劉周亮,楊超,汪慧君,林志淼

1 臨床資料

患兒男,3歲,全身多發(fā)皮下結節(jié)2年?；颊哂?歲時全身多處出現(xiàn)膚色皮下結節(jié),且隨年齡增長逐漸增多,無明顯自覺癥狀。父母非近親結婚,家族中無類似疾病患者?；純鹤阍马槷a(chǎn),其異卵孿生弟弟無類似表現(xiàn)?；颊吒改阜裾J患者慢性病及傳染病史,無藥物過敏史。體檢:一般情況良好,智力正常,肢體無畸形,系統(tǒng)檢查無異常。皮膚科情況:左上臂屈側、臍左側、右下腹、左大腿近膝處、左側臀部、右下肢屈側可見多發(fā)散在皮下結節(jié),呈膚色、形狀不規(guī)則,直徑為0.5～1.0 cm大小不等,略高出皮面,表面光滑,質(zhì)軟,部分融合,無觸痛、壓痛(圖1)。四肢長骨X線檢查未見異常。皮損組織病理示:表皮無明顯改變,真皮脂肪上移,脂肪間隔膠原增粗,透明變性,纖維母細胞增多(圖2a～2b)。彈力纖維染色示:真皮內(nèi)彈力纖維增生、粗大(圖2c～2d)。阿新藍染色示:黏蛋白沉積于真皮下,多灶(+)(圖2e～2f)。

圖1a～1b 多發(fā)膚色、不規(guī)則皮下結節(jié),邊界欠清

HE×50;HE×100;EVG×50;EVG×100;Alcan blue×50;Alcan blue×100

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意,患者家屬簽署知情同意書后,采集患者及其父母外周血各4 mL,采用2%乙二胺四乙酸(EDTA)進行抗凝。使用QIAGEN試劑盒提取基因組DNA,并在使用紫外分光光度計進行定量和純度檢測后,采用全外顯子組測序方法對患者血液提取的基因組DNA進行檢測,檢測到的變異進行注釋,過濾掉常見變異(最小等位基因頻率>0.01)。使用SIFT、Polyphen-2、Mutation Taster等軟件對變異位點進行致病性預測。對候選基因突變位點進行Sanger測序驗證:針對LEMD3基因(NM_014319.5)突變位點所在外顯子的上下游設計引物,其中正向引物序列為5′-TGGATTCGTCAACAGGCTCC-3′,反向引物序列為5′-ATGTAAAACGCTAAGCGCGG-3′。DNA擴增后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物純化后送至廣州天一輝遠生物科技有限公司進行測序。產(chǎn)物測序結果與Ensembl網(wǎng)站(https://asia.ensembl.org/)公布的序列對比,發(fā)現(xiàn)患者LEMD3基因1號外顯子上存在c.1323C>G (p.Tyr441*)雜合突變(圖3a),父母未見相同突變(圖3b～3c),提示為新發(fā)突變。該突變位點未見于任何正常人群變異頻率數(shù)據(jù)庫,包括ExAC及gnomAD等數(shù)據(jù)庫。因此,根據(jù)基因測序結果將該病例確診為Buschke-Ollendorff綜合征(BOS)。鑒于該患者孿生弟弟為異卵雙生,且無表型,考慮其弟弟與該疾病無相關性,無基因檢測的必要性,故未行檢測。

圖3a 患者LEMD3基因1號外顯子發(fā)生c.1323C>G(p.Tyr441*)雜合無義突變:圖3b～3c 患者父親、母親LEMD3基因序列圖

2 討論

Buschke-Ouendorff綜合征(BOS)(OMIM 166700),又名布席克-奧倫道夫綜合征、播散性豆狀皮膚纖維瘤,是一種罕見的、良性的常染色體顯性遺傳的疾病,發(fā)病率約0.005%[1],其典型特征為出現(xiàn)結締組織痣、脆弱性骨硬化[2]。兩者可同時出現(xiàn),也可單一出現(xiàn)。結締組織痣是由真皮細胞外基質(zhì)成分如膠原纖維、彈性纖維或黏多糖等構成的錯構瘤,可根據(jù)病變的組成成分分為:①膠原型;②彈力蛋白型;③黏蛋白型。本例屬于混合型。此外,結締組織痣可根據(jù)是否伴發(fā)其他病變分為:①不伴其他器官病變型;②伴發(fā)結節(jié)性硬化癥;③伴有脆弱性骨硬化。脆弱性骨硬化是一種骨骼發(fā)育不良,其特征是X光檢查下,骨內(nèi)具有彌漫性的斑點狀致密骨質(zhì),也被稱為骨斑點癥[3]。

2004年,LEMD3基因的功能缺失性突變被證實是導致BOS發(fā)病的遺傳學病因[4]。LEMD3也被稱作MAN1,位于染色體12q14.3,編碼內(nèi)核膜蛋白,內(nèi)核膜蛋白通過與Smad家族蛋白質(zhì)相互作用,可拮抗TGF-β和BMP信號通路。LEMD3表達的缺失導致成纖維細胞中的TGF-β和BMP信號通路異常上調(diào),促使結締組織和彈性蛋白的形成,從而產(chǎn)生特異性的臨床表型。

目前BOS的診斷主要基于臨床表現(xiàn)、影像學表現(xiàn)、組織病理學、遺傳分析。由于該疾病具有明顯的臨床異質(zhì)性,不同患者可出現(xiàn)差異明顯的臨床表現(xiàn)。因此更需要遺傳分析確診[1]。本例皮損表現(xiàn)為全身多發(fā)皮下結節(jié),結合病史、組織病理檢查,臨床診斷為結締組織痣。結合基因檢測結果,依據(jù)ACMG(http://www.acmg.net)指南標準,該變異被判斷為致病變異,因此可將該病例最終確診為BOS綜合征。c.1323C>G無義突變目前尚未見報道,但既往曾有學者報道c.1323C>A突變的BOS病例[1,4],該突變與筆者發(fā)現(xiàn)的突變具有相似的致病機制。該位點可導致翻譯水平提前出現(xiàn)終止密碼子,引起LEMD3蛋白表達減少,可能導致該病的發(fā)生。本例患者無自覺癥狀,皮損隨年齡增長而增多,除皮膚以外未發(fā)現(xiàn)其他系統(tǒng)性病變,因而未進行治療。值得注意的是該患者目前暫未出現(xiàn)骨損害。結合以往報道,BOS患者可出現(xiàn)脆弱性骨硬化、肢骨紋狀肥大等骨損害。脆弱性骨硬化往往較晚出現(xiàn),一般是在10歲以后出現(xiàn)[5]。肢骨紋狀肥大,是一種較脆弱性骨硬化更加嚴重的骨損害,是由于間充質(zhì)發(fā)育不良伴增生,骨皮質(zhì)增寬所引起[1,6]。該癥狀會在X線上呈“滴蠟樣”改變,可導致骨骺提前閉合,引起肢體不等長、活動受限等,需要早期干預,必要時進行手術治療。因此筆者建議患者定期進行四肢骨骼X線檢查,定期隨訪。

LEMD3基因全長約78 kb,包含13個外顯子。查閱開放數(shù)據(jù)庫LOVD(http://databases.lovd.nl/whole_genome/genes/LEMD3),已知至今檢測出125個LEMD3基因的致病性突變,包括113個點突變、9個缺失突變、2個插入突變和1個重復突變。本研究發(fā)現(xiàn)1例新發(fā)LEMD3無義突變c.1323C>G(p.Tyr441*),最終導致BOS,豐富了LEMD3基因突變庫,為BOS的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了理論依據(jù)。