楊娜 葉琴霞 魏卓 張漢堯

摘?要：紅陽獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis ‘Hongyang’）具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值，以及較好的市場(chǎng)開發(fā)前景。但近年紅陽獼猴桃產(chǎn)區(qū)如云南、四川等多地多次遭遇倒春寒等極端天氣，其抗寒性差的缺點(diǎn)限制了發(fā)展空間。該研究通過在組培的過程中使用甲基磺酸乙酯（EMS）誘導(dǎo)紅陽獼猴桃突變體，進(jìn)而篩選出耐寒突變體，并通過轉(zhuǎn)錄組分析探究其脅迫響應(yīng)機(jī)制。該研究以紅陽獼猴桃葉片為實(shí)驗(yàn)材料，在組培時(shí)（4.4 g·L-1 MS+4.5 g·L-1 瓊脂+1.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+15 g·L-1蔗糖+0.01～0.10 g·L-1 EMS）利用EMS誘導(dǎo)技術(shù)誘導(dǎo)突變體，并在低溫環(huán)境下篩選出耐寒突變體。選出的耐寒突變體和正常紅陽獼猴桃組培苗先進(jìn)行4 ℃ 12 h寒脅迫處理，再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。結(jié)果表明：（1）通過初步的表型鑒定，當(dāng)EMS處理濃度為0.06 g·L-1時(shí)誘導(dǎo)的部分突變體具有一定的耐寒性；（2）在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)GO功能富集分析中，富集條目最多的是生物學(xué)過程；（3）利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析時(shí)，共篩選到21個(gè)差異表達(dá)基因在15條通路中得到注釋且均為上調(diào)表達(dá)，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路（ath04141）中富集的差異表達(dá)基因最多，并且該通路內(nèi)的sHSF、Hsp70和NEF可能與耐寒機(jī)制調(diào)控有關(guān)。綜上研究結(jié)果為紅陽獼猴桃耐寒種質(zhì)資源的研究與利用提供了材料基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 獼猴桃， 甲基磺酸乙酯（EMS）， 耐寒突變體， 轉(zhuǎn)錄組， 熱激蛋白

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2023）09-1700-10

收稿日期：2022-07-10

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（32160556）。

第一作者： 楊娜（1999-），碩士研究生，主要從事遺傳育種研究，（E-mail）yangna1999@swfu.edu.cn。

*通信作者：張漢堯，教授，博士生導(dǎo)師，從事植物和微生物分子遺傳研究，（E-mail）zhanghanyao@swfu.edu.cn。

Screening and transcriptome analysis of EMS-induced

cold-tolerant mutants in Hongyang kiwifruit

YANG Na， YE Qinxia， WEI Zhuo， ZHANG Hanyao*

（ Key Laboratory of Forest Resources Conservation and Utilization of the Ministry of Education in

Southwest China， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China ）

Abstract：The Hongyang kiwifruit （Actinidia chinensis var. chinensis ‘Hongyang’） has high economic and nutritional values and good prospects for market development. However， in recent years Hongyang kiwifruit production areas such as Yunnan and Sichuan have been subjected to extreme weather such as inversions on several occasions， and its poor cold resistance has limited its scope for development. In this study， ethyl methanesulfonate （EMS） was used to induce mutants of Hongyang kiwifruit in a tissue culture process， which led to the screening of cold-tolerant mutants and the investigation of their stress response mechanisms through transcriptome analysis. In this study， mutants were induced using EMS induction technology using Hongyang kiwifruit leaves as experimental material in tissue culture （4.4 g·L-1 MS + 4.5 g·L-1 agar + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 15 g·L-1 sucrose + 0.01-0.10 g·L-1 EMS） and screened for cold-tolerant mutants under low temperature. Selected cold-tolerant mutants and normal Hongyang kiwifruit tissue culture seedlings were subjected to 4 ℃ 12 h cold stress treatment， while later， transcriptome sequencing analysis was performed. The results were as follows： （1） According to the preliminary phenotypic identification， some of the mutants induced by the 0.06 g·L-1 EMS were phenotypically resistant to cold; （2） In the GO functional enrichment analysis of transcriptome sequencing data， the most enriched entries were in the biological processes; （3） When using KEGG database analysis， a total of 21 differentially expressed genes （DEGs） were annotated in 15 pathways， and which were all up-regulated. The protein processing pathway （ath04141） in the endoplasmic reticulum had the most DEGs， and sHSF， Hsp70， and NEF in this pathway may be related to the regulation of cold-tolerantmechanisms. The above findings provide a material basis and theoretical rationale for the research and utilization of cold-tolerant germplasm resources of Hongyang kiwifruit.

