許雅潔，張怡洋，3，劉 陽，薛林貴，章高森

（1.蘭州交通大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室，蘭州 730000；3.中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院/沙漠與沙漠化重點實驗室，蘭州 730000；4.中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院/冰凍圈科學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730000；5.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

苯酚是一種具有強毒性且難去除的工業(yè)污染物，是從工業(yè)過程中排放出來的，如紡織加工、煤氣化、煉油、皮革制造、樹脂合成、香水生產(chǎn)等［1-5］。苯酚具有毒性、致突變性和致癌性，對環(huán)境有嚴(yán)重的破壞作用［6］。由于大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用，苯酚不可避免地被引入水或土壤環(huán)境，造成水體和土壤污染，由于其毒性大，即使在低濃度下也可能構(gòu)成嚴(yán)重的生態(tài)危害。苯酚及酚類化合物對水體的污染主要以焦化廢水為主（焦化廢水是指化工類企業(yè)在工業(yè)加工過程中產(chǎn)生的高毒性、高污染廢水），其主要來源于生產(chǎn)煤和汽油的企業(yè)，以及加工液化氣、運輸制冷等過程。同時化工廠附近的土壤也會受到一定程度的污染，進(jìn)而污染農(nóng)作物及其制作的食品，最終危害人類健康。苯酚不僅在環(huán)境中具有明顯的累積效應(yīng)，而且容易與其他有機化合物共存形成新的復(fù)合污染物，或在水中發(fā)生取代或其他化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為比苯酚毒性更高的酚類化合物，如氯酚、甲基酚和烷基酚等，而且在生物體內(nèi)難以分解。酚類化合物的毒性隨結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)的不同而變化，這些物質(zhì)的頑固性和持久性更大，增加了對苯酚污染治理的難度，間接增加了對人體的危害程度［7，8］。

苯酚作為重要的有機化工原料和工業(yè)商品，生產(chǎn)的相關(guān)下游產(chǎn)品涉及人們生活的很多方面，如可生產(chǎn)作為汽車外殼涂料的雙酚A 以及生產(chǎn)為水楊酸［7］。此外，苯酚還可用作溶劑、試驗試劑和消毒劑等，如作為具有殺菌特性的乳膏和剃須皂，或被用作內(nèi)部防腐劑和胃麻醉劑。因此，苯酚在染料、制藥、化肥、塑料、玻璃纖維、食品工業(yè)和石化等各種行業(yè)都有應(yīng)用［9，10］。2019 年，全球苯酚需求量約為1 200 萬t，預(yù)計未來需求量還會增加。隨著中國經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，國內(nèi)產(chǎn)業(yè)對苯酚的需求也在不斷上升，2016—2021 年中國苯酚消費量呈穩(wěn)步增長態(tài)勢，2021 年中國苯酚表觀消費量為367.3 萬t，依據(jù)往年增長速率預(yù)計2023 年中國苯酚表觀消費量將達(dá)到400 萬t 以上［11，12］。因此，苯酚污染問題將一直存在，并越來越受到人們的重視，如何綠色高效地解決苯酚污染問題變得非常迫切。

處理含酚廢水的常見物理、化學(xué)方法有臭氧氧化、芬頓反應(yīng)、紫外輻照和過氧化氫處理等，但這些方法成本高、對環(huán)境有害，且不適用于大量廢水［13，14］。與物理化學(xué)方法相比，生物修復(fù)法具有經(jīng)濟(jì)可行性、環(huán)境友好性和實際可操作性等優(yōu)點，更具應(yīng)用前景［15-17］。本研究從細(xì)菌、真菌、微藻降解苯酚污染的研究進(jìn)展、降解機制、影響因素以及降解技術(shù)優(yōu)化等方面進(jìn)行探討，為探索出綠色、高效解決苯酚污染的方法提供參考和依據(jù)。

