楊雪晴 劉文義 陳 靜 孫士淼 周立峰 胡加付

（浙江農(nóng)林大學(xué) 杭州 311300）

松材線蟲病是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）寄生在松樹體內(nèi)引起的具毀滅性的森林病害，該病自1982年傳入我國以來，擴(kuò)散蔓延迅速，全國已有20多個(gè)?。▍^(qū)、市）發(fā)生，導(dǎo)致大量松樹枯死，造成巨大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失，嚴(yán)重影響我國的森林生產(chǎn)和生態(tài)安全（陳鳳毛等，2005；潘宏陽等，2009；王永生，2019）。在25 ℃環(huán)境下，松材線蟲每個(gè)世代只需5天即可完成，每對(duì)成年線蟲在短短2天內(nèi)能夠繁殖20萬條松材線蟲（王曦茁等，2018）；30 ℃時(shí)，其生長(zhǎng)周期縮短至3 天。松材線蟲病流行的原因之一即是松材線蟲生長(zhǎng)發(fā)育速度快、交配效率高（陳茜等，2022），研究松材線蟲中與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因具有重要意義。

對(duì)松材線蟲進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Cullin蛋白家族成員cul-1基因或在調(diào)控蟲體生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用，Cullin蛋白家族成員作為支架參與泛素連接酶E3的構(gòu)成，共同參與蛋白質(zhì)泛素化級(jí)聯(lián)反應(yīng)（高志遠(yuǎn)等，2021）。哺乳動(dòng)物Cullin蛋白家族包括8個(gè)成員（cul-1至cul-7和PARC），均含有保守的Cullin同源結(jié)構(gòu)域（Cullin homology domain，CH），其中cul-1至cul-7 組裝多亞基復(fù)合物 （CRL，Cullin-ring E3 ubiquitin ligase)， Cullin 蛋白將底物靶向單元（通常通過接頭蛋白）和 CRL 中的 RING 組件連接起來，由Cullin 組織的 CRL 將底物定位在靠近 RING 結(jié)合的E2 泛素結(jié)合酶的位置，該酶催化泛素向底物轉(zhuǎn)移（李衍輝等，2015）。 此外，Cullins 與泛素樣分子Nedd8 結(jié)合可調(diào)節(jié)相應(yīng) CRL 復(fù)合物的激活，這可能是通過 Cullin 的羧基末端尾部和 CRL 的 RING 亞基之間相互作用的構(gòu)象調(diào)節(jié)（Panet al.，2004）。CRL 靶向多種底物，對(duì)一系列生物過程產(chǎn)生影響，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄控制和基因組完整性。

在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和酵母（yeast）中均發(fā)現(xiàn)cul-1（Sarikaset al.，2011），Kipreos 等（1996）將 Cullins 鑒定為參與線蟲細(xì)胞周期調(diào)控的基因家族。在模式線蟲（C. elegans）中，cul-1是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控所必需的。細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）與細(xì)胞周期蛋白復(fù)合時(shí)形成全酶的催化亞基，是真核生物細(xì)胞周期進(jìn)程的主要調(diào)節(jié)因子（Nigg, 1995）。這些激酶受多種機(jī)制調(diào)節(jié)，通過磷酸化關(guān)鍵底物產(chǎn)生連續(xù)活性波，啟動(dòng)細(xì)胞周期調(diào)控。雖然一些CDK存在于整個(gè)細(xì)胞周期中，但不同細(xì)胞周期蛋白基因在每個(gè)階段均有表達(dá)（Motokuraet al.，1993；Nasmyth，1993）。在秀麗隱桿線蟲cul-1突變體中，不同組織類型的細(xì)胞無法產(chǎn)生或響應(yīng)細(xì)胞周期退出或程序性細(xì)胞死亡的正常發(fā)育信號(hào)，受影響的胚細(xì)胞過度分裂，產(chǎn)生小細(xì)胞，這些胚胎在早期分裂時(shí)看起來完全正常，但因細(xì)胞過多而停滯，使秀麗隱桿線蟲無法正常生長(zhǎng)發(fā)育（Kipreoset al.，1996）。綜上說明，cul-1基因在生長(zhǎng)發(fā)育過程起著重要作用。