Key words： kiwifruit， ethyl methanesulfonate （EMS）， cold-tolerant mutant， transcriptome， heat shock protein

紅陽獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis ‘Hongyang’）果心呈血紅色放射狀，味甜可口，含有較高的維生素C、維生素E、多種游離氨基酸及礦物質(zhì)成分，且含有獨(dú)特的花青素，是兼具保健及美容功能于一體的重要經(jīng)濟(jì)作物（張維等，2021）。紅陽獼猴桃屬于早熟型品種，對(duì)低溫尤為敏感（馬秋詩，2014）。紅陽獼猴桃對(duì)種植區(qū)環(huán)境要求較高，需要達(dá)到夏季無酷暑、冬季無嚴(yán)寒（黃永紅等，2016）。南方多省市近年日降溫幅度都超過10 ℃，不斷刷新歷史氣溫最低值，這些氣候變化導(dǎo)致溫度驟降，對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生一定影響，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致獼猴桃樹體直接凍死（李化龍等，2021）。隨著紅陽獼猴桃生產(chǎn)的迅速發(fā)展和種植面積的不斷擴(kuò)大，氣候的異常變化嚴(yán)重制約其發(fā)展，低溫脅迫成為影響其生長(zhǎng)、果實(shí)質(zhì)量和產(chǎn)量的主要因素之一。因此，培育出耐寒性強(qiáng)的紅陽獼猴桃種質(zhì)資源已成為生產(chǎn)中的重要研究?jī)?nèi)容之一。

近年來，耐寒誘變育種已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于各個(gè)植物遺傳育種中的抗寒品種選育中，技術(shù)也趨于成熟（陳祥韋，2017）。其中，甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate， EMS）是目前世界上公認(rèn)最有效的用于抗性品種選育的化學(xué)誘變劑之一，其具有使用方便、特殊性較好、誘變所產(chǎn)生的后代遺傳性狀比其他誘變育種的后代更穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)（王元東等，1999；彭波等，2007）。王小華等（2010）對(duì)柱花草愈傷組織進(jìn)行化學(xué)誘變處理，并通過篩選抗寒突變體選育出優(yōu)良種質(zhì)資源。陳祥韋（2017）利用EMS誘變技術(shù)處理海雀稗愈傷組織，并對(duì)再生植株進(jìn)行耐寒性鑒定，進(jìn)而篩選出耐寒材料獲得海雀稗耐寒突變體。曹冠男（2018）篩選出EMS誘變小麥的最適處理組合，在所構(gòu)建的突變?nèi)后w中篩選出豐富的表型變異。孫慧（2019）以海濱木槿為材料，利用不同濃度EMS進(jìn)行誘變處理，選擇合適的誘變濃度和時(shí)間，通過對(duì)后期幼苗變異表型的觀察、生理指標(biāo)的測(cè)定以及亞顯微結(jié)構(gòu)的比較進(jìn)行抗寒性的篩選與鑒定，獲得了海濱木槿抗寒新品種。胡松梅等（2019）在設(shè)置0 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)經(jīng)EMS誘導(dǎo)后的鐵皮石斛突變體，篩選出20株耐寒能力較高的突變體。

植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究是基于RNA水平對(duì)某一特定植物器官或組織在某種特定條件下進(jìn)行其細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、調(diào)控后表達(dá)的研究，是目前研究基因組水平變化最直接和最常用的方式（崔凱等，2019）。周鶴瑩（2020）利用冬棗和金絲小棗冷凍脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析差異表達(dá)基因，揭示了ZJDREB1和ZJSOD1在提高棗抗凍過程中的作用。楊寧等（2020）利用EMS誘導(dǎo)技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，對(duì)矮化性狀及其調(diào)控的相關(guān)基因進(jìn)行了一系列分析。如今，RNA測(cè)序方法已成為分子生物學(xué)研究植物抗性功能的重要手段，達(dá)到商業(yè)化水平并廣泛應(yīng)用于我國相關(guān)農(nóng)林業(yè)的研究中，但采用EMS誘導(dǎo)技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)相結(jié)合運(yùn)用到獼猴桃中還鮮有報(bào)道。