1 微生物降解苯酚代謝機制

由于苯酚結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作為有毒有害的外源物質(zhì)很難分解，然而，微生物能夠利用這些外源性物質(zhì)進(jìn)行生長［18］。微生物可以產(chǎn)生多種酶并代謝這些有害和有毒物質(zhì)。苯酚降解菌對苯酚的降解分為好氧降解和厭氧降解2 種，大多數(shù)情況下為好氧降解且苯酚降解菌的好氧代謝途徑較為復(fù)雜。苯酚降解過程中使用的酶包括水解酶、鄰苯二酚雙加氧酶、順式粘糠酸內(nèi)酯酶等［10］。國內(nèi)外的研究者進(jìn)行了大量試驗來分離和培養(yǎng)具有高苯酚降解活性的微生物。

細(xì)菌中苯酚有氧代謝路徑主要研究的是羥基化途徑：苯酚羥化酶（E1）將苯酚（Phenol）轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚（Catechol），這是細(xì)菌中好氧分解代謝苯酚的第一步。鄰苯二酚是細(xì)菌中各種芳香族化合物有氧分解代謝的外圍途徑的重要中間產(chǎn)物［19］。鄰苯二酚通過芳香環(huán)在2 個不同方向上的斷裂而被氧化［20-22］，因此氧化途徑分為2 種［23］。①在鄰苯二酚1，2-雙加氧酶（E2）催化下進(jìn)行鄰位開環(huán)途徑，生成順，順-粘康酸，之后轉(zhuǎn)化為β-酮己二酸，通過β-酮己二酸途徑轉(zhuǎn)化為三羧酸循環(huán)的中間物質(zhì)琥珀酸與乙酰輔酶A，最后進(jìn)入三羧酸循環(huán)完成苯酚的代謝，提供生物體生長繁殖所需的物質(zhì)和能量。②在鄰苯二酚2，3-雙加氧酶（E3）催化下間位開環(huán)途徑生成2-羥基粘糠半醛，進(jìn)而在多種酶的催化作用下逐步轉(zhuǎn)化為4-羥基-α-酮基戊酸，最終轉(zhuǎn)化為乙酸和丙酮酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)［24，25］，實現(xiàn)苯酚的完全降解（圖1）。

圖1 微生物好氧降解苯酚途徑

2 微生物降解苯酚的研究進(jìn)展

2.1 細(xì)菌降解苯酚

國內(nèi)外研究者分離了大量苯酚降解細(xì)菌，對已報道的苯酚降解細(xì)菌的種屬及名稱、分離源、對苯酚的降解能力及降解時間進(jìn)行了歸納分析。降解苯酚的細(xì)菌多數(shù)分離自焦化廢水以及活性污泥等苯酚污染嚴(yán)重的場所。經(jīng)過鑒定這些苯酚降解菌大多數(shù)為變形菌門的假單胞菌屬、不動桿菌屬，厚壁菌門的芽孢桿菌屬，放線菌門的紅球菌屬以及節(jié)桿菌屬。細(xì)菌對苯酚的降解濃度最高可達(dá)3 000 mg/L，但實現(xiàn)降解率為100%時，苯酚濃度一般不高于1 800 mg/L（表1）。

除了單一細(xì)菌對苯酚的降解，多種細(xì)菌協(xié)同作用降解苯酚的研究也較多。Li 等［71］研究了Stenotrophomonassp.N5 和Advenellasp.B9（9∶1）共培養(yǎng)對苯酚降解產(chǎn)生的協(xié)同機制，2 個菌株之間的相互作用降低了苯酚引起的抑制作用，與單菌株比較降解能力增強，在72 h內(nèi)可完全降解高達(dá)1 200 mg/L的苯酚。

