梁展瑋,彭 濤,胡亞琳,屈子裕,路 欣,焦學(xué)詩(shī)瑪,王一楠,俞曉平

(1.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018;2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,北京 100029;3.長(zhǎng)春市計(jì)量檢定測(cè)試技術(shù)研究院,吉林 長(zhǎng)春 130012)

肺癌號(hào)稱“第一癌癥殺手”,分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩大類,具有隱匿性強(qiáng)、惡化程度高、預(yù)后差等特點(diǎn),是目前全球死亡率最高的惡性腫瘤疾病。血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)具有取樣方便、檢測(cè)快捷、創(chuàng)傷小等特點(diǎn),在惡性腫瘤診斷和預(yù)后等方面應(yīng)用廣泛。臨床檢驗(yàn)與研究中,常用的肺癌血清標(biāo)志物包括癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、糖類抗原125(CA-125)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)。其中,NSE是目前診斷小細(xì)胞肺癌最可靠的血清腫瘤標(biāo)志物,同時(shí)在肺癌的發(fā)展監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷和療效評(píng)估等方面也具有重要的參考價(jià)值。

1 NSE的基本性質(zhì)

脊椎動(dòng)物體內(nèi)存在3種烯醇化酶亞基,包括主要存在于肝腎組織、肌肉組織、神經(jīng)組織的α亞基、β亞基和γ亞基,3種亞基以二聚體形式組成了5種不同的烯醇化酶同工酶。其中,特異性存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中的αγ、γγ型同工酶為神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)[1]。

NSE是一種蛋白質(zhì)大分子物質(zhì),具有相對(duì)分子質(zhì)量(約78 000 u)、酸性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、催化活性及在正常人體液中含量極低等特點(diǎn)[2-3]。它是一種“金屬活化的金屬酶(輔因子為Mg2+)”[4],能夠在糖酵解途徑中催化2-磷酸-D-甘油酸(PGA)脫水為磷酸烯醇丙酮酸(PEP),以及催化糖異生中PEP水合為PGA。糖酵解可以為神經(jīng)元提供足夠的能量以維持神經(jīng)元代謝,因此NSE幾乎存在于所有類型的神經(jīng)元中[5]。

NSE是神經(jīng)元、外周神經(jīng)內(nèi)分泌組織、胺前體攝取和脫羧細(xì)胞的高度特異性標(biāo)志物,體液和組織中NSE水平升高可能伴隨這些組織的惡性增殖。雖然NSE作為一種通用的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物并不能區(qū)分不同亞型的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NETs),但其升高與腫瘤分化不良有關(guān)[6-9]。NSE是目前診斷小細(xì)胞肺癌(SCLC)的首選腫瘤標(biāo)志物,75%的SCLC患者伴有NSE水平升高[10],NSE在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[11]、NET[12]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[13]、腎細(xì)胞癌[14]等腫瘤病理?xiàng)l件下也有表達(dá)(表1)。此外,NSE已被證明可作為腦損傷的潛在候選生物標(biāo)志物,例如腦缺血[15-16]、腦出血[17]、癲癇發(fā)作[18]、心肺后昏迷患者心臟驟停[19-20]和創(chuàng)傷性腦損傷的恢復(fù)[21-23]等。因此,準(zhǔn)確定量檢測(cè)體液中NSE水平,對(duì)肺癌等疾病的臨床診斷、發(fā)展程度和治療效果有重要意義。

表1 與NSE相關(guān)的疾病

2 NSE的檢測(cè)方法

NSE的體外檢測(cè)主要有3種方式:1)依賴NSE部分肽段結(jié)構(gòu)特征的質(zhì)譜分析方法[24-27];2)依賴于NSE本身烯醇化酶活性的酶活性測(cè)量方法[28];3)依賴于NSE識(shí)別位點(diǎn)的配體測(cè)定方法。對(duì)于NSE而言,質(zhì)譜檢測(cè)方法雖然準(zhǔn)確度和靈敏度高,但受限于復(fù)雜的樣本前處理過程和對(duì)大型設(shè)備的需要,難以滿足高通量、高效率檢測(cè)的要求。而酶活性測(cè)量方法的特異性較差,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度不高。然而依賴于配體特異性結(jié)合的檢測(cè)方法卻是目前NSE常用的臨床檢驗(yàn)技術(shù),該類方法中的配體主要包括抗體、分子印跡聚合物、核酸適配體。

