耿 樂,王洪斌,劉志東,張俊杰,段 蕊,林 娜,倪 玲,遲 海

(1江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 連云港 222005;2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090)

南極磷蝦(EuphausiasuperbaDana)屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、磷蝦目,是一種小型甲殼動(dòng)物,其生物資源量預(yù)計(jì)在10億t左右,不僅為南大洋食物網(wǎng)中的關(guān)鍵物種而且具備極高的商業(yè)價(jià)值[1]。南極磷蝦含有豐富的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)濕基含量達(dá)11.9%～15.4%[2],干基含量約為70%[3]。其蛋白質(zhì)含有世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織/聯(lián)合國大學(xué)(WHO/FAO/UNU)要求的全部必需氨基酸,所有必需氨基酸含量均高于WHO/FAO/UNU對(duì)成人(嬰兒)的要求,有潛力成為人類未來可開發(fā)的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。

目前針對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)提取已有較多研究,高飛等[4]優(yōu)化了南極磷蝦蛋白質(zhì)提取工藝,得到冷凍南極磷蝦蛋白質(zhì)的提取條件。廖鄂[5]采用ISP技術(shù)提取南極磷蝦蛋白質(zhì),通過改進(jìn)提取條件使蛋白質(zhì)提取率提升至63%。王靈昭[6]系統(tǒng)研究了堿溶酸沉法提取南極磷蝦蛋白質(zhì)工藝,并研究了脫氟技術(shù)。Chen等[7]采用不同的pH處理,通過溶解/沉淀從整個(gè)南極磷蝦中回收蛋白質(zhì)和不溶物。蛋白質(zhì)提取率為45% ～ 50%(干基)。以上研究主要是以冷凍南極磷蝦等為原料。Wang等[8]研究了以脫脂南極磷蝦粉為原料提取蛋白質(zhì),經(jīng)過二次提取得到的分離蛋白質(zhì)最高得率為28.66%,但未對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,提取時(shí)間較長。

因此,針對(duì)脫脂南極磷蝦粉的高值化利用研究亟待更加深入地開展。脫脂南極磷蝦粉主要為提取磷蝦油后的副產(chǎn)物,目前主要作為飼料原料,價(jià)格低廉且蛋白質(zhì)含量高[9]。探索一種高附加值的方法來利用這種富含蛋白質(zhì)的材料已引起研究人員和工業(yè)界的廣泛關(guān)注[10]。

本研究以脫脂南極磷蝦粉為原料,以蛋白質(zhì)得率為指標(biāo)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、NaOH百分比濃度、料液比進(jìn)行分析,并通過響應(yīng)面法優(yōu)化得出提取的最佳參數(shù),以期為脫脂南極磷蝦粉高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂南極磷蝦粉(蛋白質(zhì)含量不低于75%)于2021年6月購自中水集團(tuán)遠(yuǎn)洋股份有限公司。氫氧化鈉(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);鹽酸(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

90-2型定時(shí)恒溫磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠有限公司);SHJ-4CD數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋(常州市金壇友聯(lián)儀器研究所);6200型立式冷凍離心機(jī)(日本久保田株式會(huì)社);PHS-3C型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠);AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);FreeZone真空冷凍干燥機(jī)(美國LABCONCO公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DAKP提取工藝流程

提取工藝流程參考高飛等方法[4]:脫脂南極磷蝦粉→堿溶→恒溫浸提→回收上清→調(diào)節(jié)pH→離心→回收沉淀→調(diào)節(jié)pH至7.0→真空冷凍干燥→DAKP。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

參考Wang等[8]、任憲君等[11]、郭靜等[12]方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)。以DAKP得率為指標(biāo),分別研究堿溶階段NaOH溶液百分比濃度(1%、1.5%、2%、2.5%、3%),提取溫度(60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃),料液比(w/V)(1∶10、1∶12.5、1∶15、1∶17.5、1∶20),提取時(shí)間(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)對(duì)DAKP得率的影響,確定較優(yōu)的提取條件并進(jìn)一步優(yōu)化。

蛋白質(zhì)得率按下式計(jì)算:

XDAKP=100%×m/M

(1)

式中:XDAKP表示得率;m表示蛋白質(zhì)質(zhì)量(g);M表示脫脂南極磷蝦粉質(zhì)量(g)。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

因素水平分析見表1。

表1 DAKP提取的因素水平表

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇提取溫度、提取時(shí)間、NaOH百分比濃度3個(gè)影響較為顯著的因素作為自變量,以蛋白質(zhì)得率為因變量,采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken 設(shè)計(jì)模塊進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)計(jì)3因素3水平一共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。其中12個(gè)為析因點(diǎn),5個(gè)為零點(diǎn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 DAKP提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度DAKP得率的影響

