王春慶 王佳瑤

骨質(zhì)疏松（Osteoporosis，OP）是目前威脅人類健康的重大疾病之一。2000 年全世界60 歲以上男性和女性患者共有約3.5 億，預計至2025 年全世界患病人數(shù)將增加到6.5 億，發(fā)生骨折的風險率女性為30%～40%，男性為13%，且每年發(fā)生脆性骨折的患者達到千萬例[1]。最新統(tǒng)計資料顯示，2016 年我國60 周歲及以上人口達2.1 億，占總?cè)丝诘?5.5%，65 周歲及以上人口1.3 億，占總?cè)丝诘?0.1%。我國骨質(zhì)疏松癥患者近9 000 萬，每年因此花費的醫(yī)療費用高達150 億元[1]。目前，骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制還是未完全揭示，并且有效地治療骨質(zhì)疏松的手段和藥物仍缺乏[2]。骨質(zhì)疏松骨折發(fā)生后嚴重威脅老年人健康，致死率和致殘率較高，但臨床預防和治療手段仍有待提高[3]。

骨代謝失調(diào)是骨質(zhì)疏松的發(fā)病基礎(chǔ)，骨代謝的調(diào)節(jié)機制復雜，受多種因素影響。近年研究發(fā)現(xiàn)MicroRNAs（miRNAs）是一類長約20～25 個核苷酸的非編碼RNA，許多骨代謝相關(guān)基因受其調(diào)節(jié)，miRNAs 與靶基因的3'UTR 結(jié)合，影響mRNA 穩(wěn)定性和抑制蛋白的翻譯[4，5]，從而影響成骨細胞、破骨細胞增殖和分化，導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。以往研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者血清與骨組織中miR-144-3p表達下調(diào)，并通過細胞實驗證實miR-144-3p 能夠靶向調(diào)節(jié)RANK 從而抑制破骨細胞的增殖和分化[6]。miR-144-3p 參與破骨細胞代謝，但能否作為治療靶點尚需驗證。本實驗以潑尼松龍誘導制作骨質(zhì)疏松斑馬魚動物模型，以miR-144-3p 模擬物（miR-144-3p mimic）為干預措施，檢測骨質(zhì)疏松斑馬魚骨量及骨密度變化，觀察miR-144-3p mimic對動物骨質(zhì)疏松的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 Tuebingen 系野生型（WT）斑馬魚由貴州醫(yī)科大學組織工程與干細胞實驗中心提供。

1.1.2 實驗試劑 2×Taq Master Mix（貨號：pr1701北京百泰克）；FastQuant RT Kit（With gDNase）試劑盒（貨號：KR106 天根）；TRI reagent（貨號：1382739 Invitrogen）；氯仿（貨號：T130144 阿拉?。?；無水乙醇（貨號：E111963 阿拉?。?；異丙醇（貨號：A507048 上海生工）；潑尼松龍（貨號：HY-17463 MedChemExpress）；茜素紅（貨號：130223 索萊寶）；miR-144-3p mimic（Forward：TACAGTATAGATGATGTAC，Revers：GTACATCATCTATACTGTA）和miR-144-3p mimic Negative Control（CTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTACA）均由廣東銳博生物科技公司合成。

1.1.3 主要儀器 斑馬魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生科技發(fā)展有限公司）；顯微注射儀（美國，HARVARD ASTP）；解剖顯微鏡（日本，SZX7，OLYMPUS）；體視顯微鏡（日本，SMZ645）；普通PCR 擴增儀（T100，Bio-RAD）；熒光定量PCR 儀（美國，Bio-RAD）；-20℃冰箱（中國，Haier）、光學粘性封膜 B（MSB1001，Bio-RAD）、低位裙邊96 孔板（透明）、iTaq Universal SYBR Green Supermix（1725121，Bio-RAD）、Epp 管；載玻片、移液槍。

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚胚胎獲取 按雌雄1:2 比例選取斑馬魚成魚，置于水溫28.5℃的交配缸中分隔，每日光/暗時間控制在12h:12h，胚胎獲取日拔除隔板，供雌雄交配。交配30min 后收取胚胎至胚胎營養(yǎng)液（Eggwater），此時胚胎大約為1～2 細胞期，按2～3 次/日更換Eggwater。胚胎置于28.5℃恒溫箱中。

1.2.2 顯微注射 加熱拉制顯微注射針頭，在解剖顯微鏡視野中找到整齊排列的胚胎，調(diào)準焦距，尋找1～2 細胞期胚胎，使針尖對準胚胎胎膜，旋轉(zhuǎn)推進旋鈕，快速將針頭從胚胎卵黃通過抵達細胞質(zhì)中，注射體積為每胚胎1nL。