為探究松材線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制，本研究對(duì)松材線蟲Bxy-cul-1基因進(jìn)行功能探索。首先，通過生物信息學(xué)分析，確定其同源性并明確其進(jìn)化地位，采用原位雜交和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)明確Bxy-cul-1基因的表達(dá)特性，利用RNA干擾技術(shù)闡述該基因的生物學(xué)功能，揭示該基因在松材線蟲生長(zhǎng)發(fā)育的重要作用，驗(yàn)證Cullin蛋白的重要功能，研究結(jié)果為從生長(zhǎng)發(fā)育角度探索特異性的線蟲種群增長(zhǎng)控制措施提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲和培養(yǎng)條件

本研究所用松材線蟲由中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所提供，是從浙江省寧波市馬尾松（Pinus massoniana）的病死松木中分離獲得的，編號(hào)為NXY61株系。將松材線蟲接種到長(zhǎng)滿灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）平板上，25 ℃黑暗恒溫條件下培養(yǎng)。

1.2 不同齡期同步線蟲的獲得

將在PDA平板上25 ℃黑暗恒溫條件下培養(yǎng)3 天的松材線蟲，采用Baermann漏斗分離出來，分離出的線蟲用無菌水清洗2～3次后置于培養(yǎng)皿中，25 ℃黑暗恒溫環(huán)境放置1～2 h讓其產(chǎn)卵，利用松材線蟲卵的黏壁性，倒掉上清，即可從培養(yǎng)皿中收集到同步卵。于25 ℃黑暗恒溫環(huán)境下讓其孵化24 h后，獲得同步的2齡（J2）幼蟲，收集含有2齡蟲的液體低速離心3 min，然后將其接種到長(zhǎng)滿灰葡萄孢菌的PDA平板上，25 ℃分別培養(yǎng)29、48、72 h，隨后分別采用Baermann漏斗分離出同步3齡（J3）幼蟲、4齡（J4）幼蟲和成蟲（Xuet al., 2014; Zhouet al., 2020）。

1.3 Bxy-cul-1基因的克隆

采用TRIZOL法從每個(gè)樣品中（不同發(fā)育階段的松材線蟲）提取總RNA，使用NanoDrop?ND-2000超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）進(jìn)行分析。反轉(zhuǎn)錄使用Prime-Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa Bio Inc.，Shiga，Japan）試劑盒，以獲得cDNA。設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增松材線蟲的Bxy-cul-1基因，擴(kuò)增體系及條件參照陳莎妮等（2021）。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆pGEM?-TEasy載體上，送往北京擎科生物有限公司測(cè)序。

1.4 Bxy-cul-1基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)測(cè)序獲得的核苷酸序列預(yù)測(cè)Bxy-cul-1基因的蛋白序列，利用NCBI保守域數(shù)據(jù)庫確定其保守結(jié)構(gòu)域 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)（Marchler-Baueret al.，2017）；使用ExPASy（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；運(yùn)用PRABI網(wǎng)站的SOPMA程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，并采用PyMOL軟件進(jìn)行可視化和編輯；使用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，采用MEGA10鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 原位雜交試驗(yàn)

為明確Bxy-cul-1基因的時(shí)空表達(dá)模式，采用地高辛標(biāo)記的探針對(duì)松材線蟲不同發(fā)育階段進(jìn)行mRNA原位雜交試驗(yàn)。根據(jù)目的基因的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)目的基因正反向引物（表1），分別將其正反向引物與M13正反向引物（表1）配對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，以鑒定目的片段的插入方向。使用DIG-RNA標(biāo)記試劑盒（Roche Gmbh，Mannheim，Germany）參照使用說明進(jìn)行ssRNA制備。原位雜交試驗(yàn)的具體步驟參考Motohashi 等（2006）方法并稍作改動(dòng)，染色完成后使用瓊脂糖固定墊固定線蟲樣本，制備臨時(shí)玻片；在將光學(xué)顯微鏡下觀察線蟲的染色部位，對(duì)線蟲整蟲及染色部位進(jìn)行記錄和拍照。

