杜亞麗, 徐 凱, 鄭麗芳, 劉玉玲, 姜玉鎖,*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 太谷 030801; 2. 吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所, 吉林 132108)

紅棗花屬于蟲媒花,花期長(zhǎng)、泌蜜量大,是我國華北和西北地區(qū)主要的蜜源植物之一。然而蜜蜂,尤其是西方蜜蜂Apismellifera,在采集棗花花蜜后極易出現(xiàn)中毒現(xiàn)象,即“棗花病”或“五月病”,導(dǎo)致采集蜂大量死亡,蜂群發(fā)展和繁殖受到負(fù)面影響,同時(shí)大大降低了蜂農(nóng)利用棗花蜜源的積極性,在北方許多地區(qū)甚至出現(xiàn)“寧可飼喂蜜蜂也不愿采集棗花蜜”的怪象(Maetal., 2020)。蜜蜂棗花病的流行已成為影響我國紅棗產(chǎn)業(yè)和養(yǎng)蜂產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。自20世紀(jì)50-60年代起,養(yǎng)蜂從業(yè)者多根據(jù)蜜蜂飼養(yǎng)管理經(jīng)驗(yàn)推斷棗花病的起因。張曉光(1959)在山西呂梁地區(qū)進(jìn)行調(diào)研后發(fā)現(xiàn),蜂群在氣候干燥、西南風(fēng)大且水源不足的情況下發(fā)病率較高,群勢(shì)衰減達(dá)到30%～50%,因此提出蜜蜂棗花病可能是由于氣候干旱和酷熱郁悶所導(dǎo)致的推斷。夕艮(1960)對(duì)河南中牟地區(qū)蜜蜂棗花病發(fā)病情況調(diào)研后推斷,蜜蜂棗花病不屬于傳染性疾病,也不是花粉中毒,其認(rèn)為氣候干旱、花蜜濃稠以及工蜂勞動(dòng)過度綜合引起了該病的發(fā)生。20世紀(jì)90年代,研究者開始從棗花蜂蜜化學(xué)成分組成方面來闡釋蜜蜂棗花病的發(fā)病機(jī)制。李曉立和范正友(1991)比較了棗花病和刺槐蜜中蔥貳類、糖類、生物堿、礦物質(zhì)和有毒物質(zhì)等成分差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)棗花蜜中鉀元素的含量是刺槐蜜的16倍多,高達(dá)0.141%,因此提出棗花蜜中鉀離子的高含量可能是導(dǎo)致蜜蜂中毒的主要原因。還有報(bào)道稱棗花蜜中生物堿含量過高是引發(fā)蜜蜂棗花病的主要因素(金豐, 1994)。隨著物質(zhì)檢測(cè)和高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,研究者對(duì)棗花病進(jìn)行了更深入的研究。馬衛(wèi)華等(2011)對(duì)棗花期蜜蜂體內(nèi)的消化酶和解毒酶活性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)棗花病使蜜蜂體內(nèi)的淀粉酶、蛋白酶和果膠酶活性受到抑制,可以誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase, GST)活性增高。Ma等(2020)通過16S rRNA測(cè)序?qū)椈ú』疾∶鄯浜驼Ｃ鄯淠c道微生物多樣性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)患病工蜂中腸和后腸內(nèi)厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)菌群的豐富度顯著下降,包括糖、核苷酸和氨基酸在內(nèi)的多個(gè)代謝通路與棗花病相關(guān)。關(guān)于棗花病的防治,蜂農(nóng)多根據(jù)養(yǎng)蜂經(jīng)驗(yàn)自己調(diào)配一些大黃、甘草、金銀花、仁丹和食醋等配制的糖水,并輔助遮蔭灑水來防治棗花病,效果均不明顯(王國旺, 2010; 郭興啟, 2016; 劉耀斌, 2018)。雖然學(xué)者們對(duì)棗花病的病因及防治做了大量工作,但迄今為止有關(guān)蜜蜂棗花病的發(fā)生機(jī)制仍不清楚。