2.1 基于抗體的免疫檢測(cè)方法

使用抗原-抗體反應(yīng)原理的免疫檢測(cè)方法因具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、成本低、易于推廣等優(yōu)點(diǎn),是臨床檢驗(yàn)中蛋白質(zhì)分析的首選方法[29]。然而免疫分析法存在穩(wěn)定性差、靈敏度相對(duì)較低、假陽(yáng)性率高等問題。NSE和NSE前體NNE之間基本沒有免疫交叉反應(yīng)性[30],可以減少交叉反應(yīng)引起的假陽(yáng)性結(jié)果?；诳贵w的免疫方法檢測(cè)NSE主要有“三明治”夾心模式與競(jìng)爭(zhēng)模式兩種形式。

2.1.1 放射免疫測(cè)定法(RIA)

RIA是臨床檢測(cè)NSE最早使用的免疫測(cè)定技術(shù),其基本原理是:將放射性元素標(biāo)記抗原/抗體作為檢測(cè)探針,采用夾心模式或競(jìng)爭(zhēng)模式,通過測(cè)量探針上放射性元素的放射強(qiáng)度,實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中NSE的定量檢測(cè)?；?H放射性元素標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)模式RIA可以在總體積為0.55 mL加標(biāo)血清中檢出1 ng至100 ng的NSE[31]。將具有更強(qiáng)放射性的125I作為標(biāo)記元素,能夠有效提高RIA檢測(cè)NSE的靈敏度[32-33]。雖然RIA具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn),但使用放射性同位素易造成放射線輻射和污染等問題,應(yīng)用發(fā)展受到限制。

2.1.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)

1972年Engvall和Perlmann[34]首次建立了ELISA,極大地簡(jiǎn)化了免疫測(cè)定程序,迅速成為臨床檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。用于NSE檢測(cè)的ELISA包括直接法和夾心法。Aghajanian G[35]開發(fā)了直接法ELISA,用堿性磷酸酶標(biāo)記的NSE抗體直接特異性識(shí)別NSE,通過直接測(cè)量酶標(biāo)抗體催化底物產(chǎn)生的信號(hào)實(shí)現(xiàn)檢測(cè),但該方法準(zhǔn)確度和靈敏度不高?；趭A心模式的ELISA經(jīng)過抗體固定—抗原捕獲—雜質(zhì)洗滌—檢測(cè)抗體識(shí)別—洗滌—酶標(biāo)抗體結(jié)合等步驟,在酶標(biāo)板上形成“抗體-NSE-抗體-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物,最后通過測(cè)量酶標(biāo)抗體催化底物產(chǎn)生的信號(hào)實(shí)現(xiàn)NSE檢測(cè),抗體特異性的捕獲與識(shí)別以及干擾物的去除,大大提高了NSE檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度[36],可用于復(fù)雜基質(zhì)分析。Abcam公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒(貨號(hào)ab233626)可以在90 min內(nèi)檢出50.8 pg/mL的NSE。然而,ELISA方法操作繁瑣且耗時(shí)。

2.1.3 電化學(xué)免疫傳感器

圖1 電化學(xué)免疫傳感器示意圖Figure 1 Schematic diagram of electrochemical immunosensors

在電化學(xué)免疫傳感器中,免標(biāo)記電化學(xué)傳感器具有結(jié)構(gòu)和檢測(cè)步驟更簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間更短等優(yōu)點(diǎn)。光電化學(xué)(PEC)傳感器是一種常見的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器,有光電轉(zhuǎn)換能力的電極產(chǎn)生光電流,當(dāng)NSE被電極上的抗體特異性結(jié)合后,電極的阻抗變大,光電流減弱,光電流的變化與NSE質(zhì)量濃度相關(guān)。Soomro等[42]以抗體修飾鎢酸鎳電極,尿酸作電子供體,構(gòu)建了PEC免疫傳感器,光電流反應(yīng)隨著NSE的質(zhì)量濃度增加而逐漸減弱,在最佳條件下的檢出限為120 pg/mL。Liu等[43]構(gòu)建了基于金納米星-二硫化鉬復(fù)合納米材料的PEC免疫傳感器檢測(cè)NSE,其檢出限可低至3.5 pg/mL。