表1 本研究使用的引物①Tab. 1 Primers used in the present study

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量分析

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）技術(shù)分析Bxy-cul-1基因在松材線蟲不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。利用Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì)Bxy-cul-1的RT-qPCR引物（表1），以tbb-2、βactin作為內(nèi)參基因（Zhouet al，2021），在ANALYTIK JENAAG qTOWER 2.2 熒光定量 PCR 儀進(jìn)行SYBR Green RTqPCR 試驗(yàn)，反應(yīng)體系（20 μL）為：TB Green Premix ExTaqII 10 μL、cDNA模板2 μL、上下游引物 F（10 μmol·L-1）各0.8 μL、滅菌ddH2O補(bǔ)平至20 μL。RT-qPCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。RT-qPCR 試驗(yàn)結(jié)果分析采用 2-ΔΔCt法，取2個(gè)內(nèi)參的幾何平均值計(jì)算干擾效率，具體計(jì)算方法參照 Milstein 等（2013）。不同齡期樣品分別進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)技術(shù)復(fù)孔。

1.7 RNA干擾試驗(yàn)

1.7.1 dsRNA的合成 以公司測(cè)序返回的質(zhì)粒DNA為模板，將含有T7啟動(dòng)子（周天鴻等，2000）的特異性引物（表1）對(duì)Bxy-cul-1基因和外源gfp基因（孟和等，2004）進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行膠回收，以獲得含有T7啟動(dòng)子的目的片段。根據(jù)MEGAscript?T7 High Yield Transcription Kit說明書體外合成dsRNA，并用NanoDrop?ND-2000超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品。

1.7.2 RNAi浸泡試驗(yàn) 將松材線蟲洗滌浸泡在干擾液中，25 ℃黑暗環(huán)境下處理24 h。將相同數(shù)量的松材線蟲浸泡在緩沖液中，進(jìn)行相同處理，作為對(duì)照組。每組均含有4 μL 5×soaking buffer，干擾液中的dsRNA終質(zhì)量濃度為0.6 μg·μL-1，最后用ddH2O定容至20 μL，現(xiàn)配現(xiàn)用（馬芮等，2022）。

1.7.3 孵化率的統(tǒng)計(jì) 將在PDA平板上25 ℃黑暗恒溫條件下培養(yǎng)3天的松材線蟲成蟲采用Baermann漏斗分離出來，分離出的線蟲用無菌水清洗2～3次，將線蟲懸浮液（此時(shí)的雌蟲大部分處于產(chǎn)卵期）吸入到載玻片上，置于25 ℃黑暗環(huán)境讓其產(chǎn)卵1～2 h，之后用無菌水洗去線蟲，即可獲得同步卵，向載玻片上的卵分別滴加干擾液和對(duì)照液，黑暗環(huán)境處理24 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)其孵化率，對(duì)照組和處理組各3～4次重復(fù)。

1.7.4 運(yùn)動(dòng)情況和性狀觀察 浸泡在干擾液中的同步線蟲處理24 h后，首先將干擾液吹打混勻，接著吸出1 μL線蟲懸浮液到載玻片上，加無菌水稀釋靜置10 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察蟲體活力情況，并對(duì)松材線蟲30 s之內(nèi)的頭部擺動(dòng)頻率進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)照組和處理組各3次重復(fù)，每次對(duì)液滴中的10條線蟲進(jìn)行頭擺計(jì)數(shù)，并對(duì)每組線蟲性狀進(jìn)行觀察記錄（陳茜等，2022）。