中腸作為昆蟲消化和解毒代謝的主要組織器官,在昆蟲取食消化、生長(zhǎng)發(fā)育及防御外源有毒物質(zhì)的過程中起著重要作用。目前尚無以中腸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的角度解析棗花病發(fā)病機(jī)制的研究報(bào)道。本研究以我國北方地區(qū)棗花期主要的生產(chǎn)蜂種意大利蜜蜂Apismelliferaligustica為研究對(duì)象,比較分析患棗花病和健康意大利蜜蜂工蜂中腸內(nèi)代謝物組分和含量,挖掘差異代謝物及相關(guān)代謝通路,為深入了解蜜蜂棗花病的發(fā)病機(jī)制和棗花病防治提供理論依據(jù),對(duì)促進(jìn)我國北方地區(qū)蜜蜂產(chǎn)業(yè)的快速持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

棗花開花前期(5月15日左右)在山西省太谷區(qū)南洸村(37°23′2.00″N, 112°31′12.04″E)棗樹林(周圍5 km無其他蜜粉源作物)放置12箱群勢(shì)強(qiáng)壯、健康無病的正常意大利蜜蜂蜂群,于棗花開花盛期(6月8-15日)即蜜蜂棗花病較為嚴(yán)重時(shí),在蜂箱巢門口隨機(jī)收集患棗花病意大利蜜蜂工蜂,癥狀為:腹部弓縮、反應(yīng)遲鈍、飛翔能力喪失、跳躍爬行,標(biāo)記為患病組(diseased group, DG)。同期,在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)太谷校區(qū)(37°25′14.27″N, 112°35′14.18″E)試驗(yàn)蜂場(chǎng)(周圍5 km無棗樹)內(nèi)選擇12箱群勢(shì)相近的正常意大利蜜蜂蜂群,隨機(jī)抓取健康的歸巢采蜜工蜂,表現(xiàn)為:腹部正常且發(fā)亮、動(dòng)作敏捷,標(biāo)記為健康組(healthy group, HG)。用紗籠把蜜蜂DG和HG樣本迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,冷凍麻醉后依次用蒸餾水、75%酒精沖洗蜜蜂體表,然后使用經(jīng)75%酒精消毒后的鑷子夾住蜜蜂的腹柄和螫針或第7腹節(jié)拉出腸道,截取中腸迅速投入液氮,隨后于-80 ℃保存。每30頭工蜂中腸組織的混合樣品作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)樣本設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)檢測(cè)

樣本檢測(cè)使用Vanquish UHPLC色譜儀(Thermo Fisher,德國),色譜柱為Hypesil GoldTMC18 1.9 μm (100 mm×2.1 mm)。正模式下流動(dòng)相A為0.1%甲酸, B為甲醇; 負(fù)模式下流動(dòng)相A為5 mmol/L醋酸銨(pH 9.0),B為甲醇。色譜梯度洗脫程序?yàn)?0～1.5 min B相比例保持2%;1.5～12 min B相比例上升至100%;12～14 min B相比例保持100%;14～14.1 min B相比例從100%降至2%;14.1～16 min B相比例保持2%。柱溫為40 ℃;流速為0.2 mL/min。聯(lián)用Q ExactiveTMHFX質(zhì)譜儀(Thermo Fisher,德國),設(shè)置條件為:掃描范圍選擇70～1 050 m/z;ESI源的設(shè)置為:噴霧電壓: 3.2 kV;鞘氣體流速:40 arb;輔助氣體流速:10 arb;毛細(xì)管溫度:320 ℃。MS/MS二級(jí)掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描。取1.1節(jié)DG和HG中腸樣本各100 mg液氮研磨至粉末狀,溶于500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液中,渦旋震蕩后冰浴5 min,隨后15 000 r/min 4 ℃離心10 min。取一定量的上清液添加質(zhì)譜級(jí)純水稀釋至甲醇含量為53%,置于帶有0.22 μm濾膜的離心管中,15 000×g 4 ℃離心10 min,收集濾液進(jìn)行LC-MS/MS分析。此外,代謝物的提取和檢測(cè)過程極易受外界因素影響且變化迅速,因此,實(shí)驗(yàn)樣本等體積混合制成的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制(quality control, QC)需插入檢測(cè)分析中,用于評(píng)價(jià)整個(gè)檢測(cè)過程中系統(tǒng)穩(wěn)定性和可靠性。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)檢測(cè)

