王梅 譚金枚

胰島β細胞質量和功能的逐漸下降是2型糖尿病的關鍵原因[1]。β細胞質量和功能對于維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)至關重要,而葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損會導致糖尿病的進展[2]。但是,β細胞功能和質量的持續(xù)喪失無法通過現(xiàn)有的治療干預方案(節(jié)食、運動,甚至降血糖藥物)停止和逆轉[3]。因此,保護胰島β細胞是預防糖尿病的有效途徑。炎癥是β細胞功能障礙的病理組成部分,炎性細胞因子的升高可能會導致β細胞異常[1]。大量的非編碼RNA,如環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)參與各種疾病。與線性RNA不同,circRNA是一類具有封閉結構、高穩(wěn)定性的新型非編碼RNA[4]。許多學者已經(jīng)鑒定并揭示了circRNA在包括糖尿病在內的許多疾病中扮演的關鍵角色[5,6]。一些circRNA可以干擾miRNA及其靶基因水平,從而以多種方式在多種疾病中發(fā)揮作用。Qiu等[7]首次研究報告了一種來自3q26.2位點的新型circRNA,circPRKCI,它在肺腺癌組織中過度表達,充當miR-545和miR-589的海綿促進肺腺癌的增殖和腫瘤發(fā)生。此外,circPRKCI通過靶向不同的miRNA,減輕脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的HK2細胞[7]或過氧化氫誘導的神經(jīng)元細胞[8]損傷。許多miRNA已被證明在糖尿病病理學中至關重要[9]。據(jù)報道,缺血再灌注損傷后心肌細胞中miR-448上調[10],提示miR-448與細胞損傷有關。然而,迄今為止,circPRKCI和miR-448對高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷的影響和功能機制筆者尚未見報道。鑒于此,本研究假設circPRKCI可以通過與miR-448的相互作用來緩解糖尿病胰島β細胞損傷,利用高脂高糖損傷胰島β細胞的體外模型,對circPRKCI和miR-448進行上調或下調以鑒定二者在糖尿病胰島β細胞損傷中的特定功能和作用。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠胰島β細胞株MIN6(上海信裕),棕櫚酸、Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細胞凋亡檢測試劑盒(美國Sigma),circPRKCI過表達載體(pcDNA-circPRKCI)、pcDNA、circPRKCI沉默載體(si-circPRKCI)、si-NC、anti-miR-NC、miR-448抑制劑(anti-miR-488)、miR-NC、miR-448模擬物(上海GenePharma),抗鼠活化-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase,cleaved-caspase)3抗體、cleaved-caspase9抗體、IgG二抗(美國Abcam),Mir-miRNA First-Strand Synthesis Kit、PrimeScript RT試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒(大連Takara)。

1.2 細胞培養(yǎng)與高脂高糖損傷 胰島β細胞在37℃和5% CO2環(huán)境下保持在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長。為了建立高脂高糖模型,將胰島β細胞暴露于含33.3 mmol/L葡萄糖和0.25 mmol/L棕櫚酸的培養(yǎng)基中保持48 h[11]。

1.3 實驗分組 分為Con組(11.1 mmol/L葡萄糖)、Model組(高脂高糖模型,33.3 mmol/L 葡萄糖+0.25 mmol/L棕櫚酸)、Model+pcDNA組(高脂高糖模型+轉染pcDNA)、Model+pcDNA-circPRKCI組(高脂高糖模型+轉染pcDNA-circPRKCI)、Model+anti-miR-NC組(高脂高糖模型+轉染anti-miR-NC)、Model+anti-miR-488組(高脂高糖模型+轉染anti-miR-488)、Model+pcDNA-circPRKCI+miR-NC組(高脂高糖模型+轉染pcDNA-circPRKCI+miR-NC)、Model+pcDNA-circPRKCI+miR-448組(高脂高糖模型+轉染pcDNA-circPRKCI+miR-448)。將胰島β細胞以2×104個/孔接種到6孔板中,由Lipofectamine 2000試劑進行pcDNA、pcDNA-circPRKCI、anti-miR-NC、anti-miR-488、miR-NC、miR-448模擬物轉染,24 h后建立高脂高糖模型。收集處理結束后的胰島β細胞進行評價。

