王 解，彭子輝，王潤(rùn)和，李進(jìn)先，李 剛

［襄陽(yáng)市中心醫(yī)院（湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院） 皮膚科，湖北 襄陽(yáng) 441003］

白癜風(fēng)是一種多見(jiàn)于青少年的皮膚科常見(jiàn)疾病，患者黑素細(xì)胞出現(xiàn)數(shù)目減少及功能受損，臨床癥狀以毛發(fā)、黏膜或皮膚色素脫失為主，發(fā)病部位常定位于手腳，但有時(shí)也能蔓延到面部，使患者常因外表而痛苦尷尬，導(dǎo)致部分患者抑郁［1-2］。白癜風(fēng)是一種慢性炎癥性皮膚病，免疫T 細(xì)胞的分化參與介導(dǎo)其發(fā)病過(guò)程，Th17 細(xì)胞及其表達(dá)合成的促炎因子IL-17 在白癜風(fēng)患者體內(nèi)增加，抑制Th17 細(xì)胞分化，可保護(hù)黑素細(xì)胞，減輕白癜風(fēng)患者色素脫失癥狀［3-4］；IL-23 作為一種炎性因子，可激活Th17 細(xì)胞信號(hào)，引發(fā)炎癥，在胸腺炎等多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用［5］，且IL-23 及Th17 細(xì)胞因子IL-17 水平在白癜風(fēng)患者血清中升高［6］，表明IL-23/Th17 信號(hào)是白癜風(fēng)的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。紫草素是紫草科紫草LithospermumerythrorhizonSieb.et Zucc.根中的活性成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等生物學(xué)功效，可降低炎癥因子IL-6、IL-17 和IL-23 水平，抑制其促炎癥作用，改善銀屑病患者癥狀，對(duì)白癜風(fēng)也有較好療效［7-8］，但其藥理機(jī)制目前還未明確。本文以紫草素處理白癜風(fēng)模型小鼠，探討其對(duì)白癜風(fēng)小鼠黑素細(xì)胞功能的影響及作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物 C57BL/6 小鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量13 ～17 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （魯） 2019-0003］，在動(dòng)物中心適應(yīng)飼養(yǎng)1 周，溫度21 ℃，相對(duì)濕度45%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵循國(guó)家及單位關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用的準(zhǔn)則，并經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)2019-10）。

1.2 試劑 氫醌、羧甲基纖維素鈉 （批號(hào)20170704、F20090916，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。紫草素對(duì)照品（純度≥98%，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）。白癜風(fēng)膠囊（0.45 g/粒，批號(hào)20170527，長(zhǎng)春銀諾克藥業(yè)有限公司）。HE 染色試劑盒、小鼠IL-23 ELISA 試劑盒、小鼠IL-17 ELISA 試劑盒、紅細(xì)胞裂解液、動(dòng)物總RNA 快速抽提試劑盒［生工生物工程（上海） 股份有限公司］； 小鼠α-黑色素細(xì)胞刺激素（α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH）ELISA 試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；IL-23、β-actin、IL-17 引物（蘇州吉瑪基因股份有限公司）； FITCCD4 單克隆抗體、FITC-IL-17 單克隆抗體（上海北諾生物科技有限公司）。

1.3 儀器 Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（上海騰名生物科技有限公司）； DM4000 型光學(xué)顯微鏡、RM2245 型切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）； 7900HT 型熒光定量PCR 儀、3900 型高通量DNA 合成儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）； FACSCalibur 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dicknson 公司）； TD-4M 型低溫高速離心機(jī)（濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立、分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、白癜風(fēng)膠囊（504 mg/kg） 組和紫草素低、中、高劑量（20、40、80 mg/kg） 組，每組12 只。除對(duì)照組外其余各組按參照文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道制備白癜風(fēng)模型，小鼠頸背部脫毛，每天均勻涂抹0.5 mL 2.5%氫醌軟膏（將1 g 羧甲基纖維素鈉、2.5 g 氫醌加到100 mL 去離子水中，磁力攪拌1 h，即得），持續(xù)60 d （每5 d 脫毛1 次），觀察到小鼠脫毛區(qū)毛發(fā)、膚色變白，表示造模成功。對(duì)照組12 只小鼠于背部脫毛處每日均勻涂抹空白基質(zhì)（將1 g 羧甲基纖維素鈉加到100 mL 去離子水中，磁力攪拌1 h，即得）。