但PEC傳感器的靈敏度受光電流大小的限制,直接的電化學(xué)阻抗譜測(cè)量可以提高其靈敏度。Zhang等[44]將氧化石墨烯和苯胺通過電化學(xué)共沉積到多孔金電極上,構(gòu)建了一種免標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器用于NSE檢測(cè),其檢出限可低至0.1 pg/mL,這種使用貴金屬改性電極的方法提高了檢測(cè)靈敏度,但同時(shí)也提高了制造成本。因此,Aydin等[45]開發(fā)了一種基于環(huán)氧取代聚吡咯聚合物涂層一次性錫-銦氧化物電極的低成本免標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器如圖1(b),通過阻抗測(cè)量來(lái)反映NSE質(zhì)量濃度,在最佳條件下的檢出限為6.1 fg/mL,且每次檢測(cè)成本僅$0.05,遠(yuǎn)低于ELISA方法的$5.42。

電化學(xué)免疫傳感器在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方面已取得了很大進(jìn)展,但高阻抗的抗原、抗體、阻斷劑等非目標(biāo)物可能會(huì)在電極表面產(chǎn)生絕緣層,阻礙電子轉(zhuǎn)移而降低信號(hào)響應(yīng),在一定程度上會(huì)限制其分析性能。

2.1.4 熒光免疫層析方法

熒光免疫層析方法是將特異性免疫學(xué)反應(yīng)和高靈敏熒光技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種快速檢測(cè)技術(shù),在臨床診斷和基礎(chǔ)研究中具有重要作用。其基本原理是:將含有NSE的樣品滴加到樣品墊上,NSE與熒光檢測(cè)探針形成復(fù)合物繼續(xù)在NC膜上層析,被檢測(cè)線上的抗體捕獲并聚集形成熒光信號(hào)[46],NSE質(zhì)量濃度與熒光信號(hào)呈正相關(guān)。近年來(lái),有機(jī)熒光染料[47]、熒光微球[48]、半導(dǎo)體量子點(diǎn)[49]等熒光材料的應(yīng)用,豐富了熒光免疫層析方法體系,同時(shí)也提高了檢測(cè)靈敏度。Xiao等[49]以量子點(diǎn)為標(biāo)記材料制備檢測(cè)探針,開發(fā)了一種能在15 min內(nèi)同時(shí)定量檢測(cè)NSE和癌胚抗原(CEA)的熒光免疫層析方法,檢測(cè)的質(zhì)量濃度為5～50 ng/mL,檢測(cè)NSE的檢出限為42.6 pg/mL。相較于熒光ELISA方法[50],熒光免疫層析方法將捕獲抗體和探針整合在同一體系中,復(fù)雜的洗滌、加樣等步驟也被NC膜上的層析作用所取代,因此具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn),能夠?qū)崿F(xiàn)NSE的即時(shí)檢測(cè)。然而,免疫層析法存在較大的批內(nèi)差和批間差;此外,熒光信號(hào)需要紫外光源來(lái)激發(fā)獲取,增加了檢測(cè)的成本和復(fù)雜度。

2.1.5 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

化學(xué)發(fā)光免疫分析方法是將高靈敏化學(xué)發(fā)光技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種新型免疫分析方法,其發(fā)光能量來(lái)自化學(xué)反應(yīng)。Mao等[51]用堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記抗NSE抗體作檢測(cè)探針,成功構(gòu)建了夾心模式的化學(xué)發(fā)光免疫傳感器,當(dāng)樣品中存在NSE時(shí),形成“探針-NSE-捕獲抗體”免疫復(fù)合物,經(jīng)洗滌加入發(fā)光底物,在ALP的催化作用下迅速發(fā)光如圖2(a),其檢出限為44 pg/mL,完成檢測(cè)需要至少200 min。該方法易于擴(kuò)展實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè),用于臨床血清樣品的大規(guī)模篩選,但較繁瑣的操作過程和較長(zhǎng)的分析時(shí)間限制了其廣泛應(yīng)用。

圖2 化學(xué)發(fā)光免疫傳感器示意圖Figure 2 Chemiluminescence immunosensors for NSE detection