聯(lián)合菌群MR-01 是從石油污染的土壤中分離出來的，能夠在8 d 后降解59%的原油成分，130 d 后降解34%的燃油成分［72］。這些底物的存在改變了聯(lián)合菌群的代謝功能，影響了種群結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了物種分化。聯(lián)合體中的結(jié)構(gòu)和代謝的修飾改變是重要的生存策略，在降解不同環(huán)境污染物方面具有優(yōu)勢。因此，將MR-01 在亞致死濃度的苯酚（874 mg/L）中適應(yīng)90 d 后，馴化的MR-01 培養(yǎng)物在含有不同濃度苯酚（94、282、459、686、874 mg/L）的培養(yǎng)基中生長。結(jié)果表明，隨著苯酚初始濃度的增加，苯酚降解量增加；最終MR-01 在874 mg/L 的苯酚濃度下48 h 后達(dá)到最大降解率87%［73］。

2.2 真菌降解苯酚

在苯酚降解菌中，真菌約占25%，其中以酵母菌為主［74］。如從污水處理廠曝氣池中分離得到1 株苯酚降解真菌GY8，鑒定為假絲酵母菌屬（Candidasp.）。該菌株72 h 內(nèi)可以完全降解初始濃度為1 g/L 的苯酚，并且在以苯酚為惟一碳源的培養(yǎng)條件下苯酚耐受濃度最高可達(dá)1.8 g/L［75］。丁杰等［76］從含酚廢水處理池污泥中馴化出假絲酵母菌FD-1，可以在30 h內(nèi)將1 500 mg/L 濃度的苯酚完全降解。此外，苯酚降解真菌也具有一定的耐鹽性，從連云港海岸帶淤泥分離得到1 株耐鹽苯酚降解菌株Candida tropicalisSDP-1，最大能夠耐受12%（m/V，下同）的NaCl，24 h 內(nèi)可完全降解1 200 mg/L 的苯酚［77］。Xie 等［78］研究了假絲酵母菌LN1 在高濃度苯酚作用下的形態(tài)、生理變化，結(jié)果證實LN1 在6 000 mg/L 苯酚濃度下培養(yǎng)14 h 后進(jìn)入VBNC 狀態(tài)，該菌株具有高效降解1 000 mg/L 苯酚的能力以及很高的芳香化合物降解潛力。

除假絲酵母菌屬外，研究者也篩選出其他對苯酚具有降解作用的真菌。Karimi 等［79］從焦化廠的環(huán)境樣品（土壤和廢水）中分離出多株苯酚降解真菌，選擇生長速率較快的4 株真菌（K1、K2、K7 和K11）進(jìn)行研究，其中K2 為Pichia guilliermondii，K7為Meyerozyma guilliermondii。白腐真菌是一類能引起木材白色腐爛的真菌總稱。白腐真菌最初只用于木材的降解，后發(fā)現(xiàn)白腐真菌能夠降解多種有機污染物，在環(huán)境領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，因此成為研究熱點［80］。朱澤軍等［81］重點研究了白腐真菌降解苯酚的機制是白腐真菌通過醌氧化還原循環(huán)產(chǎn)生·OH，并通過·OH 的氧化作用攻擊底物，這有可能是白腐真菌降解苯酚的機制。

2.3 微藻降解苯酚

微藻已被應(yīng)用于處理多種廢水，微藻可以將水氧化，從而降低污染廢水的生化需氧量（BOD），可以吸收營養(yǎng)物質(zhì)，從而防止下游水生系統(tǒng)的富營養(yǎng)化，可以改變水體pH，這有助于滅活病原體［82］。此外，與細(xì)菌不同的是藻類使用二氧化碳作為碳源，因此不需要在廢水中添加額外的碳源。一般來說，使用藻類的污染處理主要用于去除營養(yǎng)物質(zhì)，如城市污水中的氮和磷。由于發(fā)現(xiàn)微藻具有去除重金屬和持久性有機污染物（POPs）的潛力，所以研究者對微藻降解苯酚的能力進(jìn)行了研究。

藻類的苯酚去除能力主要取決于污染物基質(zhì)類型、反應(yīng)時間、處理水體的pH 和光照。與其他微生物相比，單一微藻對苯酚的降解容易受到光照條件的限制［83］，且處理時間較長以及易被不同酚類化合物的毒性影響，即使在低濃度下，劇毒酚類化合物也可能阻礙微藻的生長。因此，學(xué)者們把研究重點放在微藻與其他微生物聯(lián)合降解苯酚的效果上。