以生理鹽水溶解紫草素、白癜風(fēng)膠囊內(nèi)容物，制得2、4、8 mg/mL 紫草素［10］，50.4 mg/mL 白癜風(fēng)膠囊［11］藥液，用藥組小鼠每天上午10： 00 灌胃給予對(duì)應(yīng)藥液10 mL/kg，模型組、對(duì)照組小鼠每天上午10： 00 灌胃給予生理鹽水10 mL/kg，每天1 次，持續(xù)21 d。

2.2 小鼠毛發(fā)脫色情況檢測(cè)及標(biāo)本采集 末次給藥24 h后，觀察小鼠涂藥（2.5%氫醌軟膏） 部位和非涂藥部位脫色情況，參照文獻(xiàn)［12］ 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)部位總分5分。毛發(fā)基本無(wú)脫色為0 分，0＜毛發(fā)脫色面積≤10% 為1分，11%≤毛發(fā)脫色面積≤25%為2 分，26%≤毛發(fā)脫色面積≤50% 為3 分，51% ≤毛發(fā)脫色面積≤75% 為4 分，76%≤毛發(fā)脫色面積≤100%為5 分。脫頸處死小鼠，取腹主動(dòng)脈血2.0 mL，6 只小鼠血液中加入紅細(xì)胞裂解液，冰水浴孵育0.5 h，100×g離心，取細(xì)胞沉淀備用； 剩余6 只小鼠血液100×g離心，取血清備用（保存于-80 ℃）。剪取小鼠造模處皮膚組織0.5 g （保存于液氮），再剪取小鼠造模處皮膚組織（1 cm×1 cm），多聚甲醛固定。

2.3 HE 染色觀察小鼠皮膚病理組織學(xué) 取“2.2” 項(xiàng)下固定的小鼠皮膚組織，脫水、透明、包埋后切片，按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行HE 染色，封片后置于顯微鏡下觀察皮膚組織病理形態(tài)，并掃描橫切面，采用CaseViewer 軟件分析同等放大倍數(shù)下視野中黑色素毛囊、基底層黑素細(xì)胞數(shù)。

2.4 小鼠血清α-MSH、TYR、IL-23、IL-17 水平檢測(cè) 取“2.2” 項(xiàng)下小鼠血清，冰水浴中提前解凍，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)α-MSH、TYR、IL-23、IL-17 水平。

2.5 小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例檢測(cè) 取“2.2” 項(xiàng)下小鼠外周血細(xì)胞沉淀，以PBS 緩沖液洗滌后重懸，計(jì)數(shù)后調(diào)整密度為1.0×106/mL，取1 mL 懸液，依次加入FITC-CD4、FITC-IL-17 單克隆抗體混勻，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算Th17 細(xì)胞比例。

2.6 小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 取“2.2” 項(xiàng)下于-80 ℃保存的小鼠皮膚組織，提取總RNA 后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制得cDNA，均按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，配制RT-qPCR 反應(yīng)預(yù)混液，加入皮膚組織cDNA 模板，混勻后上機(jī)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系配制和反應(yīng)條件設(shè)定均按照熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)進(jìn)行，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，2-ΔΔCT法分析IL-23、IL-17 mRNA 相對(duì)表達(dá)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 24.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠毛發(fā)脫色評(píng)分的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠涂藥部位、非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分升高（P＜0.05）； 與模型組比較，紫草素各劑量組小鼠涂藥部位、非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性（P＜0.05）； 與白癜風(fēng)膠囊組比較，紫草素高劑量組小鼠涂藥部位、非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠毛發(fā)脫色評(píng)分比較（分，±s，n＝12）

表2 各組小鼠毛發(fā)脫色評(píng)分比較（分，±s，n＝12）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與紫草素低劑量組比較，△P＜0.05； 與紫草素中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分對(duì)照組0±00±0模型組4.25±0.67*2.00±0.43*紫草素低劑量組2.75±0.52＃1.42±0.16＃紫草素中劑量組1.42±0.31＃△0.75±0.08?！髯喜菟馗邉┝拷M0.42±0.05?！鳌?.08±0.03?！鳌遵帮L(fēng)膠囊組0.50±0.10＃△▲0.17±0.04?！鳌?/p>

3.2 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠皮膚病理組織學(xué)和黑素細(xì)胞的影響 對(duì)照組小鼠皮膚組織表皮無(wú)增生，含有大量黑色素毛囊及基底層黑素細(xì)胞； 與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮膚組織表皮增生，黑色素毛囊及基底層黑素細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05）； 與模型組比較，紫草素各劑量組小鼠皮膚組織表皮增生減輕，黑色素毛囊及基底層黑素細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05），并呈劑量依賴性； 與白癜風(fēng)膠囊組比較，紫草素高劑量組小鼠皮膚組織表皮增生程度相似，黑色素毛囊、基底層黑素細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖1、表3。