提高ECL免疫分析方法靈敏度的方式包括:1)更強(qiáng)發(fā)光體系的引入,Yang等[53]在沉積有高電活材料Ti3C2Tx/TiO2的玻碳電極上修飾捕獲抗體,在修飾有雙(2-苯基吡啶)(乙酰丙酮)銥(III)的聚乙二醇化脫鐵蛋白上包被抗體組裝成發(fā)光探針,成功構(gòu)建了ECL免疫傳感器如圖2(b),在最佳條件下,NSE的檢出限可低至35 fg/mL;2)生物酶催化,Aydin等[54]成功建立了基于酶促生物催化沉淀(BCP)的發(fā)光阻遏ECL傳感器,檢測(cè)NSE時(shí),電極上的HRP催化底物4-氯-1-萘酚被H2O2氧化產(chǎn)生不溶性沉淀物,形成不導(dǎo)電的不溶性層,從而有效地阻礙共反應(yīng)物的界面質(zhì)量和電子轉(zhuǎn)移,使電極上的ECL信號(hào)減弱,該方法檢測(cè)NSE的檢出限為6.1 fg/mL;3)加大ECL傳感器的比表面積,Zhang等[55]在高比表面積的銀-半胱氨酸納米線上固定捕獲抗體,將檢測(cè)抗體與還原氧化石墨烯-氮摻雜碳量子點(diǎn)復(fù)合材料偶聯(lián)制備檢測(cè)探針,建立的ECL傳感器檢測(cè)NSE的檢出限能低至0.18 fg/mL。

2.1.6 表面增強(qiáng)拉曼光譜免疫分析方法

SERS(surface-enhanced Raman sepectroscops)免疫傳感器是以拉曼散射和免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)發(fā)展的一種技術(shù)方法,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分辨率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。Wang等[56]建立了基于尼羅藍(lán)修飾的納米金球SERS免疫傳感器如圖3,檢測(cè)NSE的檢出限為100 pg/mL,但檢測(cè)時(shí)間需要2 h且操作繁瑣。Song等[57]將免疫層析技術(shù)與SERS結(jié)合,成功建立了基于免疫層析原理的SERS免疫傳感器,由于背景干擾極低,檢測(cè)信噪比高,可在10 min內(nèi)檢測(cè)到低至0.01 pg/mL的NSE。此外,隨著便攜式SERS光譜儀[58]的開發(fā)與應(yīng)用,使SERS免疫傳感器兼具有便攜、經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點(diǎn)。

圖3 檢測(cè)NSE的SERS免疫傳感器[56]Figure 3 SERS immunosensors for NSE detection

2.1.7 光纖免疫傳感器

光纖免疫傳感器是將光纖探測(cè)與特異性免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種新興傳感技術(shù),它兼具光學(xué)探測(cè)和生物反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)[59]。Zhou等[60]開發(fā)了一種基于黑磷納米片的光纖生物傳感器,檢測(cè)NSE時(shí),樣品中的NSE被光纖表面的黑磷-抗體探針捕獲形成免疫復(fù)合物,格柵所反射的光將發(fā)生共振波長(zhǎng)偏移,光信號(hào)的波長(zhǎng)偏移與樣品中NSE質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)呈正相關(guān)。由于黑磷納米片獨(dú)特的光調(diào)制效應(yīng)和光纖的優(yōu)異光傳輸特點(diǎn),該方法在最佳條件下僅需35 min,檢出限可達(dá)1.0 pg/mL,定量檢測(cè)范圍為0.01～100 ng/mL。光纖免疫傳感器具有靈敏度高、抗磁干擾強(qiáng)、特異性好、體積小、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)[61],為NSE新型免疫傳感器的開發(fā)提供了新的思路。

2.2 基于分子印跡聚合物的免疫檢測(cè)方法

分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer, MIP)是通過功能單體圍繞模板聚合交聯(lián)成三維矩陣,模板去除后,形成具有目標(biāo)分子特定形狀的空腔聚合物。MIP表面具有與目標(biāo)分子互補(bǔ)的化學(xué)功能,能特異性識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)分子[62]。與抗體分子相比,MIP具有廉價(jià)、易于獲得、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)[63-64],有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體作為生物識(shí)別元件用于檢測(cè)方法的建立。根據(jù)模板類型的不同,通常將MIP分為全蛋白印跡的MIP和表位印跡的MIP。

利用全蛋白印跡的MIP擁有多個(gè)“立體”識(shí)別位點(diǎn),可以提供對(duì)目標(biāo)物更強(qiáng)親和力和特異性。Wang等[65]采用模板輔助電化學(xué)沉積技術(shù),成功開發(fā)了基于全蛋白MIP的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器,能檢測(cè)低至2.6 pg/mL的NSE,定量范圍為0.01～1.0 ng/mL,檢測(cè)時(shí)間少于15 min。在全蛋白MIP的合成過程中,完整的NSE蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度有限,從而極大地限制了MIP上“模板空腔”的數(shù)量,所以當(dāng)含有較高質(zhì)量濃度的NSE時(shí),傳感器上的MIP空腔會(huì)迅速飽和,導(dǎo)致檢測(cè)范圍較窄。