紅陽獼猴桃營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，但抗寒性差限制了其發(fā)展空間，因此通過EMS誘變及篩選，選育出紅陽獼猴桃耐寒種質(zhì)資源，有利于紅陽獼猴桃種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。中華獼猴桃基因組序列的公布使得深入研究紅陽獼猴桃耐寒生物學(xué)成為可能?；谝阎蚪M序列基礎(chǔ)上的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在基因的挖掘及表達(dá)調(diào)控方面具有強(qiáng)大的功能，也是研究獼猴桃生長(zhǎng)發(fā)育及優(yōu)良性狀形成過程中相關(guān)基因科學(xué)高效的方法。為解決當(dāng)前紅陽獼猴桃抗寒性差，及相關(guān)抗寒相關(guān)機(jī)理不清的問題，本研究擬在組織培養(yǎng)過程中的低溫環(huán)境下篩選出紅陽耐寒突變體并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組水平分析，為選育紅心獼猴桃優(yōu)良種質(zhì)資源及研究耐寒機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究采用西南林業(yè)大學(xué)溫室大棚種植的紅陽獼猴桃植株健康葉片為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織培養(yǎng)體系建立?按照師萬源等（2021）的方法取紅陽獼猴桃幼嫩葉片作為外植體，經(jīng)流水沖洗30 min，于超凈工作臺(tái)內(nèi)用75% C2H5OH 消毒20 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒5 min。葉片切成約1 cm × 1 cm的大小放到4.4 g·L-1 MS + 4.5 g·L-1瓊脂 + 15 g·L-1蔗糖 + 2.0 mg·L-1 TDZ + 0.5 g·L-1 IBA培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，每瓶放置3～4片切好的葉片。待愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽時(shí)培養(yǎng)基更換為4.4 g·L-1 MS + 4.5 g·L-1 瓊脂 + 15 g·L-1蔗糖 + 0.3 mg·L-1 NAA + 3.0 mg·L-1 6-BA。

1.2.2 EMS誘導(dǎo)與篩選體系建立?突變體誘導(dǎo)時(shí)將EMS溶液經(jīng)0.22 μm的過濾器抽濾滅菌，過濾滅菌后將EMS加入高溫滅菌后的培養(yǎng)基（4.4 g·L-1 MS+4.5 g·L-1 瓊脂+1.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1 NAA+15 g·L-1 蔗糖）中，EMS培養(yǎng)基配制成0.01～0.10 g·L-1誘變濃度，并以不含EMS的培養(yǎng)基為對(duì)照組。每個(gè)處理分別接種45瓶，接種后將全部培養(yǎng)瓶放置于光照強(qiáng)度2 000 lx、培養(yǎng)溫度（26 ± 1） ℃、日照15 h的培養(yǎng)室內(nèi)，觀察并記錄統(tǒng)計(jì)外植體存活率，以及篩選出50%半致死劑量（LD50）。將EMS誘變的紅陽獼猴桃植株與未經(jīng)誘變植株放在4 ℃冰箱中處理12 h，取出后開始觀察其生長(zhǎng)狀況及進(jìn)行形態(tài)鑒定，初步篩選出耐寒突變植株。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

設(shè)置對(duì)照組A1、A2、A3 3瓶正常紅陽獼猴桃植株組培苗和實(shí)驗(yàn)組B1、B2、B3 3瓶紅陽獼猴桃耐寒突變植株組培苗經(jīng)過4 ℃下12 h寒脅迫處理，對(duì)其進(jìn)行取樣并用錫箔紙包裝并標(biāo)號(hào)，將6個(gè)樣品寄達(dá)陜西博瑞德公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理?根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料的基因信息和參考基因組，按照過濾標(biāo)準(zhǔn)過濾原始轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列（質(zhì)量≤20的堿基數(shù)占整個(gè)Reads的50%以上的低質(zhì)量Reads）、雜質(zhì)和接頭。