Agilent 7890A氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀配有Agilent DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm),GC-TOF-MS分析條件為:以Splitless模式注入1 μL樣本,載氣為氮?dú)?隔墊吹掃流速為3 mL/min,柱流速為1 mL/min。初始柱溫為50 ℃并保持1 min,然后以20 ℃/min升至310 ℃停留6 min。前進(jìn)樣口、傳輸線和離子源溫度分別為溫度為280, 280和250 ℃,電離電壓為-70 eV,在m/z范圍為50～500之間進(jìn)行全掃描,掃描速率為12.5 spectra/s;溶劑延遲時(shí)間為4.78 min。取1.1節(jié)DG和HG中腸樣本50 mg加入450 μL提取液(甲醇∶氯仿=3∶1, v∶v)和10 μL L-2-氯苯丙氨酸,渦旋30 s,加入磁珠使用研磨儀以45 Hz研磨4 min,之后12 000 r/min 4 ℃離心15 min,移取300 μL上清于1.5 mL離心管中。經(jīng)真空干燥后加入60 μL甲氧胺鹽試劑,輕輕混勻,烘箱中80 ℃孵育30 min。各樣品中加入80 μL BSTFA后70 ℃孵育1.5 h,冷卻至室溫,加入5 μL FAME后進(jìn)行GC-MS分析。

1.4 抗氧化酶活性測(cè)定

分別將1.1節(jié)30頭患棗花病和健康意大利蜜蜂工蜂中腸混合樣本放在1.5 mL離心管中準(zhǔn)確稱重,按組織凈重(g)∶生理鹽水體積(mL)=1∶9的比例加入相應(yīng)體積的生理鹽水,然后在冰浴條件下機(jī)械勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清液用生理鹽水稀釋分別至10%。隨后按照總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)測(cè)定試劑盒(南京建成)說明在SynergyTMH1全功能微孔板檢測(cè)儀上進(jìn)行活性測(cè)定。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)

利用TRIzol試劑提取1.1節(jié)DG和HG中腸樣本總RNA,測(cè)定濃度和純度后根據(jù)PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后利用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI,美國)中進(jìn)行qRT-PCR,檢測(cè)抗氧化基因Sod1,Sod2和CAT及免疫基因Defensin,Hymenoptaecin,Apidaecin和Abaecin的表達(dá)量,根據(jù)基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列(表1)。PCR反應(yīng)體系: SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (2×) 7.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL, cDNA模板100 ng, ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.3 μL, ddH2O補(bǔ)充至15 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 30 s, 62 ℃ 34 s, 45個(gè)循環(huán)。熔解曲線生成條件: 95 ℃ 15 s, 62 ℃ 1 min。選用西方蜜蜂Arp1(GenBank登錄號(hào): GB44311)作為內(nèi)參基因,所需引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用CD3.1和Chroma TOF軟件處理獲得的患棗花病和健康意大利蜜蜂工蜂中腸代謝組數(shù)據(jù),然后與二級(jí)譜圖數(shù)據(jù)庫mzCloud和mzVault及一級(jí)數(shù)據(jù)庫MassList比對(duì)進(jìn)行代謝物鑒定,對(duì)代謝物進(jìn)行定量,計(jì)算各QC樣本間的皮爾森相關(guān)系數(shù)。為明確各組樣本之間的代謝物差異和組內(nèi)樣本之間的變異度,使用SMICA14.1軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA),根據(jù)差異倍數(shù)(fold change, FC)>2.0、P<0.05值和偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)模型獲得的變量投影重要性(variable projection importance, VIP)>1.0篩選差異代謝物,然后在有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem (https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、代謝通路數(shù)據(jù)庫KEGG (https:∥www.genome.jp/kegg/)和人類代謝組數(shù)據(jù)庫HMDB(https:∥hmdb.ca/)中進(jìn)行鑒定和注釋。最后利用邁維云平臺(tái)(https:∥cloud.metware.cn)對(duì)差異代謝物進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析。qRT-PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)應(yīng)用7500軟件分析標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增曲線的Ct值,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。利用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行圖形分析。使用SPSS 22.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