藻類與細(xì)菌具有共生關(guān)系，在降解苯酚的過程中可以相互協(xié)同作用，使降解過程穩(wěn)定不易受到環(huán)境的影響。Eio 等［84］嘗試在藻類-細(xì)菌系統(tǒng)中降解雙酚，研究觀察到小球藻（Chlorella sorokiniana）的單一藻類培養(yǎng)可去除約50%的雙酚，但在任意初始雙酚濃度下藻類-細(xì)菌系統(tǒng)均可以將雙酚完全降解；此外，觀察到當(dāng)雙酚濃度超過20 mg/L 時會抑制單一藻類培養(yǎng)中小球藻的生長，而在藻類-細(xì)菌系統(tǒng)中沒有觀察到這種抑制現(xiàn)象。Yi 等［85］人工建立了1個小球藻（Chlorellasp.）與Cupriavidus necator的微生態(tài)環(huán)境，用于降解苯酚；初步證明了小球藻和C.necator之間的協(xié)同作用，然后系統(tǒng)評估和優(yōu)化了小球藻與C.necator的接種比例、光照度、溫度和pH 對該微生態(tài)系統(tǒng)性能的影響。在最佳條件下，該系統(tǒng)可以在60 h 內(nèi)降解1 200 mg/L 的苯酚。

3 影響微生物降解苯酚的因素

生物降解受物理、化學(xué)和生物條件的影響，從而影響苯酚的整體降解效率。研究比較多的影響微生物降解苯酚效率的因素主要包括苯酚濃度、溫度、pH、鹽度以及附加碳源和氮源這5 個方面。

1）苯酚濃度。一般來說，苯酚對生物體有毒。一些苯酚降解菌可以利用低濃度的苯酚作為碳源，但隨著苯酚濃度的提高，其生物毒性也隨之增加，菌株的生長和降解能力逐漸受到抑制。不同細(xì)菌對苯酚的耐受性和降解能力不同，在100～1 500 mg/L 的苯酚濃度范圍內(nèi)，可以高效降解苯酚的細(xì)菌較為豐富。其中，Rhodococcussp.和Oceanimonassp.被認(rèn)為是較有效的苯酚降解細(xì)菌，可代謝高達(dá)1 500 mg/L的苯酚濃度［26，86］。

2）溫度。溫度與底物的生物利用率和溶解度以及微生物降解的特性和代謝率有關(guān)［87-89］。因此，需篩選出最佳溫度，以使生物降解過程中的關(guān)鍵酶發(fā)揮主導(dǎo)作用。大多數(shù)細(xì)菌生物降解的適宜溫度范圍為25～37 ℃，較高或較低的溫度可能會對負(fù)責(zé)芳香環(huán)裂解的酶產(chǎn)生不利影響［90，91］。

3）pH。pH 在6.0～8.0 時適用于大多數(shù)苯酚降解細(xì)菌菌株，pH 的變化會影響微生物的生長以及酶活性［92，93］。如鄰苯二酚2，3-雙加氧酶的最佳pH 為8.0［94，95］。

4）鹽度。一些降解苯酚的微生物是中度嗜鹽或輕度嗜鹽細(xì)菌，Alva 等［96］研究發(fā)現(xiàn)，在Halomonas campisalis降解苯酚過程中較高的鹽度對順，順-粘糠酸的積累影響有限，但只有在無NaCl 的條件下，順，順-粘糠酸才能被完全降解。因此，鹽度會在一定程度上影響苯酚的代謝途徑。在已報道的嗜鹽苯酚降解菌中，嗜鹽單胞菌屬（Halomonassp.）是研究較多的一類，其能在5%～10%的高鹽環(huán)境中生長繁殖，可有效降解1 100 mg/L 的苯酚［97］。

