李尹琳,趙慶華,夏方山,王 勃,曾 佳

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,山西 太谷 030801)

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素[1],其水平高低直接決定著植物的產(chǎn)量和質(zhì)量的高低[2]。沉降到土壤中的大氣氮素是植物中氮素的主要來源[3-5]。氮沉降的強(qiáng)度不僅會(huì)影響草地植被的蓋度和豐富度[6],還會(huì)影響草地土壤的理化性質(zhì)及物質(zhì)循環(huán),從而影響到整個(gè)草地生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和穩(wěn)定性[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),氮沉降能夠提高草地生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力[9],促進(jìn)其生物量的積累[10]。此外,氮沉降還能促進(jìn)草地植物種子的萌發(fā)及生長(zhǎng)發(fā)育[11],提高草地植物的種子質(zhì)量,對(duì)禾本科植物的影響尤為明顯[12-13]。然而,過量的氮沉降則會(huì)造成草地土壤出現(xiàn)“氮飽和”現(xiàn)象,使土壤pH值降低而嚴(yán)重酸化,最終造成草地植被的生產(chǎn)力下降[14-15]。目前,氮沉降對(duì)草地的影響研究主要集中在草地生態(tài)系統(tǒng)、植被多樣性及植物種子繁殖等方面,但關(guān)于氮沉降對(duì)草地植物種子的抗氧化性能有何影響尚不清楚,因而無法系統(tǒng)揭示氮沉降對(duì)草地植物種子萌發(fā)及適應(yīng)性的內(nèi)在機(jī)理。

白羊草(Bothriochloaischaemum)是禾本科孔穎草屬的多年生優(yōu)質(zhì)牧草,其根系發(fā)達(dá),適應(yīng)性廣,具有耐貧瘠、抗寒、抗旱等優(yōu)良特性[16]。白羊草群落是我國(guó)暖性灌草叢類草地的中旱生草本群落[17],也是黃土高原丘陵地區(qū)草地群落的建群種和優(yōu)勢(shì)種[18],因具有保持水土的特性在維護(hù)區(qū)域生態(tài)景觀和保持生態(tài)質(zhì)量等方面發(fā)揮著不可或缺的作用[19-20]。山西省白羊草資源豐富,分布面積占到了草地總面積的36%以上,是山西省發(fā)展草牧業(yè)的重要優(yōu)質(zhì)飼草資源和生態(tài)草資源,因而白羊草種子的需求量逐年增長(zhǎng)[21-22]。氮素作為植物生長(zhǎng)所必須的元素,對(duì)白羊草的生長(zhǎng)發(fā)育也有很大的影響,但不同植物對(duì)于氮素的需求量存在差異[23]。因此,本研究以白羊草種子為試驗(yàn)材料,探討不同硝酸銨濃度模擬氮沉降對(duì)其抗氧化性能的影響,為進(jìn)一步了解白羊草種子萌發(fā)所需的最佳氮素水平提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試草種為‘太行’白羊草,種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草種子試驗(yàn)室于2019年10月收集,并密封保存于-20℃條件下至2021年3月試驗(yàn)進(jìn)行。種子正常發(fā)芽率在65%左右。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1引發(fā)處理 將均勻飽滿的白羊草種子在25℃黑暗條件下分別浸入濃度為0,70,140,280和1 120 mmol·L-1的NH4NO3溶液中0(CK),3,6,9和12 h后,用蒸餾水快速?zèng)_洗3次,并用濾紙吸干其表面水分后,25℃黑暗條件下自然風(fēng)干2 d。每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù),每個(gè)重復(fù)約1.0 g種子。

1.2.2生理指標(biāo)測(cè)定 粗酶液按照Kibinza等[19]的方法提取,上清液在4℃下保存?zhèn)溆谩３趸锲缁?Superoxide dismutase,SOD)活性參照Rao等[20]的方法測(cè)定;谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)活性參照Madamanchi等[21]的方法測(cè)定;抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性參照Nakano等[22]的方法測(cè)定;過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性參照Clairbone[23]的方法測(cè)定;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量參照Bailly等[24]的方法測(cè)定;可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定,所用試劑盒購于南京建成科技有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù),采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析,用Duncan’s法進(jìn)行多重比較(P=0.05),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源氮引發(fā)對(duì)白羊草種子超氧化物歧化酶活性的影響

由表1可知,引發(fā)時(shí)間相同時(shí),白羊草種子SOD活性隨著NH4NO3濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),引發(fā)3～6 h時(shí),白羊草種子SOD活性在NH4NO3濃度140 mmol·L-1時(shí)顯著高于其他濃度(P<0.05);引發(fā)9～12 h時(shí),白羊草種子SOD活性在NH4NO3濃度70～140 mmol·L-1時(shí)顯著高于其他濃度(P<0.05)。NH4NO3濃度為0 mmol·L-1時(shí),白羊草種子SOD活性在引發(fā)3時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為70 mmol·L-1時(shí),白羊草種子SOD活性在引發(fā)3 h～9 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時(shí),白羊草種子SOD活性在引發(fā)3～6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為280 mmol·L-1時(shí),白羊草種子SOD活性在引發(fā)3～6 h時(shí)顯著高于引發(fā)9～12 h(P<0.05);NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時(shí),白羊草種子SOD活性在3～12 h時(shí)顯著低于CK(P<0.05)。在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1引發(fā)6 h時(shí),白羊草種子SOD活性最高。