基于LC-MS代謝組學(xué)檢測(cè)的正負(fù)離子模式下,患棗花病和健康意大利蜜蜂工蜂中腸代謝物各色譜峰的相應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本穩(wěn)定。數(shù)據(jù)質(zhì)量控制樣本的R2均大于0.99,說明整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,數(shù)據(jù)質(zhì)量高,可用于后續(xù)分析。此外,基于GC-MS代謝組分析中數(shù)據(jù)質(zhì)量控制樣本的R2均大于0.91。

2.2 基于LC-MS檢測(cè)獲得的代謝組

患棗花病組和健康組意大利蜜蜂工蜂中腸代謝物的PCA結(jié)果表明(圖1),正離子模式下,第1和第2主成分的解釋率分別是34.7%和13.1%,兩個(gè)主成分貢獻(xiàn)率之和為47.8%;負(fù)離子模式下,第1和第2主成分的解釋率分別是32.9%和18.8%,總和為51.7%。根據(jù)樣本在PCA得分圖上的分布來看,正負(fù)離子模式下各組樣本均位于其 95%置信區(qū)間內(nèi),組內(nèi)差異較小;DG和DG樣本數(shù)據(jù)均能被明顯區(qū)分,說明棗花病導(dǎo)致意大利蜜蜂中腸內(nèi)各種代謝物的含量發(fā)生顯著變化。

圖1 基于LC-MS非靶向代謝組學(xué)鑒定正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下患棗花病和健康意大利蜜蜂工蜂中腸代謝物主成分分析(PCA)Fig. 1 Principal component analysis (PCA) of metabolites in the midgut between the jujube flower disease-suffered and healthy Apis mellifera ligustica workers under positive (A) and negative (B) ion model based on LC-MS non-targeted metabolomicsHG: 健康組Healthy group; DG: 患病組Diseased group. 圖2和5同。The same for Figs. 2 and 5. LC-MS: 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用Liquid chromatography-mass spectrometry. 表2同。The same for Table 2.

正離子模式下獲得患棗花病和健康意大利蜜蜂工蜂中腸間差異代謝物49種,22種含量上調(diào),27種含量下調(diào),其中能夠比對(duì)到KEGG和HMDB數(shù)據(jù)庫中的有33種;負(fù)離子模式下獲得差異代謝物43種,14種含量上調(diào),29種含量下調(diào),共30種鑒定到KEGG和HMDB數(shù)據(jù)庫中(表2)。鑒定的差異代謝物主要屬于碳水化合物及其代謝物、氨基酸及其代謝物、脂質(zhì)和有機(jī)酸及其衍生物等。

2.3 基于GC-MS檢測(cè)獲得的代謝組

患棗花病組和健康組意大利蜜蜂工蜂中腸代謝物的PCA結(jié)果表明(圖2),第1和第2主成分的解釋率分別為31.3%和18.2%。篩選得到患棗花病和健康意大利蜜蜂工蜂間中腸揮發(fā)性差異代謝物22種,8種含量上調(diào),14種含量下調(diào),在KEGG和HMDB數(shù)據(jù)庫中可鑒定的有11種(表3)。鑒定的差異代謝物主要屬于碳水化合物及其代謝物、有機(jī)酸及其衍生物等。

圖2 基于GC-MS非靶向代謝組學(xué)的患棗花病和健康意大利蜜蜂工蜂中腸代謝物主成分分析(PCA)Fig. 2 Principal component analysis (PCA) of metabolites in the midgut between the jujube flower disease-suffered and healthy Apis mellifera ligustica workers based on GC-MS non-targeted metabolomicsGC-MS: 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用Gas chromatography-mass spectrometry. 表3同。The same for Table 3.

表3 基于GC-MS非靶向代謝組學(xué)鑒定到的患棗花病與健康意大利蜜蜂工蜂中腸間差異代謝物Table 3 Differential metabolites in the midgut between the jujube flower disease-suffered andhealthy Apis mellifera ligustica workers identified by GC-MS non-targeted metabolomics

經(jīng)PubChem對(duì)所有鑒定到的74種差異代謝物比較后發(fā)現(xiàn),表2中的D-半乳糖酸與表3中的半乳糖酸為同一種物質(zhì),故基于 LC-MS 和GC-MS的代謝組學(xué)分析共鑒定獲得 73 種差異代謝物,28種含量上調(diào),45種含量下調(diào)。與健康意大利蜜蜂工蜂相比,患棗花病意大利蜜蜂工蜂中腸內(nèi)烏索酸、L-蘇糖酸、葡萄糖酸、D-半乳糖酸、蘇糖酸和蘆丁的含量下降幅度較大,而京尼平苷酸、吲哚-3-乙酸、喹啉和棉子糖則在棗花病工蜂中腸中大量積累(圖3)。