1.7.5 發(fā)育進(jìn)度試驗(yàn) 將懷卵的雌性成蟲吸入到載玻片上，25 ℃黑暗恒溫環(huán)境產(chǎn)卵1～2 h，然后用無菌水洗去線蟲，獲得同步卵，接著將獲得的同步卵在黑暗環(huán)境培養(yǎng)24 h后，孵化出2齡蟲，向載玻片上的2齡蟲分別滴加干擾液和對(duì)照液，對(duì)照組和處理組各3次重復(fù)，黑暗環(huán)境處理24 h后，將干擾組和對(duì)照組的2齡蟲分別接至長(zhǎng)滿灰葡萄孢的PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)72 h，72 h后采用Baermann漏斗將松材線蟲從平板中分離，離心，然后在Zeiss（Observer.A1）顯微鏡下觀察干擾組和對(duì)照組的蟲態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1Bxy-cul-1基因結(jié)構(gòu)功能域的分析 以松材線蟲cDNA 為模板，采用特異性引物 PCR 擴(kuò)增后得到Bxy-cul-1基因CDS全長(zhǎng)為 2 292 bp。NCBI ConservedDomains預(yù)測(cè)其主要功能區(qū)為Cullin、Cullin_Nedd8，是泛素依賴性蛋白質(zhì)降解所需的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)家族，參與線蟲細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，如圖1a所示。

圖1 Bxy-cul-1基因的生物信息學(xué)分析Fig. 1 Bioinformatics analysis of Bxy-cul-1 genea: Bxy-cul-1保守結(jié)構(gòu)域Structure and functional domain analysis of Bxy-cul-1；b: Bxy-cul-1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) Secondary structure prediction of Bxy-cul-1；c: Bxy-cul-1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)卡通圖Bxy-cul-1 protein in cartoon representation；d: Bxy-cul-1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)表面表征圖Bxy-cul-1 protein in surface representation.

2.1.2Bxy-cul-1編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析ExPASy ProtParam工具預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的分子式為C6914H11529N2301O2851S517，分子質(zhì)量為189 083.32 Da，理論等電點(diǎn)為4.90，推測(cè)在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞體外培養(yǎng)半衰期為4.4 h，在酵母體內(nèi)培養(yǎng)半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)培養(yǎng)半衰期大于10 h，不穩(wěn)定指數(shù)（II）為42.47，是一類不穩(wěn)定蛋白。

2.1.3Bxy-cul-1編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)SOPMA程序預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（alpha helix）結(jié)構(gòu)構(gòu)成，Bxy-cul-1編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋在多肽鏈中共有 501個(gè)，占比65.66%，β-轉(zhuǎn)角（beta turn）共有27個(gè)，占比3.54%，延伸鏈（extended strand）共有58個(gè)，占比7.60%，無規(guī)則卷曲（random coil）177個(gè)，占比23.20%。該基因α-螺旋是多肽鏈中大量的結(jié)構(gòu)元件，散布在整個(gè)肽鏈中，其次為無規(guī)則卷曲，然后為延伸鏈，β-轉(zhuǎn)角最少，如圖1b所示。在SWISS-MODEL上對(duì)Bxy-cul-1蛋白進(jìn)行同源建模，結(jié)構(gòu)圖如圖1c、d所示，該基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)與Cand1-Cul1-Roc1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)1u6g.1最為相似，GMQE為0.72，QMEAN為0.68 ± 0.05，蛋白序列一致性為47.06%，這表明預(yù)測(cè)結(jié)果可信度較高，蛋白模型匹配度較好，該基因編碼蛋白屬于Cullin蛋白家族。

2.1.4Bxy-cul-1的多重比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 利用DNAMAN軟件將Bxy-cul-1基因所編碼的氨基酸序列與Caenorhabditis elegans（NP_499 309.1）、Caenorhabditis briggsae(XP 045096468.1)、Bursaphelenchus okinawaensis（CAD5227534.1）、Ditylenchus destructor(KAI1730446.1)、Aphelenchus avenae(KAH7719034.1)、Loa loa（XP_020303961.1）、Brugia malayi（XP_042932007.1）、及Wuchereria bancrofti(EJW 84 073.1)的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果如圖2a所示，Bxy-cul-1基因的氨基酸序列與不同線蟲cul-1基因的氨基酸序列具有較高保守性。利用 MEGA 軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，該進(jìn)化樹包含Bursaphelenchus、Aphelenchus、Brugia 、Caenorhabditis等屬， 涉及 10 個(gè)物種。由圖2b可知，Bxy-cul-1基因氨基酸序列與多種線蟲的cul-1氨基酸序列聚類在一起，與黑腹果蠅的cul-1氨基酸序列區(qū)別開來，進(jìn)一步證實(shí)線蟲cul-1基因的同源性。其中，Bxy-cul-1基因與沖繩線蟲基因親緣關(guān)系較近，這為Bxy-cul-1基因的生物學(xué)研究提供了參考。