表1 氮引發(fā)對(duì)白羊草種子超氧化物歧化酶活性的變化Table 1 Changes of superoxide dismutase activities of Bothriochloa ischaemum seeds with nitrogen primings 單位：U·mg-1 protein

2.2 外源氮引發(fā)對(duì)白羊草種子谷胱甘肽還原酶活性的影響

由表2可知,引發(fā)時(shí)間相同時(shí),白羊草種子GR活性隨著NH4NO3濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),引發(fā)3～12 h時(shí),白羊草種子GR活性在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時(shí)最高,在NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時(shí)顯著低于其他濃度(P<0.05)。NH4NO3濃度為0～70 mmol·L-1時(shí),白羊草種子GR活性在引發(fā)12 h時(shí)最低;NH4NO3濃度為140～280 mmol·L-1時(shí),白羊草種子GR活性在引發(fā)6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時(shí),白羊草種子GR活性在3～12 h時(shí)顯著低于CK(P<0.05)。在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1引發(fā)6 h時(shí),白羊草種子GR活性最高。

表2 氮引發(fā)對(duì)白羊草種子谷胱甘肽還原酶活性的變化Table 2 Changes of glutathione reductase activities of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 單位：U·L-1 protein

2.3 外源氮引發(fā)對(duì)白羊草種子抗壞血酸過氧化物酶活性的影響

由表3可知,引發(fā)時(shí)間相同時(shí),白羊草種子APX活性隨著NH4NO3濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),引發(fā)3～12 h時(shí),白羊草種子APX活性在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時(shí)顯著高于其他濃度(P<0.05)。NH4NO3濃度為0 mmol·L-1時(shí),白羊草種子APX活性在引發(fā)9 h時(shí)最高;NH4NO3濃度為70 mmol·L-1時(shí),白羊草種子APX活性在引發(fā)3 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時(shí),白羊草種子APX活性在引發(fā)6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為280 mmol·L-1時(shí),白羊草種子APX活性在引發(fā)3 h時(shí)最高;NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時(shí),白羊草種子APX活性在3～6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05)。在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1引發(fā)6 h時(shí),白羊草種子APX活性最高。

表3 氮引發(fā)對(duì)白羊草種子抗壞血酸過氧化物酶活性的變化Table 3 Changes of ascorbate peroxidase activities of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 單位：U·min-1·mg-1 protein

2.4 外源氮引發(fā)對(duì)白羊草種子過氧化氫酶活性的影響

由表4可知,引發(fā)時(shí)間相同時(shí),白羊草種子CAT活性隨著NH4NO3濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),引發(fā)3～12 h時(shí),白羊草種子CAT活性在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時(shí)最高。NH4NO3濃度為0 mmol·L-1時(shí),白羊草種子CAT活性在引發(fā)0～6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為70 mmol·L-1時(shí),白羊草種子CAT活性在引發(fā)3～6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時(shí),白羊草種子CAT活性在引發(fā)6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為280 mmol·L-1時(shí),白羊草種子CAT活性在引發(fā)3 h時(shí)顯著高于0 h和9～12 h(P<0.05);NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時(shí),白羊草種子CAT活性在0～3 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05)。在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1引發(fā)6 h時(shí),白羊草種子CAT活性最高。

表4 氮引發(fā)對(duì)白羊草種子過氧化氫酶活性的變化Table 4 Changes of catalase activities of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 單位：U·min-1·mg-1 protein

2.5 外源氮引發(fā)對(duì)白羊草種子丙二醛含量的影響

由表5可知,引發(fā)時(shí)間相同時(shí),白羊草種子MDA含量隨著NH4NO3濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),引發(fā)3～12 h時(shí),白羊草種子MDA含量在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時(shí)最低。NH4NO3濃度為0 mmol·L-1時(shí),白羊草種子MDA含量在引發(fā)12 h時(shí)顯著高于0～6 h(P<0.05);NH4NO3濃度為70 mmol·L-1時(shí),白羊草種子MDA含量在引發(fā)3 h時(shí)顯著低于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時(shí),白羊草種子MDA含量在引發(fā)3 h～9 h時(shí)顯著低于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為280 mmol·L-1時(shí),白羊草種子MDA含量在引發(fā)3 h～6 h時(shí)顯著低于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05);NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時(shí),白羊草種子MDA含量在引發(fā)9 h～12 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05)。在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1引發(fā)6 h時(shí),白羊草種子MDA含量最低。