圖3 患棗花病與健康意大利蜜蜂工蜂間中腸中前10的差異代謝物Fig. 3 Top 10 differential metabolites in the midgut between the jujube flower disease-suffered and healthy Apis mellifera ligustica workers

2.4 差異代謝物的KEGG通路富集

KEGG分析表明,患棗花病與健康意大利蜜蜂工蜂中腸代謝物比較,48種差異代謝物被注釋到碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、輔助因子和維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins)等多種代謝通路上(圖4: A),少數(shù)差異代謝物還對(duì)蜜蜂的生物體系統(tǒng)(organismal systems)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)和細(xì)胞過程(cellular processes)有一定的影響。顯著富集(P<0.05)的通路包括鐵死亡(ferroptosis)、丁酸甲酯代謝(butanoate metabolism)、抗壞血酸和醛酸代謝(ascorbate and aldarate metabolism)、半乳糖代謝(galactose metabolism)和血管平滑肌收縮(vascular smooth muscle contraction)(圖4: B),其中,丁酸甲酯代謝、抗壞血酸和醛酸代謝及半乳糖代謝均屬于碳水化合物代謝通路。與HG相比,DG參與丁酸甲酯代謝通路中的4-氨基丁酸、乙酰乙酸和肌醇水平下降,α-酮戊二酸上升;抗壞血酸和醛酸代謝通路中,L-蘇糖酸、D-葡糖二酸和肌醇水平下降,α-酮戊二酸上升;半乳糖代謝通路中肌醇、甘露糖、半乳糖酸水平下降,棉子糖水平上升。

圖4 患棗花病與健康意大利蜜蜂工蜂間中腸中差異代謝物KEGG通路富集Fig. 4 KEGG pathway enrichment of differential metabolites in the midgut between the jujube flower disease-suffered and healthy Apis mellifera ligustica workersA: KEGG通路二級(jí)分類匯總Summary of KEGG pathway class Ⅱ; B: KEGG通路富集氣泡Bubble of enriched KEGG pathway enrichment.

2.5 抗氧化能力及免疫基因表達(dá)

蜜蜂棗花病發(fā)生后意大利蜜蜂工蜂中腸內(nèi)的抗氧化和免疫活性發(fā)生顯著變化。與健康意大利蜜蜂工蜂相比,患棗花病意大利蜜蜂工蜂中腸內(nèi)SOD(t=10.396,P=0.000)和CAT(t=6.578,P=0.001)活性極顯著下降(圖5: A, B)。由圖5(C)可知,與健康意大利蜜蜂工蜂中的相比,患棗花病意大利蜜蜂工蜂中腸內(nèi)抗氧化基因Sod1,Sod2和CAT表達(dá)量均有下降趨勢(shì),其中Sod2(t=4.463,P=0.011)和CAT(t=11.660,P=0.005)的表達(dá)量顯著下降,Sod1表達(dá)量無顯著差異(t=0.310,P=0.772)。免疫基因Defensin(t=6.688,P=0.003),Hymenoptaecin(t=10.980,P=0.000)和Apidaecin(t=14.161,P=0.005)在患棗花病意大利蜜蜂工蜂中腸內(nèi)的表達(dá)量極顯著低于健康蜜蜂中的,而Abaecin在患棗花病意大利蜜蜂工蜂的表達(dá)量極顯著高于健康蜜蜂中的(t=-10.801,P=0.008)(圖5: D)。

圖5 患棗花病和健康意大利蜜蜂工蜂中腸中SOD(A)和CAT(B)活性及抗氧化基因(C)和免疫基因(D)的表達(dá)量Fig. 5 Activities of SOD(A) and CAT(B), and the expression levels of antioxidant genes (C) and immune genes (D) in the midgut of the jujube flower disease-suffered and healthy Apis mellifera ligustica workersSOD: 超氧化物歧化酶Superoxide dismutase; CAT: 過氧化氫酶Catalase. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;柱上符號(hào)表示兩組間差異顯著性(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; NSP>0.05)(t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. The symbols above bars indicate the significance of differences between the two groups (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; NSP>0.05) (t-test).