1.3.2 參考基因組序列對(duì)比?將RNA-?Seq測(cè)序所得Clean reads與其參考基因組序列進(jìn)行序列對(duì)比，得到Reads定位信息。通過對(duì)比可以得到測(cè)序數(shù)據(jù)利用率及測(cè)序樣品與參考基因組親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

1.3.3 基因表達(dá)量分析及差異表達(dá)基因檢測(cè)?通過bowtie2工具將獲得的Clean reads與參考轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行對(duì)比，并統(tǒng)計(jì)基因?qū)Ρ嚷?。使用RSME分析統(tǒng)計(jì)對(duì)比結(jié)果，獲得每個(gè)樣注釋到參考轉(zhuǎn)錄組序列的Reads數(shù)目，并計(jì)算其FPKM值，計(jì)算Fragment統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)錄并通過FDR檢驗(yàn)差異表達(dá)基因P value數(shù)值，并檢驗(yàn)校正P value閾值。差異檢驗(yàn)的FDR值越小，其差異倍數(shù)越大，所表達(dá)差異越顯著。

1.3.4 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析?GO （Gene Ontology）富集分析按照國際標(biāo)準(zhǔn)分類分為3大類，即生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能。把差異表達(dá)基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫中，將FDR值≤0.05的差異表達(dá)基因作為顯著富集的基因本位條目。

1.3.5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析?KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是關(guān)于Pathway的公共基因庫，其全稱為京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫，KEGG主要包括KEGG Pathway、KEGG基因、KEGG基因組、KEGG反應(yīng)過程等分類。Pathway富集分析是以KEGG途徑為單位，將差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋分類，并運(yùn)用超幾何檢驗(yàn)，使用R語言進(jìn)行富集分析及P value矯正。

1.4 數(shù)據(jù)處理

生理指標(biāo)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比較分析，差異表達(dá)基因表達(dá)量使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2?結(jié)果與分析

2.1 EMS誘導(dǎo)體系

2.1.1 不同EMS 處理對(duì)紅陽獼猴桃愈傷組織死亡率的影晌?紅陽獼猴桃葉片經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)后，對(duì)其進(jìn)行不同濃度10個(gè)梯度EMS培養(yǎng)，并設(shè)置未添加EMS培養(yǎng)基作為對(duì)照組。由表1可知，EMS對(duì)紅陽獼猴桃生長(zhǎng)的抑制作用隨EMS濃度增加而增強(qiáng)。當(dāng) EMS濃度為 0.06 g·L-1時(shí)，死亡率為51.1%，與50%半致死率最為接近，作為L(zhǎng)D50進(jìn)行下一步誘變?cè)囼?yàn)。

2.1.2 突變結(jié)果分析?紅陽獼猴桃葉部的突變：將EMS共培養(yǎng)后存活的紅陽獼猴桃愈傷組織培養(yǎng)30 d，選取不同類型的突變性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。在葉片中觀察到，與CK（圖1：A）相比，突變類型有葉形、葉柄、葉色、葉緣和被毛共5種突變，具體見圖1。

紅陽獼猴桃株形突變：經(jīng)EMS處理后的紅陽獼猴桃的生長(zhǎng)能力與對(duì)照組相比較弱，表現(xiàn)在株高較矮、葉片發(fā)黃等方面。由圖2可知，EMS紅陽獼猴桃株型突變主要有株高變矮突變、株型稀疏突變、株型緊湊突變和株型松散突變。株高變矮突變植物生長(zhǎng)過程較緩慢，葉片顏色較正常植株葉片顏色綠（圖2：J）；株型稀疏突變和松散突變植株株型較為松散，葉片數(shù)量有所減少（圖2：K，M）；株型緊湊突變植株葉片呈包裹狀，無法伸展開來，葉片數(shù)量較多（圖2：L）。

2.1.3 紅陽獼猴桃耐寒突變體篩選及鑒定?將3瓶EMS誘變的紅陽獼猴桃植株與3瓶未經(jīng)誘變植株放在4 ℃冰箱中處理12 h后取出。培養(yǎng)7 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)紅陽獼猴桃突變體葉片與對(duì)照組葉片相比，紅陽獼猴桃突變體葉片仍能保持綠色，對(duì)照組葉片邊緣部分出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，具體見圖3：N。