1.4 qRT-PCR檢測 circPRKCI、miR-448、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) mRNA和白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β) mRNA表達來自不同處理胰島β細胞的總RNA通過Trizol試劑獲得。RNA的逆轉錄采用Mir-miRNA First-Strand Synthesis Kit或PrimeScript RT試劑盒進行,得到cDNA。PCR采用SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒進行。U6和GAPDH用作內部對照。選擇2-ΔΔCt方法來評估數(shù)據(jù)。序列為circPRKCI F:5'-ATTCAGGGACACCCGTTCTT-3',R:5'-CTCTTCAGAACACTTGCAGCTT-3';miR-448 F:5'-CCCGCACGATTTCATTGAAC-3',R:5'-GAAGTCTGGGAATCGATCTGG-3'；TNF-α F:5'-CAGGGGCCACCACGCTCTTC-3',R:5'-CTTGGGGCAGGGGCTCTTGAC-3';IL-1β F:5'-TCCCTTCATCTTTGAAGAAGA-3',R:5'-GAGGCCCAAGGCCACAGG-3'。GAPDH F:5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3',R:5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3';U6 F:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',R:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒通過流式細胞儀FACSCalibur檢測胰島β細胞凋亡。胰島β細胞(1×106細胞/孔)用磷酸鹽緩沖液洗滌,用Annexin V-FITC和PI在37℃染色30 min。

1.6 Western blot檢測cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達 通過RIPA裂解緩沖液裂解胰島β細胞。接下來,在SDS-PAGE凝膠上分離后,將蛋白質樣品轉移到PVDF膜。然后,膜被封閉,并與抗鼠cleaved-caspase3(1∶1 000)、cleaved-caspase9(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶2 000)4℃過夜。與IgG二抗(1∶5 000)孵育后,通過增強化學發(fā)光檢測蛋白質水平。選擇Image Lab軟件量化每個抗體中的蛋白強度。

1.7 熒光素酶報告分析circPRKCI與miR-448的靶向結合 circPRKCI與miR-448的互補序列通過StarBase軟件預測。在轉染前將胰島β細胞接種到6孔板并培養(yǎng)至60%的密度。將野生型(WT)或突變型(MUT)circPRKCI片段克隆到psiCHECK-2熒光素酶載體,分別命名為WT-circPRKCI、MUT-circPRKCI。然后將miR-NC或miR-448模擬物與WT-circPRKCI或MUT-circPRKCI共轉染到胰島β細胞中,分別持續(xù)48 h。最后使用Dual-Glo熒光素酶測定系統(tǒng)測量熒光素酶活性。另在胰島β細胞中轉染pcDNA、pcDNA-circPRKCI、si-NC、si-circPRKCI,持續(xù)48 h以qRT-PCR檢測miR-448表達。

2 結果

2.1 circPRKCI和miR-448在高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷中的表達 高脂高糖誘導的胰島β細胞后,與Con組比較,Model組胰島β細胞中circPRKCI表達量減少,miR-488表達量增加(P<0.05)。見表1。

表1 circPRKCI和miR-448在高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷中的表達 n=9,

2.2 circPRKCI過表達對高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷的影響 與Con組比較,Model組胰島β細胞中circPRKCI表達量減少,凋亡率、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達量增加,TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達量也增加(P<0.05)。與Model+pcDNA組比較,Model+pcDNA-circPRKCI組胰島β細胞中circPRKCI表達量增加,凋亡率、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達量減少,TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達量也減少(P<0.05)。見圖1,表2。

圖1 circPRKCI過表達對高脂高糖誘導的胰島β細胞凋亡的影響;A 凋亡相關蛋白表達;B 細胞凋亡流式圖

表2 circPRKCI過表達對高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷的影響 n=9,

2.3 circPRKCI靶向調控miR-448的表達 基于StarBase軟件生物信息學預測,認為circPRKCI與miR-448靶向結合。WT-circPRKCI與miR-448模擬物共轉染后,相對熒光素酶活性比其與miR-NC共轉染時降低(P<0.05),而MUT-circPRKCI與miR-448模擬物或與miR-NC共轉染時相對熒光素酶活性無顯著差異(P=0.646)。此外,轉染pcDNA-circPRKCI的胰島β細胞的miR-488水平比轉染pcDNA降低,轉染si-circPRKCI后miR-488水平較轉染si-NC升高(P<0.05)。見圖2,表3、4。

圖2 circPRKCI的序列中含有與miR-448互補的核苷酸序列

表3 熒光素酶報告分析 n=9,

表4 circPRKCI調控miR-448的表達 n=9,

2.4 抑制miR-448表達對高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷的影響 抑制miR-448表達后,Model+anti-miR-488組胰島β細胞的miR-488表達量比Model+anti-miR-NC組減少約0.65倍,且凋亡率、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白、TNF-α mRNA和IL-1βmRNA表達量均比Model+anti-miR-NC組降低(P<0.05)。見圖3,表5。

圖3 抑制miR-448表達對高脂高糖誘導的胰島β細胞凋亡的影響;A 凋亡相關蛋白表達;B 細胞凋亡流式圖

表5 抑制miR-448表達對高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷的影響 n=9,

2.5 上調miR-448表達逆轉了circPRKCI過表達對高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷的作用 上調miR-448表達后,Model+pcDNA-circPRKCI+miR-448組胰島β細胞的miR-488表達量比Model+pcDNA-circPRKCI+miR-NC組增加約1.91倍,且凋亡率、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白、TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達量均比Model+pcDNA-circPRKCI+miR-NC組提升(P<0.05)。見圖4,表6。