3 討論

3.1 蜜蜂棗花病差異代謝物分析

基于LC-MS和GC-MS兩種技術(shù)對(duì)棗花病蜜蜂和健康蜜蜂中腸進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析,共篩選獲得114種差異代謝物,鑒定的有73種。其中,京尼平苷酸、吲哚-3-乙酸、喹啉和棉子糖在棗花病蜜蜂中腸內(nèi)的含量上升明顯。京尼平苷酸(GPA)是一種具有環(huán)烯醚萜結(jié)構(gòu)的葡萄糖苷,具有抗氧化、抗衰老等生理功效,常用于治療皮膚和多種肝臟疾病的抗炎物質(zhì)(Chenetal., 2016)。研究表明,GPA及其衍生物能夠有效地減少活性氧ROS,降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激(Chengetal., 2022),或誘導(dǎo)自噬延長(zhǎng)細(xì)胞的復(fù)制壽命(Wangetal., 2021)。吲哚-3-乙酸(IAA)是一種具有促進(jìn)多類型細(xì)胞發(fā)育作用的生長(zhǎng)素(Luoetal., 2016),已有研究表明生命體被微生物侵染后體內(nèi)IAA水平顯著升高,與機(jī)體受微生物侵害密切相關(guān)(Tsavkelovaetal., 2006)。棉子糖是一種由果糖、半乳糖和葡萄糖結(jié)合構(gòu)成的可溶性非還原性寡糖,能促進(jìn)腸道雙歧桿菌、乳酸菌的增殖,降低致病性鏈球菌的數(shù)量,具有促進(jìn)免疫、降低腸道疾病發(fā)生概率的作用(Xuetal., 2018)。對(duì)錦鯉的研究表明,棉子糖可增加血清中SOD水平和腸道中微生物多樣性(李鐵梁等, 2020)。這3種物質(zhì)的含量上調(diào)預(yù)示著,棗花病會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生大量活性氧,蜜蜂需要通過提高抗氧化活性物質(zhì)的水平來應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激造成的損傷。此外,喹啉是一種來自多種植物的生物堿,具有一定的致畸、致癌、致突變作用,能夠通過食物鏈在包括人類在內(nèi)的高級(jí)生物體中大量積累,有著較大的潛在危害。這里我們并不能判斷棗花花蜜中含有喹啉,其對(duì)蜜蜂的作用還需進(jìn)一步分析。

除上述物質(zhì)外,棗花病蜜蜂中腸內(nèi)烏索酸、L-蘇糖酸、葡萄糖酸、D-半乳糖酸、蘇糖酸和蘆丁的含量顯著下調(diào)。這些物質(zhì)大多與腸道穩(wěn)態(tài)、抗氧化應(yīng)激和免疫抗炎密切相關(guān)。烏索酸UA是一種具有抗炎、抗氧化和抗病毒等廣泛的泛藥理和生物活性的五環(huán)三萜類化合物(Luanetal., 2022),不僅能夠降低腸道菌群豐度和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)來改善腸道屏障功能(Fengetal., 2015; Shengetal., 2021),還能提高SOD和CAT活性來防止病毒和有害物質(zhì)導(dǎo)致的過度免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激和腸道損傷(Al-Kuraishyetal., 2022; Weietal., 2022)。蘆丁是植物中最常見的類黃酮化合物,可以減少M(fèi)DA, ROS, NO, GSSG, iNOS和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,增加CAT, SOD, GSH和GPx活性,發(fā)揮多功能劑的作用(Wangetal., 2012; Enogieruetal., 2018)。斷奶仔鼠的日糧添加試驗(yàn)表明,蘆丁能夠提高空腸的抗氧化功能,顯著改善腸道黏膜結(jié)構(gòu)及屏障功能(張佳琦等, 2022)。腸道內(nèi)的葡萄糖酸GA是由葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成的一種酸性物質(zhì),能夠促進(jìn)有益細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖,調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡,增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的同時(shí)也提高了腸道黏膜的主動(dòng)免疫功能(李虎等, 2012)。此外,GA還具有良好的抗氧化功能,可以顯著提高肉雞血清中的SOD含量,并能抑制細(xì)胞色素P450參與親電子代謝物的形成(馬可為, 2008)。半乳糖酸是半乳糖代謝分解形成的一種糖酸,參與半乳糖代謝通路。半乳糖可以改變腸道菌群組成,降低腸道炎癥,改善腸道健康(陳履雙等, 2022)。據(jù)此推測(cè)蜜蜂患棗花病后腸道黏膜結(jié)構(gòu)受到破壞,腸道微生物失衡,免疫功能和抗氧化能力發(fā)生異常。

