選21份核心種質(zhì),為后續(xù)的相關(guān)研究人才提供快速的檢索取樣方式,簡化了育種工作繁瑣的前期準(zhǔn)備工作,為提高育種工作效率提供一定的理論支持。