圖1 各組小鼠皮膚組織HE 染色（×200）

表3 各組小鼠黑色素毛囊、基底層黑素細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，±s，n＝12）

表3 各組小鼠黑色素毛囊、基底層黑素細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，±s，n＝12）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與紫草素低劑量組比較，△P＜0.05； 與紫草素中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別黑色素毛囊數(shù)基底層黑素細(xì)胞數(shù)對(duì)照組112.06±17.34143.37±20.02模型組38.52±6.12*58.86±8.78*紫草素低劑量組65.42±7.54＃80.92±10.61＃紫草素中劑量組85.23±10.07?！?07.75±12.07＃△紫草素高劑量組109.58±12.19?！鳌?40.83±18.04?！鳌遵帮L(fēng)膠囊組108.06±11.94?！鳌?38.96±17.47?！鳌?/p>

3.3 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠血清α-MSH、TYR 水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清α-MSH、TYR 水平降低（P＜0.05）； 與模型組比較，紫草素各劑量組小鼠血清α-MSH、TYR 水平升高（P＜0.05），并呈劑量依賴性； 與白癜風(fēng)膠囊組比較，紫草素高劑量組小鼠血清α-MSH、TYR 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠血清α-MSH、TYR 水平比較（μg/L，±s，n＝6）

表4 各組小鼠血清α-MSH、TYR 水平比較（μg/L，±s，n＝6）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與紫草素低劑量組比較，△P＜0.05； 與紫草素中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別α-MSHTYR對(duì)照組24.03±2.1092.67±7.08模型組13.95±1.02*60.02±3.42*紫草素低劑量組16.73±1.25＃70.43±4.10＃紫草素中劑量組20.44±1.46?！?1.98±4.23＃△紫草素高劑量組23.78±1.43?！鳌?1.41±3.94?！鳌遵帮L(fēng)膠囊組23.57±1.50?！?0.76±4.05＃△▲

3.4 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例升高（P＜0.05）； 與模型組比較，紫草素各劑量組小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性； 與白癜風(fēng)膠囊組比較，紫草素高劑量組小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例比較（±s，n＝6）

表5 各組小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例比較（±s，n＝6）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與紫草素低劑量組比較，△P＜0.05； 與紫草素中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別Th17 細(xì)胞比例/%對(duì)照組1.13±0.09模型組3.45±0.31*紫草素低劑量組2.76±0.28＃紫草素中劑量組1.98±0.20?！髯喜菟馗邉┝拷M1.25±0.19?！鳌遵帮L(fēng)膠囊組1.30±0.13＃△▲

3.5 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠血清IL-23、IL-17 水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清因子IL-23、IL-17 水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，紫草素各劑量組小鼠血清IL-23、IL-17 水平降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性； 與白癜風(fēng)膠囊組比較，紫草素高劑量組小鼠血清IL-23、IL-17水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)表6。

表6 各組小鼠血清IL-23、IL-17 水平比較（ng/L，±s，n＝6）

表6 各組小鼠血清IL-23、IL-17 水平比較（ng/L，±s，n＝6）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與紫草素低劑量組比較，△P＜0.05； 與紫草素中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別IL-23IL-17對(duì)照組123.00±8.74112.16±9.05模型組273.51±21.23*227.38±15.81*紫草素低劑量組227.64±15.41＃190.95±12.63＃紫草素中劑量組187.21±10.73＃△154.72±10.78?！髯喜菟馗邉┝拷M130.05±12.42?！鳌?19.84±9.47?！鳌遵帮L(fēng)膠囊組134.58±11.92＃△▲122.91±10.04?！鳌?/p>

3.6 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）； 與模型組比較，紫草素各劑量組小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性； 與白癜風(fēng)膠囊組比較，紫草素高劑量組小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)表7。

表7 各組小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)比較（±s，n＝12）

表7 各組小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)比較（±s，n＝12）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與紫草素低劑量組比較，△P＜0.05； 與紫草素中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別IL-23/β-actinIL-17/β-actin對(duì)照組1.01±0.170.97±0.13模型組3.62±0.34*3.43±0.30*紫草素低劑量組2.75±0.27＃2.65±0.28＃紫草素中劑量組1.92±0.22?！?.90±0.20?！髯喜菟馗邉┝拷M1.10±0.19?！鳌?.09±0.16?！鳌遵帮L(fēng)膠囊組1.15±0.24＃△▲1.13±0.25?！鳌?/p>