隨后,我們對(duì)棗花病蜜蜂和健康蜜蜂中腸的抗氧化能力進(jìn)行了比較分析,結(jié)果顯示,棗花病蜜蜂中腸的SOD和CAT活性極顯著低于健康蜜蜂中的。同樣地,熒光定量PCR結(jié)果也表明,患棗花病蜜蜂中腸內(nèi)抗氧化基因Sod1,Sod2和CAT表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。蜜蜂體內(nèi)天然抗菌肽主要有4種,分別是Apidaecin, Abaecin, Hymenoptaecin和Defensin(葉良等, 2022),它們作為蜜蜂先天體液免疫的重要組成部分,在抑制和清除微生物和寄生蟲等生物有害因子方面發(fā)揮著重要的作用(Krongdangetal., 2019)。本研究發(fā)現(xiàn),免疫基因Defensin,Hymenoptaecin和Apidaecin在患棗花病蜜蜂中腸內(nèi)的表達(dá)量極顯著低于健康蜜蜂中的。意外的是,Abaecin在棗花病蜜蜂中腸內(nèi)的表達(dá)量極顯著高于健康組,這可能與其對(duì)真菌和農(nóng)藥等外來刺激的抑制和解毒作用相關(guān)(Tesovniketal., 2019)。綜上分析,棗花病會(huì)抑制蜜蜂中腸內(nèi)抗氧化酶的活力,降低抗氧化和免疫基因的表達(dá),對(duì)蜜蜂的氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)答造成一定的影響。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了我們上述的推測(cè)。

3.2 蜜蜂棗花病相關(guān)代謝通路

為進(jìn)一步從營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的角度闡釋蜜蜂棗花病的發(fā)病機(jī)理,本研究對(duì)差異代謝物質(zhì)進(jìn)行了KEGG功能富集,發(fā)現(xiàn)抗壞血酸和醛糖酸代謝、丁酸甲酯代謝和半乳糖代謝這3條通路受到顯著影響,且前兩個(gè)通路的富集程度較高?？箟难岷腿┧岽x是重要的碳水化合物代謝通路之一,可以保護(hù)細(xì)胞免受有氧代謝和一系列不良因素引起的氧化損傷。動(dòng)物飼喂試驗(yàn)已證實(shí)機(jī)體抗氧化性能的提高是由抗壞血酸和醛酸代謝上調(diào)引起的(張艷等, 2018; Lietal., 2022)。本研究發(fā)現(xiàn)棗花病蜜蜂中腸內(nèi)抗氧化酶SOD和CAT的活性及相關(guān)基因的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì),抗氧化能力降低,故我們認(rèn)為棗花病會(huì)通過改變抗壞血酸和醛酸代謝來干擾氧化應(yīng)激,造成急性腸損傷,使得蜜蜂無法正常取食和消化。丁酸甲酯代謝通常是腸道發(fā)酵產(chǎn)生一些短鏈脂肪酸或短鏈醇的代謝通路。丁酸是一種常見的腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)物,參與維持腸上皮細(xì)胞,在調(diào)節(jié)腸道對(duì)抗原的免疫耐受方面發(fā)揮重要作用(Changetal., 2014)。此外,丁酸還能調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物代謝,改變細(xì)菌菌落的構(gòu)成,間接影響機(jī)體健康(車浩等, 2022)。Ma等(2020)研究就發(fā)現(xiàn)棗花病會(huì)顯著改變蜜蜂腸道菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)合本研究結(jié)果,我們推測(cè)丁酸代謝異常導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)可能在棗花病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。