表位印跡的MIP是印跡短肽序列,形成特定空腔充當(dāng)抗體作為識(shí)別位點(diǎn)[66]。制備表位印跡MIP使用短肽作模板,大大降低了成本,而且短肽序列在有機(jī)溶劑中有良好的溶解度,從而有效增加了靶標(biāo)蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。因此,表位印跡的MIP擁有針對(duì)同一抗原的多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)[67],有利于低豐度蛋白質(zhì)的靈敏檢測(cè)。Xing等[68]成功構(gòu)建了表位分子印跡拉曼光學(xué)傳感器,能在15 min內(nèi)完成NSE的檢測(cè),定量范圍為100 pg/mL至10 μg/mL,檢出限為10 pg/mL。

目前,MIP作為識(shí)別蛋白質(zhì)的配體還存在以下問題:1)有機(jī)溶劑的使用導(dǎo)致模板分子變性而使印跡效率低;2)功能單體和模板分子之間的相互作用較弱,導(dǎo)致傳質(zhì)和印跡位點(diǎn)不足[69];3)結(jié)合動(dòng)力學(xué)較慢[70];4)印跡靶標(biāo)蛋白分子的去除難易程度與功能單體選擇相關(guān)[71]。因此,在一定程度上限制了MIP的應(yīng)用。

2.3 基于核酸適配體的檢測(cè)方法

核酸適配體(Aptamer)是短的單鏈RNA或DNA分子(大約12～80個(gè)核苷酸),它能夠通過改變其三維構(gòu)象以非共價(jià)相互作用與特定分析物以高親和力結(jié)合。核酸適配體可以通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)篩選獲得,與抗體相比,具有合成簡(jiǎn)單、成本低、穩(wěn)定性好、易功能化修飾等特點(diǎn),但其與目標(biāo)物的結(jié)合動(dòng)力學(xué)較慢[72]。目前基于核酸適配體的電化學(xué)傳感器[73]、化學(xué)發(fā)光分析方法[74]與表面等離子體共振(SPR)生物傳感器[75]已被設(shè)計(jì)并應(yīng)用,在NSE的檢測(cè)中顯示出良好的性能。盡管適配體具有許多優(yōu)勢(shì)、但是它本身血清穩(wěn)定性較差,這限制了其在臨床檢測(cè)上的應(yīng)用。因此,必須通過化學(xué)修飾或納米載體包裹等手段來(lái)保護(hù)適配體,使其能夠在復(fù)雜的生物環(huán)境中發(fā)揮作用。

3 結(jié)論與展望

NSE是目前診斷小細(xì)胞肺癌最可靠的血清腫瘤標(biāo)志物。目前,常見的檢測(cè)NSE的配體有抗體、MIP、核酸適配體,常用的NSE檢測(cè)方法有RIA、ELISA、化學(xué)發(fā)光法等,它們的檢測(cè)性能匯總于表2。然而,NSE檢測(cè)方法還存在一些問題和挑戰(zhàn),如標(biāo)準(zhǔn)化、敏感性、特異性、干擾因素等。目前尚無(wú)統(tǒng)一的金標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)檢測(cè)NSE。準(zhǔn)確快速、靈敏便攜、低成本是對(duì)NSE檢測(cè)方法開發(fā)的進(jìn)一步要求。

表2 基于配體的NSE檢測(cè)方法性能匯總

隨著生物、化學(xué)、材料等多學(xué)科交叉日益加深,NSE檢測(cè)方法也在不斷創(chuàng)新和進(jìn)步。此外,還需要加強(qiáng)對(duì)NSE檢測(cè)結(jié)果與臨床意義之間關(guān)系的研究,探索NSE在不同類型和階段的腫瘤中的變化規(guī)律和預(yù)后價(jià)值,并結(jié)合其他腫瘤標(biāo)志物或影像學(xué)檢查等手段進(jìn)行綜合評(píng)估。

未來(lái),NSE檢測(cè)方法可能會(huì)向以下幾個(gè)方向發(fā)展:通過微流控芯片達(dá)到對(duì)NSE高效、快速、靈敏、特異和低成本的分析。光學(xué)傳感器法:借助光學(xué)傳感器如表面等離子體共振設(shè)備[76]、光纖等實(shí)施對(duì)NSE無(wú)標(biāo)記、在線、實(shí)時(shí)和高通量地監(jiān)測(cè)。基于深度學(xué)習(xí)的目標(biāo)識(shí)別法:采用深度學(xué)習(xí)算法如R-CNN等對(duì)NSE檢測(cè)結(jié)果圖像或視頻中目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和定位。