4 討論

目前白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制還未得到明確闡釋，研究者認(rèn)為環(huán)境因素、遺傳因素、外傷、心理因素、自身免疫失衡等均與白癜風(fēng)發(fā)生有關(guān)。激素治療、手術(shù)與激光治療在臨床得到廣泛應(yīng)用，但療效并不顯著，且費(fèi)用高昂，副作用較多，因此探尋安全有效的治療方法是臨床迫切所需［13-14］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)背部脫毛區(qū)均勻涂抹2.5%氫醌軟膏的方法構(gòu)建白癜風(fēng)模型小鼠，結(jié)果顯示，建模小鼠皮膚組織表皮增生，涂藥部位和非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分、血清IL-23 及IL-17水平、皮膚組織IL-23 及IL-17 mRNA 表達(dá)升高，表明氫醌軟膏可誘導(dǎo)促炎因子大量合成釋放，引發(fā)炎癥，造成毛發(fā)脫色。α-MSH 是垂體產(chǎn)生的一種激素，可促進(jìn)黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素，而TYR 是調(diào)控黑色素合成的關(guān)鍵酶，血清α-MSH、TYR 水平可反映黑素細(xì)胞功能［9，15］。本研究結(jié)果顯示，模型小鼠黑色素毛囊及基底層黑素細(xì)胞數(shù)、血清α-MSH、TYR 水平降低，表明氫醌軟膏可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞死亡，破壞其功能。以上結(jié)果提示白癜風(fēng)小鼠模型建立成功。

紫草素是提取自紫草的天然藥物成分，還是治療白癜風(fēng)的中藥制劑白癜風(fēng)膠囊中含有的重要活性成分，可抑制促炎因子表達(dá)，促使抗炎因子表達(dá)，緩解人牙髓細(xì)胞炎癥，對(duì)銀屑病、白癜風(fēng)等多種皮膚病具有較明顯的治療作用［7-8，16-17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以不同劑量紫草素處理白癜風(fēng)模型小鼠，能減輕小鼠皮膚組織表皮增生，降低涂藥部位和非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分、血清IL-23 及IL-17 水平，升高黑色素毛囊及基底層黑素細(xì)胞數(shù)、血清α-MSH 及TYR水平，且呈劑量依賴性，表明紫草素可抑制促炎因子表達(dá)合成，減輕炎癥，緩解黑素細(xì)胞功能損傷，改善小鼠毛發(fā)脫色情況，且在一定劑量范圍內(nèi)，紫草素劑量越高，作用越強(qiáng)。

白癜風(fēng)是一種自身免疫性炎癥疾病，免疫細(xì)胞Th17 的激活分化與其發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)。研究顯示，白癜風(fēng)患者體內(nèi)Th17 細(xì)胞數(shù)量增加，皮膚組織Th17 細(xì)胞因子IL-17 水平也升高，IL-23 是調(diào)控Th17 細(xì)胞活化的重要炎性因子，能刺激Th17 細(xì)胞激活，促使其生成促炎因子IL-17，引發(fā)黑素細(xì)胞受損，導(dǎo)致白癜風(fēng)，因而IL-23/Th17 軸可作為白癜風(fēng)的一個(gè)防治靶點(diǎn)［3-6，18-20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白癜風(fēng)模型小鼠外周血中Th17 細(xì)胞比例、皮膚組織IL-23 及IL-17 mRNA 表達(dá)升高； 經(jīng)紫草素給藥后，其外周血中Th17 細(xì)胞比例、皮膚組織IL-23 及IL-17 mRNA 表達(dá)降低，表明IL-23/Th17 軸參與介導(dǎo)白癜風(fēng)的發(fā)病過(guò)程，紫草素可阻止IL-23/Th17 通路激活，抑制免疫T 細(xì)胞向Th17 分化，降低炎性因子IL-23、IL-17 表達(dá)釋放，減輕白癜風(fēng)小鼠脫色癥狀。

綜上所述，紫草素可下調(diào)IL-23、IL-17 表達(dá)，抑制免疫Th17 細(xì)胞活化，降低其比例，減輕黑素細(xì)胞炎癥損傷，改善其功能，促進(jìn)黑色素合成，緩解白癜風(fēng)小鼠脫色癥狀，阻斷IL-23/Th17 信號(hào)傳導(dǎo)可能是其藥理機(jī)制之一。但本實(shí)驗(yàn)未通過(guò)上調(diào)和下調(diào)該信號(hào)進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，后續(xù)會(huì)對(duì)其藥理機(jī)制進(jìn)行深入探討。