經(jīng)15 d后，3瓶EMS誘變的紅陽獼猴桃植株（表2序號(hào)1、2、3）葉片有部分復(fù)綠，有新芽長(zhǎng)出，而未經(jīng)誘變處理植株（表2序號(hào)4、5、6）枯萎死亡，無新芽長(zhǎng)出，具體見圖3：O和表2，由此可推測(cè)經(jīng)EMS誘變的部分紅陽獼猴桃植株獲得了一定的耐寒性。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理?為了保證能夠有效保證數(shù)據(jù)分析的信息準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)質(zhì)量及其數(shù)據(jù)可靠性，需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。由表3可知，共獲得43.27 G的Clean bases，其中6個(gè)樣品的Q20和Q30 的堿基在Clean data中所占的百分比均超過94%，Clean reads中G與C各項(xiàng)堿基之間的百分比均在46%～47%之間；6個(gè)樣品均未檢測(cè)到未知堿基。綜合分析證明測(cè)序質(zhì)量良好，符合建庫要求，可進(jìn)行下一步分析。

2.2.2 差異表達(dá)基因的篩選?同一生物在不同環(huán)境條件下其基因表達(dá)存在顯著差異。由圖4可知，結(jié)果共篩選出294條差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因?yàn)?54條，占比為86.4%，下調(diào)差異表達(dá)基因?yàn)?0條，僅占比13.65%。由此可見，低溫脅迫12 h內(nèi)有大量的冷脅迫響應(yīng)基因被成功激活，而一部分基因則受到抑制。

2.2.3 GO功能分析?對(duì)紅陽獼猴桃處理組與對(duì)照組進(jìn)行GO功能性的分類以及豐富性的分析。GO功能分析主要?jiǎng)澐譃樯飳W(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成3個(gè)方面。GO功能富集以顯著性值<0.05作為顯著性富集的閾值，結(jié)果見圖5。從GO富集的數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，生物學(xué)過程部分富集127個(gè)功能分類，分子功能部分為104個(gè)功能分類，細(xì)胞組成部分共富集19個(gè)功能分類，3個(gè)方面的差異表達(dá)基因分別為104條、135條、25條，共264條。其中生物學(xué)過程部分富集功能分類最多，位于前五的富集差異表達(dá)基因序列條目為多細(xì)胞類生物發(fā)育、發(fā)展過程、解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的發(fā)展、胞吐作用、細(xì)胞分泌作用；其次是分子功能部分，位于前五的富集差異表達(dá)基因序列條目為活性血紅素酶的結(jié)合機(jī)理作用示例、四吡咯酶的結(jié)合機(jī)理作用、 轉(zhuǎn)移氧化酶活性作用、 氧化酶的還原酶活性、鐵離子的氧化結(jié)合機(jī)理作用；富集條目最少的是細(xì)胞組成部分。這些富集差異表達(dá)基因的條目均可能與紅陽獼猴桃突變體耐寒性相關(guān)。

2.2.4 差異表達(dá)基因Pathway功能分析?進(jìn)行KEGG生物通路分類及富集分析可以確定差異表達(dá)基因主要參與的信號(hào)傳導(dǎo)及生化代謝途徑。本研究以P<0.05作為顯著性富集的閾值，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)紅陽獼猴桃兩個(gè)處理組合中的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物通路分析，結(jié)果見圖6。21個(gè)差異表達(dá)基因在KEGG通路中得到注釋，共富集到15條通路中，且都為上調(diào)差異表達(dá)基因。其中呈極顯著富集（P＜0.01）的通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工，共富集9條差異表達(dá)基因，呈顯著富集（P＜0.05）的通路是硫代謝和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，分別富集2個(gè)和3個(gè)差異表達(dá)基因；其次為MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑—植物，共富集2個(gè)差異表達(dá)基因；只富集1個(gè)差異表達(dá)基因的通路為色氨酸代謝、2-氧代羧酸代謝、甘油酯代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、RNA降解、mRNA監(jiān)測(cè)途徑、胞吞作用、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、剪接體、碳代謝和氨基酸的生物合成。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路呈極顯著富集，推測(cè)其富集的差異表達(dá)基因與耐寒性相關(guān)性較高。