圖2 Bxy-cul-1 基因序列比（a）對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析（b）Fig. 2 Bxy-cul-1 gene sequence alignment (a) and phylogenetic analysis (b)a: Bxy-cul-1基因序列比對(duì)The sequence alignment of Bxy-cul-1; b: Bxy-cul-1系統(tǒng)發(fā)育分析。分支數(shù)字表示支持率，比例尺表示進(jìn)化距離（每個(gè)位置 0.1 個(gè)替換）Phylogenetic analysis of Bxy-cul-1. The branch number indicated the support rate; scale bar indicates evolutionary distance (0.1 substitutions per position).

2.2 Bxy-cul-1基因的時(shí)空動(dòng)態(tài)表達(dá)特性

2.2.1 原位雜交試驗(yàn) 原位雜交結(jié)果如圖3 所示，其具體表達(dá)特性為：Bxy-cul-1基因從松材線蟲胚胎期開始表達(dá)，并貫穿整個(gè)發(fā)育階段。胚胎期全胚胎表達(dá)（圖3a）；2齡期廣泛表達(dá)（圖3c）；胚胎期、2齡期染色較深，說明Bxy-cul-1在以上齡期表達(dá)量較高。在 3齡期的腸道、性腺及附近的體壁肌肉表達(dá)（圖3d）；在 4齡期的性腺及尾部表達(dá)（圖3e）。在成蟲期，Bxy-cul-1基因分別在松材線蟲雄蟲的腹部、交合刺和尾部表達(dá)（圖3f）；雌蟲的卵母細(xì)胞及陰戶部位表達(dá)（圖3g）。

圖3 Bxy-cul-1基因在松材線蟲不同發(fā)育階段的原位雜交結(jié)果Fig. 3 Results of in situ hybridization of Bxy-cul-1 gene at different developmental stages of Bursaphelenchus xylophilusa：胚胎Embryo；c：2齡幼蟲The second stage of juvenile；d：3齡幼蟲The third stage of juvenile；e：4齡蟲The fourth stage of juvenile；f：雄性成蟲Adult male；g：雌性成蟲Adult female；b：胚胎(對(duì)照組)Embryo(CK)；h：雌性成蟲(對(duì)照組)Adult femal(CK).m：食道球Metacorpus；v：陰戶Vulva；sp：交合刺Spicules；an：肛門Anus.

2.2.2 RT-qPCR試驗(yàn)分析 如圖4所示，Bxy-cul-1基因在2齡期表達(dá)量最高，與其他齡期相比差異顯著，與原位雜交結(jié)果相對(duì)應(yīng)；胚胎期表達(dá)量也較高；3齡期、4齡期和成蟲期表達(dá)量逐漸降低，其中，成蟲期表達(dá)量最低。

圖4 Bxy-cul-1基因在松材線蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)水平Fig. 4 Expression level of Bxy-cul-1 indifferent stages of Bursaphelenchus xylophilusEmbryo：胚胎期Embryo stage；J2：2齡時(shí)期The second stage of juvenile；J3：3齡時(shí)期The third stage of juvenile；J4：4齡時(shí)期The fourth stage of juvenile；Adult：成蟲期Adult stage. 不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）The adult stage. Different lowercase letters meansignificant difference at 0.05 level.