表5 氮引發(fā)對(duì)白羊草種子丙二醛含量的變化Table 5 Changes of malondialdehyde contents of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 單位：nmol·g-1 protein

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),植物種子的萌發(fā)及其幼苗生長(zhǎng)發(fā)育均需要其內(nèi)部各種酶的參與[30],因而適度的氮沉降不僅能促進(jìn)草地植物的生長(zhǎng)發(fā)育,還能改善草地植物的多樣性,最終可提高草地植物的生物量[31-32]。抗氧化酶作為植物體內(nèi)清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)自由基的重要逆境保護(hù)系統(tǒng)[33],其活性高低直接決定著植物細(xì)胞應(yīng)對(duì)逆境脅迫能力的強(qiáng)弱,對(duì)植物種子的萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)具有重要作用。本研究中,在低濃度(≤140 mmol·L-1)氮引發(fā)下,白羊草種子SOD,GR,APX和CAT活性顯著上升(P<0.05),而其MDA含量顯著下降(P<0.05),這說明適宜濃度的氮引發(fā)使白羊草種子膜透性減弱,減少細(xì)胞膜損傷,促進(jìn)白羊草種子萌發(fā)生長(zhǎng)。這與喬旭等[34]研究在純硝營(yíng)養(yǎng)下增加銨營(yíng)養(yǎng),小麥(Triticumaestivum)的抗氧化性能提高,從而促進(jìn)其生長(zhǎng)的結(jié)論相似。在高濃度(≥280 mmol·L-1)氮引發(fā)下,白羊草種子SOD,GR,APX和CAT活性顯著下降(P<0.05),而MDA含量顯著上升(P<0.05),這可能是由于高濃度氮引發(fā)使細(xì)胞產(chǎn)生滲透脅迫,細(xì)胞內(nèi)ROS的積累加快,ROS的動(dòng)態(tài)平衡被打破,細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度增強(qiáng)[35]。因此,本研究表明,NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時(shí),白羊草種子抗氧化能力強(qiáng),而NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時(shí),白羊草種子抗氧化能力弱。

在氮引發(fā)濃度相同時(shí),引發(fā)時(shí)間對(duì)白羊草種子的抗氧化性能也有作用。本研究表明,除NH4NO3濃度為0 mmol·L-1和1 120 mmol·L-1時(shí)外,隨著引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng),白羊草種子SOD,GR,APX和CAT活性先升高后降低,MDA含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),這說明適度的引發(fā)時(shí)間能夠幫助植物清除體內(nèi)產(chǎn)生的ROS,修復(fù)細(xì)胞膜,而引發(fā)時(shí)間過長(zhǎng),白羊草種子細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)遭到強(qiáng)烈破壞,產(chǎn)生的ROS不能得到有效處理,脂質(zhì)過氧化嚴(yán)重[22,36]。這與前人在紫花苜蓿(Medicago sativa)[37]、燕麥(Avenasativa)[38]等種子的研究中的試驗(yàn)結(jié)論相似。而NH4NO3濃度為0 mmol·L-1時(shí),隨著引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng),白羊草種子SOD和APX活性先升高后降低,GR和CAT活性逐漸降低,MDA含量逐漸升高,說明在低濃度時(shí),短時(shí)間內(nèi)GR和CAT在抗氧化系統(tǒng)中起主要清除作用。NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時(shí),隨著引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng),白羊草種子SOD,GR和CAT活性逐漸降低,APX活性先升高后降低,MDA含量逐漸升高,說明在高濃度時(shí),短時(shí)間內(nèi)SOD,GR和CAT在抗氧化系統(tǒng)中起主要清除作用,而長(zhǎng)時(shí)間的引發(fā),白羊草種子抗氧化能力越弱,脂質(zhì)過氧化程度越嚴(yán)重,影響其萌發(fā)[22]。本研究表明,白羊草種子在引發(fā)12 h時(shí),白羊草種子抗氧化能力弱。綜上所知,濃度為1 120 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)白羊草種子抗氧化能力最弱。因此,過量的氮引發(fā)會(huì)使白羊草種子抗氧化性能降低,從而抑制草地植物種子的萌發(fā)及生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

氮引發(fā)對(duì)白羊草種子抗氧化性能的影響與其濃度和引發(fā)時(shí)間均有密切關(guān)系。濃度≤140 mmol·L-1時(shí)的氮引發(fā)白羊草種子時(shí),SOD,GR,APX和CAT活性顯著升高(P<0.05),而MDA含量顯著下降(P<0.05);濃度≥280 mmol·L-1時(shí)的氮引發(fā)時(shí)則相反。濃度為140 mmol·L-1的NH4NO3溶液引發(fā)6 h時(shí),白羊草種子的抗氧化性能最好,而濃度為1 120 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)則最弱。因此,140 mmol·L-1的NH4NO3溶液引發(fā)6 h是提高白羊草種子抗氧化性能的最佳處理,可能會(huì)有利于白羊草種子的萌發(fā)及生長(zhǎng)發(fā)育。