1.2.3 實時熒光定量PCR（q-PCR）測定 取斑馬魚胚胎置于Epp 管中，使用經(jīng)典Trizol 法，收集沉淀RNA，冰上靜置10min，待乙醇揮發(fā)完后加入50μL DEPC，電泳檢查RNA 完整性。利用Thermo超微量分光光度計對總RNA 濃度和純度進行測定。取斑馬魚總RNA 1μL，參考逆轉(zhuǎn)錄反應體系合成cDNA 第一鏈。取cDNA 樣本稀釋8 倍，加入miR-144-3p 莖環(huán)引物，配制反應混合液，設置一定的PCR 循環(huán)條件，將液體置于96 孔板上并將其放置在熒光定量PCR 儀中進行反應。記錄CT值，用CT 值計算相對熒光定量（2-△△CT）。使用U6（Forward：TCGCTACGGTGGCACATA，Reverse：TATGGAGCGCTTCACGG）作為基因表達的內(nèi)參，計算miR-144-3p 的相對表達量。

1.2.4 潑尼松龍液的配置 精密稱取潑尼松龍白色粉末45.2mg，加入6.5mL DMSO 后混勻，加Eggwater定容至50mL，得2 500μmol/L 的潑尼松龍儲備液。取1mL 潑尼松龍儲備液加入99mL Eggwater，獲得25μmol/L 的潑尼松龍液，配置后置4℃冰箱避光保存。

1.2.5 茜素紅染液的制備 精密稱取125mg 茜素紅粉末，充分研磨，加入95%酒精25mL，充分混勻至肉眼無沉淀，即得橙紅色0.5%茜素紅溶液；稱取KOH 白色晶體175mg，溶于25mL ddH2O，得0.7%KOH 溶液；0.5%茜素紅溶液和0.7% KOH 溶液按照1:250 的比例混合，得藍紫色茜素紅染液，常溫避光放置。

1.2.6 骨骼染色與分析方法 將斑馬魚幼魚在4%多聚甲醛中浸泡固定，甲醛洗滌，并放置于-20℃冰箱內(nèi)約2h 脫水。甲醇溶液中復水5min 后，加入配置好的茜素紅染液常溫染色2h，觀察組織顏色。骨骼面積統(tǒng)計方法采用Image pro plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件計算，只統(tǒng)計被茜素紅染色的鈣化基質(zhì)區(qū)域的面積和累積光密度值（IOD）。

1.3 實驗步驟

1.3.1 確定miR-144-3p mimic 的最大檢測劑量（MTD）實驗分11 組：正常對照組，miR-144-3p mimic 0.005、0.01、0.02、0.04、0.08pmoL/尾組，mimic negative control 0.005、0.01、0.02、0.04、0.08pmoL/ 尾組。通過顯微注射不同試驗劑量，每組處理30 枚1～2 細胞期斑馬魚胚胎，每天 3 次（9:00、16:00、23:00），觀察記錄斑馬魚的生長發(fā)育及死亡情況，統(tǒng)計各組的斑馬魚死亡數(shù)量并在顯微鏡下觀察斑馬魚心包水腫和每分鐘心率情況。

1.3.2 骨質(zhì)疏松模型建立 實驗分5 組：空白對照組、mimic negative control 組（顯微注射mimic negative control MTD）、mimic 組（顯微注射miR-144-3p mimic MTD）、mimic+潑尼松龍組（顯微注射miR-144-3p mimic MTD，并在Eggwater 培養(yǎng)4dpf 后將培養(yǎng)液更換為潑尼松龍液）、潑尼松龍組（Eggwater 培養(yǎng) 4dpf 后將培養(yǎng)液更換為潑尼松龍液）。mimic+潑尼松龍組和潑尼松龍組每天更換潑尼松龍液2 次（9:00，21:00），空白對照組、mimic negative control 組和mimic 組的Eggwater 以相同時間每天更換2 次。10dpf 時，用100mg/mL MS-222 麻醉劑處死各組斑馬魚幼魚，并分別使用4%多聚甲醛固定，每組處理30 枚1～2 細胞期斑馬魚胚胎。

1.4 統(tǒng)計學方法每組數(shù)據(jù)的均值和標準差均使用Excel 軟件計算，運用方差分析和Dunnett's T 檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05 表明差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.001 表明差異具有極顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-144-3p mimic 最大耐受劑量（MTD）的測定在使用miR-144-3p mimic MTD 摸索實驗中，發(fā)現(xiàn)0.08pmol/ 尾的miR-144-3p mimic 誘發(fā)13 尾斑馬魚出現(xiàn)心包水腫，發(fā)生率為43.3%，其心率為（39.186±19.524）次/min，較其他組明顯減緩（P＜0.05）；而0.08pmoL/尾的mimic negative control誘發(fā)12 尾斑馬魚出現(xiàn)心包水腫，發(fā)生率為40.0%，其心率為（37.142±14.253）次/min，較其他組也明顯減緩（P＜0.05）；正常對照組與其他各實驗組斑馬魚的心包水腫發(fā)生率和心率變化情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗結(jié)果表明，引起斑馬魚幼魚毒性的半數(shù)致死濃度量為0.08pmol/尾，所以我們選用最適藥物濃度及最大檢測計量為半數(shù)致死量的一半，為0.04pmol/尾，mimic negative control組的劑量也為0.04pmol/尾。見表1。