2.3 基因功能

2.3.1Bxy-cul-1基因干擾效率分析 RT-qPCR檢測(cè)Bxy-cul-1基因在不同齡期干擾效率的結(jié)果如圖5所示，gfp對(duì)照組與對(duì)照組相比，線蟲的Bxy-cul-1基因表達(dá)略有下降，但差異不顯著；與處理組相比，Bxycul-1基因的表達(dá)量差異顯著下降（P＜0.05），胚胎期、2齡期以及3齡期目的基因均下降50%以上，4齡期下降44.33%，成蟲期下降22.73%，說明經(jīng)dsRNA處理后，松材線蟲各齡期的Bxy-cul-1基因表達(dá)水平受到抑制，且表達(dá)量差異顯著。

圖5 利用熒光定量PCR分析RNAi效率Fig. 5 The RNAi efficiency quantified by RT-qPCREmbryo：胚胎期Embryo stage；J2：2齡時(shí)期The second stage of juvenile；J3：3齡時(shí)期The third stage of juvenile；J4：4齡時(shí)期The fourth stage of juvenile；Adult：成蟲期Adult stage. **, P ＜0.01; *, P ＜0.05. Embryo**, P= 0.001；J2**, P= 0.006；J3**, P =0.008；J4*, P =0.01；Adult*, P =0.03.

2.3.2Bxy-cul-1基因?qū)ε咛サ挠绊?對(duì)松材線蟲的同步胚胎干擾24 h，處理組的胚胎孵化率為84.36%，與對(duì)照組（94.85% ± 0.72%）相比下降10.49%（N=9，df=34，t=5.116，P＜0.05），未孵化出的胚胎大多停留在1齡末期，蟲體腹部形成畸形腫大，不能突破卵殼，如圖6c、d所示，推測(cè)該基因可能參與調(diào)控松材線蟲胚胎的細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)，影響其生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致干擾后胚胎孵化率降低。部分孵化出來的2齡蟲也出現(xiàn)畸形性狀，畸形蟲無法正常伸展，中部食道腺異常膨大，尾部蜷縮，如圖6g、h所示。

圖6 Bxy-cul-1基因的生物學(xué)功能Fig. 6 Biological function of Bxy-cul-1 genea：對(duì)照組胚胎Control embryo；b：gfp對(duì)照組胚胎gfp control embryos；c、d：用特定 dsRNA 浸泡胚胎 24 h后出現(xiàn)的畸形胚胎Malformed embryos after soaking embryos for 24 h with specific dsRNA；e：對(duì)照組孵化出的2齡蟲J2 worms hatched from the control group；f：gfp對(duì)照組孵化出的2齡蟲J2 worms hatched from the gfp control group；g、h：孵化出的畸形2齡蟲The hatched deformed J2 worms；i：對(duì)照組2齡蟲Control group J2 worms；j：gfp對(duì)照組2齡蟲gfp control group J2 worms；k、l：用特定 dsRNA 浸泡2齡蟲24 h后出現(xiàn)的畸形2齡蟲Malformed J2 worms appearing after soaking J2 worms with specific dsRNA for 24 h.

2.3.3Bxy-cul-1基因?qū)?齡蟲的影響 對(duì)松材線蟲的2齡蟲干擾24 h，結(jié)果如圖6k、l所示，與對(duì)照組相比，部分處理組的2齡蟲出現(xiàn)畸形性狀，畸形蟲體形短小，頭部、食道腺異常膨大，尾部和腹部扭轉(zhuǎn)在一起，蟲體無法正常運(yùn)動(dòng)。

2.3.4Bxy-cul-1基因?qū)οx體活力的影響 為研究Bxycul-1基因?qū)οx體活力的影響，對(duì)處理組的蟲體頭部擺動(dòng)頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖7所示，胚胎孵化出的2齡蟲對(duì)照組的頭擺頻率為每30 s 18.20次，干擾后則下降至每30 s 14.93次；2齡蟲對(duì)照組的頭擺頻率為每30 s 17.60次，干擾后則下降至每30 s 12.70次；3齡蟲對(duì)照組的頭擺頻率為每30 s 26.50次，干擾后下降至每30 s 22.50次；4齡蟲頭部擺動(dòng)頻率沒有明顯變化。胚胎孵化出的2齡蟲、2齡蟲以及3齡蟲頭部擺動(dòng)頻率與對(duì)照組相比大大降低，且差異顯著（胚胎孵化出的2齡蟲：N=30，df=58，t=5.008，P＜0.05；2齡蟲：N=10，df=18，t=4.636，P＜0.05；3齡蟲：N=10，df=18，t=2.813，P＜0.05），蟲體表現(xiàn)出活躍度降低、運(yùn)動(dòng)緩慢的現(xiàn)象。