2.2.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路分析?在紅陽獼猴桃突變體與對(duì)照組應(yīng)答冷脅迫中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路中差異表達(dá)基因富集最多，這9個(gè)基因全部富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（endoplasmic reticulum associated degradation， ERAD）過程中且均為上調(diào)表達(dá)。通路富集差異表達(dá)基因表達(dá)量見表4，其中與植物溫度脅迫相關(guān)的熱激轉(zhuǎn)錄因子（small Heat Shock Factor，sHSF）富集了7個(gè)差異表達(dá)基因，其表達(dá)量最高增加了25.65倍，顯著高于未誘導(dǎo)耐寒突變體的對(duì)照組（P<0.05）；與蛋白質(zhì)聚合有關(guān)的熱激蛋白70B（Heat shock protein 70，Hsp70）富集了1個(gè)差異表達(dá)基因，其表達(dá)量高于未誘導(dǎo)處理的3.8倍，差異達(dá)顯著水平（P<0.05）；Hsp70互作蛋白（NEF）富集了1個(gè)差異表達(dá)基因，其表達(dá)量高于未誘導(dǎo)處理的1.86倍，差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。

3?討論

由于溫室氣體排放等原因，近年地球氣候變化加劇，植物受到高溫、低溫脅迫的情形更加普遍。低溫脅迫通常會(huì)致使植物細(xì)胞酶活性的降低、膜系統(tǒng)的破壞和細(xì)胞的失水等，進(jìn)而導(dǎo)致其細(xì)胞代謝紊亂，甚至是細(xì)胞死亡，對(duì)作物的產(chǎn)量乃至其生存造成重大影響。因此，選育抗寒或耐寒品種及進(jìn)行耐寒機(jī)理研究成了當(dāng)今研究的熱點(diǎn)（孫慧，2019；胡松梅等，2019；周鶴瑩，2020）。近年來在選育優(yōu)良品種的過程中，使用植物組織培養(yǎng)與誘變技術(shù)相結(jié)合的離體誘變技術(shù)開始逐漸受到人們的關(guān)注（王小華等，2010；陳祥韋，2017；胡松梅等，2019）。本研究利用EMS誘變劑處理紅陽獼猴桃愈傷組織，發(fā)現(xiàn)EMS誘變劑處理可加大植物變異范圍，豐富種質(zhì)資源，通過篩選也獲得了耐寒突變體，這與前人的研究結(jié)果一致（陳祥韋，2017；孫慧，2019）。

此外，本研究對(duì)紅陽獼猴桃愈傷組織進(jìn)行不同濃度梯度的EMS誘變時(shí)，觀察到部分突變體的生長(zhǎng)能力比對(duì)照組弱，主要表現(xiàn)在株高較矮、葉片發(fā)黃等方面。這可能是由于EMS是非定向誘變劑所致。突變可分為有害突變、有利突變和中性突變，本研究中觀察到部分突變體的生長(zhǎng)能力變?nèi)?，?yīng)是有害突變。本研究將EMS誘變的紅陽獼猴桃植株與未經(jīng)誘變植株進(jìn)行寒脅迫處理，結(jié)果表明EMS誘變的部分紅陽獼猴桃植株葉片有新芽長(zhǎng)出，而對(duì)照植株全部枯萎死亡，說明部分經(jīng)EMS誘變的紅陽獼猴桃突變植株具有一定的抗寒性，這應(yīng)是有利突變。這也進(jìn)一步證實(shí)了EMS誘導(dǎo)的突變是不定向的，有可能導(dǎo)致有害突變，也可以導(dǎo)致有利突變，要得到有用的突變，關(guān)鍵在于篩選。