圖4 上調miR-448表達逆轉了circPRKCI過表達對高脂高糖誘導的胰島β細胞凋亡的作用;A 凋亡相關蛋白表達;B 細胞凋亡流式圖

表6 上調miR-448表達逆轉了circPRKCI過表達對高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷的作用 n=9,

3 討論

2型糖尿病被認為是一種以胰島素抵抗和胰腺β細胞功能障礙為特征的慢性低度炎癥性疾病[12]。然而,潛在的分子機制仍不清楚。胰島β細胞是葡萄糖穩(wěn)態(tài)的中心調節(jié)劑,因此,胰島β細胞的功能調節(jié)一直是2型糖尿病研究的焦點[13]。本研究闡述了circPRKCI在高脂高糖處理的胰島β細胞中的病理生理作用。研究結果表明,circPRKCI在高脂高糖處理的胰島β細胞中顯著減少,高表達的circPRKCI可有效防止高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷。

最近的研究表明,circPRKCI在癌癥等中起著關鍵的重要作用[14,15]。此外,circPRKC1在LPS誘導的HK2細胞損傷中表達下調,過表達circPRKCI可減弱LPS誘導的HK2細胞中活力降低、細胞凋亡增加以及TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的產(chǎn)生增加,減輕其炎癥損傷[8,16]。Cheng等[9]揭示過氧化氫處理的SH-SY5Y神經(jīng)元細胞中circPRKCI的表達降低,而上調circPRKCI減弱了過氧化氫誘導的細胞死亡和細胞凋亡。Xiong等[17]在膿毒癥患者中觀察到circ-PRKCI表達降低,其具有預測膿毒癥患者28 d死亡風險的價值。這些證據(jù)強有力的表明circPRKCI在不同疾病發(fā)展中的重要作用。然而,筆者發(fā)現(xiàn)很少有研究調查circPRKCI在高脂高糖胰島β細胞損傷中的功能和機制。我們的研究發(fā)現(xiàn),circPRKCI在高脂高糖處理的胰島β細胞中下調。高表達的circPRKCI可以減輕胰島β細胞的細胞凋亡和炎癥損傷,這一點可通過高表達circPRKCI對凋亡蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達及炎性因子TNF-α和IL-1β表達的抑制作用來體現(xiàn)。其中胰島β細胞中的炎性因子(TNF-α、IL-1β)和細胞凋亡率已被證明在高脂高糖條件下大幅增加[18]。這些結果表明circPRKCI在高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷中發(fā)揮一定的保護作用。

對于circRNA,充當miRNA海綿是最常報道的功能模式。本研究中,在線預測和熒光素酶報告分析表明miR-448時circPRKCI的靶標,并且其表達受circPRKCI負向調控。大多數(shù)關于miR-448的研究都集中在癌癥研究上。例如,miR-448作為一種腫瘤抑制因子,在膠質瘤[19]、胰腺癌[20]、垂體腺瘤[21]等起作用。此外,先前的研究發(fā)現(xiàn)miR-448在調節(jié)性T細胞耗竭小鼠(自身免疫性疾病的代表性模型)和類風濕性關節(jié)炎患者中含量豐富,是顯著表達的miRNA之一[22]。miR-448在脊髓缺血再灌注損傷和缺氧誘導的神經(jīng)細胞損傷中上調,下調其表達可減輕脊髓缺血再灌注損傷[23]。miR-448在類風濕性關節(jié)炎大鼠滑膜組織中上調,miR-448的過表達能逆轉lncRNAOIP5-AS1抑制類風濕性關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞進展和炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6)的作用[24]。在本研究中,我們驗證了miR-448在高脂高糖損傷的胰島β細胞中上調。并且抑制miR-448表達后,細胞凋亡與凋亡蛋白、炎性因子TNF-α和IL-1β表達降低,表明抑制miR-448表達可以改善高脂高糖誘導的胰島β細胞損傷[25]。在此基礎上,我們進一步證實上調miR-448表達逆轉了高表達circPRKCI對高脂高糖作用下胰島β細胞凋亡和炎癥所產(chǎn)生的抑制作用,這一方面證明了miR-448在高脂高糖環(huán)境下胰島β細胞損傷中的重要作用,另一方面表明circPRKCI保護高脂高糖損傷胰島β細胞的效果與其靶向miR-448有關。

總之,本研究提供了新的證據(jù)表明circPRKCI可以減輕高脂高糖誘導的胰島β細胞凋亡和炎性因子表達,推測機制為通過靶向miR-448來減輕胰島β細胞的高脂高糖損傷。這些發(fā)現(xiàn)擴展了對circRNA功能的理解,并可能為治療糖尿病胰島β細胞損傷提供新的見解。