圖7 Bxy-cul-1基因干擾后的頭部擺動(dòng)頻率Fig. 7 Head swing frequency of Bxy-cul-1 gene interference Embryo：胚胎期Embryo stage；J2：2齡時(shí)期The second stage of juvenile；J3：3齡時(shí)期The third stage of juvenile；J4：4齡時(shí)期The fourth stage of juvenile；數(shù)據(jù)為來自3個(gè)獨(dú)立個(gè)體平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤值Data are shown as mean ± SE of tissues from three separate individuals. ***, P ＜0.001; **, P ＜0.01;*, P ＜0.05. Embryo***, P= 0.000 1；J2***, P= 0.000 3；J3*, P=0.012 5.

2.3.5Bxy-cul-1基因?qū)Πl(fā)育進(jìn)度的影響 為研究干擾后對(duì)松材線蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，進(jìn)行松材線蟲Bxy-cul-1 dsRNA發(fā)育進(jìn)度試驗(yàn)。如圖8所示，對(duì)照組的2齡蟲接至長(zhǎng)滿灰葡萄孢的PDA平板上培養(yǎng)3天后，2齡蟲全部發(fā)育至成蟲；而干擾組的2齡蟲并未發(fā)育至成蟲，仍然是2齡蟲。將其繼續(xù)培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)：第4天仍是2齡蟲；第5天為2齡蟲和3齡蟲，占比分別為75.54%、24.46%；第6天為2齡蟲、3齡蟲和4齡蟲，占比分別為61.45%、15.09%、23.46%；第7天出現(xiàn)成蟲，但仍存在2、3和4齡蟲，混蟲中2齡蟲占34.50%，3齡蟲占28.65%，4齡蟲占14.03%，成蟲占22.82%。由此可知，對(duì)照組的2齡蟲發(fā)育至成蟲僅需要3天，而干擾組的2齡蟲發(fā)育至成蟲需要7 天，其生長(zhǎng)發(fā)育速度大大降低。

圖8 Bxy-cul-1基因干擾后的發(fā)育進(jìn)度Fig. 8 Developmental progress after Bxy-cul-1 gene interferenceJ2：2齡時(shí)期The second stage of juvenile；J3：3齡時(shí)期The third stage of juvenile；J4：4齡時(shí)期The fourth stage of juvenile；A：成蟲期Adult stage.

3 討論

本研究首次從松材線蟲中克隆獲得Bxy-cul-1基因，其基因CDS全長(zhǎng) 2 292 bp，編碼 763 個(gè)氨基酸， 是Cullin 蛋白家族中的一員。結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明Bxy-cul-1基因的氨基酸序列與其他線蟲的cul-1基因的氨基酸序列具有較高保守性。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，松材線蟲cul-1基因與沖繩線蟲cul-1基因位于同一分支，這為研究松材線蟲cul-1基因提供參考。

利用原位雜交和RT-qPCR技術(shù)，檢測(cè)到Bxy-cul-1在松材線蟲不同發(fā)育階段均有表達(dá)，且二者結(jié)果基本吻合。Bxy-cul-1基因在2齡期表達(dá)水平較高，且分布幼蟲全身，這可能因?yàn)樵摃r(shí)期線蟲的生殖系細(xì)胞在整個(gè)胚胎后期持續(xù)分裂（Kimbleet al.，1979），且松材線蟲開始取食，是生長(zhǎng)發(fā)育的活躍期（葉為民等，1993），該基因廣泛參與松材線蟲2齡期的細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)發(fā)育過程。