5）附加碳源和氮源。異養(yǎng)微生物可以利用苯酚等有機污染物作為碳源，但為了更好地生長和繁殖，它們還需要額外的、自身無法合成的營養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、淀粉、蛋白胨、酵母或尿素等。細(xì)菌優(yōu)先利用易于降解的碳源和氮源，加快生長和繁殖的速度，從而提高對底物的降解速度。Veenagayathri 等［98］證明，使用酵母膏作為外加氮源使耐鹽細(xì)菌聯(lián)合體在降解苯酚方面更有效。Chandrasekaran 等［99］研究發(fā)現(xiàn)，在鹽濃度為12%時，添加酵母提取物顯著增強了苯酚降解效率，添加尿素減少了苯酚生物降解的滯后時間。

除以上5 種影響因素外，影響微生物降解苯酚效率的因素還有很多，如復(fù)蘇促進(jìn)因子（Rpf）、微量金屬元素的特殊添加劑以及微生物的接種量，除了碳和氮源，微生物還受到磷、硫、鎂、鉀等其他無機營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控［100］，可以針對不同地區(qū)篩選得到菌種的實際情況探究通過改變影響因素，從而提高降解效率的方法。

4 微生物降解苯酚技術(shù)優(yōu)化及應(yīng)用的研究進(jìn)展

4.1 細(xì)胞固定技術(shù)

在有機物的生物降解中，使用固定化細(xì)胞已被證明比自由懸浮細(xì)胞的傳統(tǒng)生物系統(tǒng)更有效。固定化的優(yōu)勢在于可通過更高的細(xì)胞負(fù)載提高生物降解率，保護(hù)微生物免受惡劣環(huán)境條件的影響，允許更高的生物量密度，提供再利用和回收機會［101-103］。通過固定化處理的微生物可以快速適應(yīng)污染環(huán)境，并提高其降解苯酚的性能。

微生物經(jīng)固定化處理后可以適應(yīng)更高鹽度的苯酚污染廢水，如Tan 等［86］采用海洋單胞菌（Oceanimonassp.）經(jīng)過細(xì)胞固定化處理后可降解苯酚濃度為1.5 g/L、NaCl 濃度為6%的含酚廢水，降解率可達(dá)99%。Jiang 等［17］利用磁性固定Comamonassp.細(xì)胞與電極耦合的集成系統(tǒng)來處理含酚廢水。結(jié)果表明，在鹽度5%的情況下，1 000 mg/L 的苯酚完全降解。細(xì)胞固定技術(shù)還能提高菌體存活率和儲藏穩(wěn)定性，張安龍等［104］分離篩選得到1 株高效降解苯酚真菌QWD1并以谷糠為載體制備固體菌劑。通過鑒定該真菌為Magnusiomyces capitatus，28 d 內(nèi)對1 600 mg/L苯酚降解率為97.15%，制成菌劑后保存時間可達(dá)90 d 甚至更長，活菌數(shù)高達(dá)2.5×108CFU/g 左右，降解苯酚效果良好。

固定化小球可以有效地多次重復(fù)使用［105］，再利用是細(xì)胞固定技術(shù)在實際應(yīng)用中的主要優(yōu)勢。此外，苯酚在水中排放后會沉淀到底部，并在其中不斷溶解。傳統(tǒng)的非固定化生物方法只能處理地表水中的污染物，而固定化技術(shù)有望通過在水下使用固定化細(xì)菌來處理更深水域的苯酚污染。

4.2 生物反應(yīng)器系統(tǒng)

在各種反應(yīng)器應(yīng)用中，已有許多關(guān)于通過微生物降解去除苯酚的研究［106-109］。在多種工業(yè)廢水中可溶無機鹽與酚類化合物同時存在，據(jù)估計5%的工業(yè)廢水是含鹽或高鹽廢水［110］，然而微生物的代謝活性在高鹽廢水中受到抑制［111-113］。因此，在高鹽度條件下處理含酚廢水比較困難，研究者通過利用苯酚降解菌構(gòu)建生物反應(yīng)器系統(tǒng)的方法來克服高鹽度的影響。