當(dāng)植物在遭受寒冷脅迫時(shí)，低溫會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，同時(shí)生物大分子也會(huì)受到破壞（張健等，2020）。如在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，蛋白質(zhì)可以通過內(nèi)腔伴侶發(fā)生折疊，正確折疊后，蛋白質(zhì)經(jīng)過包裝后進(jìn)入運(yùn)輸小泡，然后運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中，而在脅迫下發(fā)生錯(cuò)誤折疊后，蛋白質(zhì)和分子伴侶作用使之在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)保留下來（Meusser et al.， 2005；李瑞，2015）。隨后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的“分子伴侶”重鏈結(jié)合蛋白（Bip）和錯(cuò)誤折疊后的蛋白質(zhì)相結(jié)合，并在ERAD過程中的蛋白酶體發(fā)生降解（Mccracken & Brodsky， 2010）。在本研究的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工通路中，獼猴桃植株在受到冷脅迫后，差異基因在ERAD過程呈上調(diào)狀態(tài)，則可能說明該植物分解末端錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)功能增強(qiáng)，壓力擾亂蛋白質(zhì)折疊，從而導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或聚集蛋白質(zhì)的超積累，這種被破壞的蛋白質(zhì)沉積導(dǎo)致?lián)p害細(xì)胞組成的蛋白毒性應(yīng)激，因此生物體必須重新折疊或移除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)才能維持健康生長(zhǎng)（Izumi， 2019）。已知，sHSF最初在高溫響應(yīng)中被發(fā)現(xiàn)，參與應(yīng)激反應(yīng)和“記憶”，而現(xiàn)在普遍認(rèn)為它們也參與低溫響應(yīng)（Stief et al.， 2014）。根據(jù)張寧等（2019）通過對(duì)比過表達(dá)小熱激蛋白的番茄（Lycopersicon esculentum）植株和正常植株，發(fā)現(xiàn)小熱激蛋白能夠積極調(diào)動(dòng)起來以對(duì)抗逆境脅迫，達(dá)到提高番茄耐寒性的目的。史潔瑋等（2020）發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下，誘導(dǎo)番茄小熱激蛋白基因CI-HSP17.7含量上升，并通過糖含量的變化使番茄果實(shí)的耐寒性增強(qiáng)。Waters等（1996）證實(shí)了寒脅迫能誘導(dǎo)植物Hsp70的mRNA與蛋白質(zhì)的合成。宮偉娜等（2009）發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭（Ageratina adenophora）在冷脅迫下，不同分子量熱激蛋白基因通過保護(hù)功能蛋白的活性進(jìn)而增強(qiáng)紫莖澤蘭的低溫適應(yīng)能力。同時(shí)，在水稻（Oryza sativa）的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，冷脅迫前后熱激水稻幼苗的胚根可以明顯提升幼苗胚根的耐寒性（Saltveit， 2001）。而NEF是一種Hsp70結(jié)合蛋白，通過介入體內(nèi)分子伴侶體系使之具有穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)Hsp70的功能，其缺失可導(dǎo)致Hsp70的降解（劉霞霞等，2017）。進(jìn)一步推測(cè)出，受到冷脅迫后的紅陽獼猴桃耐寒突變體植株蛋白酶體降解能力加強(qiáng)，這可能是由于蛋白質(zhì)與在脅迫下形成的熱激蛋白大分子寡聚物sHSF相互作用，從而使蛋白質(zhì)的進(jìn)一步聚合得到抑制，并與Hsp70、NEF等其他分子伴侶在一定條件下幫助蛋白重新折疊，進(jìn)而維持蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而達(dá)到增強(qiáng)其抗寒性的目的。結(jié)合EMS誘導(dǎo)紅陽獼猴桃耐寒突變體及轉(zhuǎn)錄組分析，以上研究結(jié)果為紅陽獼猴桃耐寒種質(zhì)資源選育及耐寒分子機(jī)制研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)材料及理論參考依據(jù)。

4?結(jié)論

本研究利用EMS誘導(dǎo)出葉型和株型共12種突變體，最終通過寒脅迫處理篩選出耐寒突變體。進(jìn)一步將初步篩選出的耐寒突變體與正常紅陽獼猴桃植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析，結(jié)果表明，進(jìn)行寒脅迫處理的紅陽獼猴桃耐寒突變體與對(duì)照組紅陽獼猴桃正常植株相比，共有差異表達(dá)基因294條，其中上調(diào)表達(dá)254條，下調(diào)表達(dá)40條。差異表達(dá)基因注釋到250個(gè)GO功能分類和15條KEGG通路中，分析結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工通道呈極顯著富集了9條差異表達(dá)基因，且均為上調(diào)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了3類耐寒相關(guān)基因，通過分析推測(cè)出紅陽獼猴桃通過提升sHSF、Hsp70、NEF的表達(dá)量來提升其耐寒性。

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（責(zé)任編輯?周翠鳴）