采用RNAi技術(shù)研究該基因的功能，發(fā)現(xiàn)Bxy-cul-1在RNAi組中的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，這表明dsRNA能有效降低Bxy-cul-1的表達(dá)水平。松材線蟲被干擾后出現(xiàn)胚胎孵化率下降、部分胚胎和J2蟲致畸，且畸形蟲體形短小以及發(fā)育進(jìn)度減緩的現(xiàn)象，說明Bxy-cul-1基因和松材線蟲胚胎的發(fā)育以及個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。類似的功能在其他物種中也有報(bào)道。敲除小鼠（Mus musculus）cul-1基因，其胚胎在第6.5天原腸胚形成之前發(fā)育停止，cul-1基因小鼠敲除試驗(yàn)揭示其在細(xì)胞周期進(jìn)程和早期胚胎發(fā)生中不可或缺的作用（Wanget al.，1999）。在秀麗隱桿線蟲中，cul-1基因是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控所必需的。在cul-1突變體中，不同組織類型的細(xì)胞無法產(chǎn)生或響應(yīng)細(xì)胞周期退出或程序性細(xì)胞死亡的正常發(fā)育信號(hào)，受影響的胚細(xì)胞過度分裂，產(chǎn)生小細(xì)胞，這些胚胎在早期分裂時(shí)看起來完全正常，但因細(xì)胞過多而停滯，使秀麗隱桿線蟲正常的生長(zhǎng)發(fā)育受影響。干擾沉默該基因還會(huì)使其幼蟲出現(xiàn)組織增生、腹側(cè)中體擴(kuò)張、肌肉增生等現(xiàn)象（Sulstonet al.，1977；Kipreoset al.，1996）。

Cullin 家族蛋白參與多種功能，包括細(xì)胞周期控制、DNA 復(fù)制和發(fā)育等（田燁等，2013）， 并且Cullin家族蛋白的主要生理功能已通過對(duì)多種模式生物（包括小鼠、果蠅和秀麗隱桿線蟲）的基因敲除試驗(yàn)進(jìn)行揭示（Sarikaset al.，2011）。Arai等（2003）在確定cul-7是一種泛素連接酶亞基后，還獲得cul-7敲除小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠出生后由于呼吸窘迫而死亡，胚胎發(fā)育從12.5天開始表現(xiàn)出明顯生長(zhǎng)阻滯現(xiàn)象。Fbx29是一種F-盒蛋白，其可與cul-7組裝成SCF樣的泛素連接酶。對(duì)Fbx29基因敲除小鼠的觀察發(fā)現(xiàn)有2/3后代在胚胎期死亡，1/3后代可正常出生并發(fā)育到成年，但個(gè)體較?。ü鶗詮?qiáng)等，2010）。Fbx29敲除小鼠顯示出子官內(nèi)生長(zhǎng)停滯和胎盤發(fā)育異常，這與cul-7基因缺陷小鼠表型非常類似（Tsunematsuet al.，2006）。人類cul-7突變也可造成相應(yīng)疾病的發(fā)生，3-M綜合征（3-M syndrome）是一種常染色體隱性遺傳病，其特征是出生前后出現(xiàn)生長(zhǎng)阻滯，出生后還常常伴有面部畸形，頭圍大，但患者智力和內(nèi)分泌功能正常（Huberet al.，2005；2009）。對(duì)于黑腹果蠅的研究發(fā)現(xiàn)，cul-2、cul-5與卵巢的發(fā)育有關(guān)，cul-2在所有的生殖系細(xì)胞中廣泛表達(dá)，cul-2缺失后表現(xiàn)為多種發(fā)育缺陷，主要是生殖細(xì)胞的減少和滋養(yǎng)細(xì)胞的變性，而cul-5缺失后也觀察到了相似的表型（Yoheiet al.，2007）。本研究?jī)H揭示cul-1基因在松材線蟲中的作用，后續(xù)會(huì)繼續(xù)探究Cullin 家族其他成員在線蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控功能，完善該基因家族的功能多樣性，為進(jìn)一步研究松材線蟲分子生物學(xué)提供分子理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

松材線蟲Bxy-cul-1基因是Cullin蛋白家族中的一員，在松材線蟲各發(fā)育階段均有表達(dá)，發(fā)育初期廣泛表達(dá)，表達(dá)水平較高，發(fā)育后期表達(dá)水平較低。同時(shí)，Bxy-cul-1基因在功能上影響松材線蟲的個(gè)體發(fā)育進(jìn)度，這為研究松材線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育提供了理論基礎(chǔ)，也為松材線蟲的病害防治提供新思路。