表1 斑馬魚幼魚心率和心包水腫情況（n=30）

2.2 胚胎顯微注射miR-144-3p mimic 對斑馬魚體內(nèi)miR-144-3p 表達量的影響通過基因相對表達量公式計算36、72hpf 的miR-144-3p 表達量，注射0.04pmol/尾miR-144-3p mimic 至斑馬魚胚胎中，miR-144-3p 的表達增多。36hpf 時，含量是正常對照組的12 倍，而72hpf 時則是正常對照組的8 倍。見圖1。

圖1 36、72hpf 時miR-144-3p 相對表達量

2.3 miR-144-3p mimic 對骨質(zhì)疏松斑馬魚骨量、骨密度的影響挑選出放大400 倍（見圖2）的斑馬魚骨染色圖片并使用Image pro plus 6.0 軟件計算每尾幼魚圖片中骨染色面積之和，即骨礦化量和骨密度。其中mimic 組的骨染色面積最高，潑尼松龍組的最低，mimic+潑尼松龍組較潑尼松龍組染色面積相對增高（P＜0.05）。不同組的染色面積與IOD 變化趨勢一致，提示骨染色面積與骨密度呈現(xiàn)相同趨勢（見圖3、4）。

圖2 各組斑馬魚骨染色圖（×400）

圖3 各組的骨礦化面積

圖4 各組的IOD

3 討論

目前關(guān)于miRNAs 的研究越來越多，大量研究證實miRNAs 能通過某些途徑有效地影響骨代謝[7～10]。以往的研究顯示miR-144-3p 參與多種腫瘤細胞增殖與分化[8，11]，證明miR-144-3p 是細胞代謝的重要調(diào)節(jié)分子，在細胞代謝過程中扮演重要角色[12，13]。

以往我們的研究證實，miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-100，miR-125b 和miR-122a 5 個miRNAs 的表達相對于正常組，在骨質(zhì)疏松組的血清和骨組織樣品中的表達都是升高的，另外，miR-144-3p 相對于正常組，在骨質(zhì)疏松組血清和骨組織樣品中的表達都是降低的[14]。人體組織研究證實在骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中miRNAs 異常表達，但是否在發(fā)病中起重要作用，是否能作為治療切入點還需進一步研究。

Fleming 等[15]對斑馬魚的生存環(huán)境進行加藥處理，通過觀察斑馬魚的骨骼發(fā)育情況，證明斑馬魚可以作為研究藥物對骨骼發(fā)育情況的模式動物。本實驗利用25μmol/L 的潑尼松龍液飼養(yǎng)斑馬魚，利用茜素紅染色發(fā)現(xiàn)成功制作骨質(zhì)疏松斑馬魚動物模型。試驗周期短，成功率較高，是一種理想的研究骨質(zhì)疏松的動物模型。

本實驗通過毒理實驗發(fā)現(xiàn)，大劑量的miR-144-3p mimic 會引起幼魚出現(xiàn)心包水腫、心率減慢、心包畸形及死亡的現(xiàn)象，所以選取最合適的劑量是開展本實驗的首要條件。最終，我們選擇0.04pmol/尾為最合適的用藥濃度。檢測了實驗組36hpf 和72hpf時的miR-144-3p 的相對表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個時間點的表達量較正常對照組增高，表明我們的干預是有效果并產(chǎn)生作用的，證明miR-144-3p mimic可以作為干預措施應用于生物體內(nèi)。

茜素紅與鈣離子發(fā)生顯色反應是茜素紅染色的基本原理，是研究成骨分化的有效方法。顯微注射miR-144-3p mimic 后骨質(zhì)疏松斑馬魚茜素紅染色顯色反應加重，提示骨量增加，直接說明miR-144-3p mimic 對骨質(zhì)疏松斑馬魚的治療作用。

綜上所述，miR-144-3p mimic 干預能顯著增加骨質(zhì)疏松斑馬魚骨量和骨密度，證實了miR-144-3p mimic 在動物體內(nèi)對骨質(zhì)疏松治療有效，可作為治療骨質(zhì)疏松的藥物進行進一步研究。