在含鹽或高鹽條件下用苯酚生物降解廢水處理的好氧反應(yīng)器系統(tǒng)中，序批式反應(yīng)器（SBR）在含鹽條件下去除苯酚是常用的方法。SBR 在含鹽條件下能有效去除高濃度苯酚［114-116］。此外，由于電化學(xué)過程和生物降解之間存在耦合效應(yīng)，電輔助SBR 對含鹽廢水中的苯酚也表現(xiàn)出良好的去除效果，同時生物電化學(xué)方法也減輕了鹽脅迫對細(xì)菌群落的影響［117-119］。

膜式生物反應(yīng)器（MBR）也是處理含酚含鹽廢水的常用方法。MBR 是包含生物降解和物理過濾單元的復(fù)合系統(tǒng)，其優(yōu)點包括出水水質(zhì)高、產(chǎn)生污泥量少、降解污染物的能力強等［120］。Juang 等［121］在微孔聚丙烯（PP）中空纖維膜接觸器的生物反應(yīng)器中使用假單胞菌（Pseudomonas putida）BCRC14365 降解含苯酚廢水，懸浮細(xì)胞在100 mg/L 苯酚下生長，且僅在濃度0.44 mol/L 以下的NaCl 溶液中生長；然而在膜式生物反應(yīng)器中，纖維膜中的細(xì)胞可在NaCl 濃度為1.52 mol/L 時完全分解500 mg/L 的苯酚，這是因為附著生物膜提高了其對鹽濃度的耐受極限。MBR 在耐鹽性和苯酚去除性能方面表現(xiàn)較強，在6%的鹽濃度下，它可以完全降解1 500 mg/L 的苯酚［66］，但膜孔可能被EPS（胞外聚合物）或SMP（可溶性微生物產(chǎn)物）堵塞；同時高鹽度可能會改變膜的滲透性，增加膜生物污染率，從而影響修復(fù)能力［122，123］。

盡管有很多相關(guān)報道，但大多數(shù)方法都是將合成廢水作為進(jìn)水，而不是實際的含酚含鹽污水。這些工藝需要在實際條件下不斷測試，以處理不同成分和鹽濃度的各種含酚廢水。

5 展望

具有苯酚高降解性能的細(xì)菌、真菌以及微藻被篩選培育出來，這些研究豐富了苯酚降解菌的種類，為今后的研究提供了參考，但大數(shù)研究處于實驗室階段，真正投入實際應(yīng)用的案例較少。由于苯酚的主要污染形式焦化廢水是十分復(fù)雜的混合體系，用單一的細(xì)菌、真菌或微藻進(jìn)行處理較難達(dá)到國家排放標(biāo)準(zhǔn)，并且降解過程對環(huán)境條件敏感，容易受外界刺激的不利影響導(dǎo)致修復(fù)效果減弱。通過微生物降解苯酚仍是較為經(jīng)濟(jì)有效的修復(fù)污染途徑，因此未來的研究方向可以持續(xù)從苯酚污染環(huán)境或其他極端環(huán)境中分離、篩選、培育更多的高效苯酚降解細(xì)菌、真菌及微藻，在研究其基本降解特性后，深入探究多株苯酚降解菌協(xié)同修復(fù)或構(gòu)建細(xì)菌-微藻系統(tǒng)，對已有苯酚降解菌株進(jìn)行細(xì)胞固定化處理或建立生物反應(yīng)器系統(tǒng)克服以上問題。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷快速發(fā)展，新的現(xiàn)代化技術(shù)手段逐漸被運用到高效菌株培育中，如利用細(xì)胞融合技術(shù)處理菌株、生化技術(shù)培養(yǎng)菌株等，未來可以嘗試應(yīng)用于處理已發(fā)現(xiàn)的苯酚降解菌，以達(dá)到提高菌株的降解能力以及對環(huán)境的抵抗能力的目的。