蛋白質(zhì)在不同溫度下溶解度不同[13],參考任憲君等[11]、郭靜等[12]的研究方法,選擇提取溫度為60 ℃～80 ℃進(jìn)行試驗(yàn)。由圖1可見,隨著提取溫度的增加,DAKP得率呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。在60 ℃～70 ℃時(shí),蛋白質(zhì)得率不斷增加,當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí),蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大,提取溫度超過70 ℃,蛋白質(zhì)得率開始下降?？赡苁请S著溫度的升高,分子運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)[14],蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生變化,因此蛋白質(zhì)能更好地從原料中析出。

圖1 提取溫度對(duì)DAKP得率的影響

但隨著溫度的進(jìn)一步升高,可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)熱誘導(dǎo)變性或熱誘導(dǎo)凝膠化[15],從而降低蛋白質(zhì)的溶出,導(dǎo)致蛋白質(zhì)得率下降,這與孟橋等[16]研究一致。綜合考慮,確定最適提取溫度選為70℃。

2.1.2 料液比對(duì)DAKP得率的影響

由圖2可知,蛋白質(zhì)得率隨著料液比的增大呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì),圖2表明當(dāng)料液比在1∶10～1∶15時(shí),蛋白質(zhì)得率持續(xù)增大,在1∶15時(shí)蛋白質(zhì)得率最高;當(dāng)料液比大于1∶15,蛋白質(zhì)得率持續(xù)下降,在1∶20時(shí)達(dá)到最低。其原因可能是當(dāng)料液比過低時(shí),體系的黏度太大,蝦粉分散不均勻,無法使得蛋白質(zhì)完全溶出,從而導(dǎo)致得率不高[17]。

圖2 料液比對(duì)DAKP得率的影響

料液比過高時(shí),DAKP在體系中過于分散,溶液百分比濃度得到稀釋,使得有效組分含量低,粒子之間無法充分接觸,溶解難度增加,致使蛋白質(zhì)得率降低。這與趙節(jié)昌[18]、Moncef等[19]的結(jié)論相似,他們發(fā)現(xiàn)料液比增加到一定值,蛋白質(zhì)產(chǎn)率會(huì)增加,隨著比例增大,產(chǎn)率下降。綜合考慮,最適料液比為1∶15。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)DAKP得率的影響

由圖3可知,隨著提取時(shí)間的增加,蛋白質(zhì)得率呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)DAKP得率的影響

提取時(shí)間在30～60 min時(shí),蛋白質(zhì)得率逐漸增加,在60 min時(shí),蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大。提取時(shí)間在60～90 min時(shí),蛋白質(zhì)得率逐漸降低。30 min時(shí)蛋白質(zhì)得率低的原因可能是由于提取時(shí)間太短,物料沒有充分混勻,蛋白質(zhì)沒有完全溶出,導(dǎo)致蛋白質(zhì)得率低。60 min后蛋白質(zhì)得率下降的原因可能是提取時(shí)間過長造成蛋白質(zhì)在堿性條件下浸泡時(shí)間過長,空間結(jié)構(gòu)被破壞[20],部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性凝聚反應(yīng)[24],導(dǎo)致得率下降。所以,總體呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì),這與周麗卿等[21]研究結(jié)果一致。綜合考慮最適提取時(shí)間為60 min。

2.1.4 NaOH百分比濃度對(duì)DAKP得率的影響

由圖4可知,DAKP的得率隨著NaOH百分比濃度的增加呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。

圖4 NaOH百分比濃度對(duì)DAKP得率的影響

當(dāng)NaOH百分比濃度小于2%時(shí),隨著百分比濃度的增加,蛋白質(zhì)得率不斷增長,在百分比濃度達(dá)到2%時(shí),蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大。當(dāng)NaOH百分比濃度大于2%,蛋白質(zhì)得率開始下降。原因可能是隨著pH增加,堿性環(huán)境會(huì)改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),使其疏松,組成氨基酸之間發(fā)生了更高的靜電斥力,導(dǎo)致蛋白質(zhì)在堿性介質(zhì)中的溶解度更高[22,23-24],所以蛋白質(zhì)得率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。堿溶時(shí)適當(dāng)增加堿液百分比濃度會(huì)使蛋白質(zhì)得率得到提升,但過高的pH不僅會(huì)使蛋白質(zhì)分子間難以聚合,且過高堿百分比濃度會(huì)加快美拉德反應(yīng)的進(jìn)行從而使蛋白質(zhì)得率下降[25],與王立等[26]研究結(jié)果一致。因此NaOH溶液最適百分比濃度選為2%。

2.2 響應(yīng)面模型的建立及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面的建模及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,通過響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)DAKP提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以A(提取溫度℃)、B (NaOH百分比濃度%)、C(提取時(shí)間min)為自變量,以蛋白質(zhì)得率作為因變量,進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),得到表2所示結(jié)果。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design-Expert.8.0.6,得到DAKP得率對(duì)提取溫度、NaOH百分比濃度,提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸模型:DAKP得率=31.94-1.19A+2.49B+0.70C+0.12 AB+0.050AC-0.30BC-5.2 A2-5.86B2-1.78C2。

為了驗(yàn)證模型的可信度,針對(duì)該回歸模型及回歸方程進(jìn)行誤差統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)方差、可信度、多元相關(guān)系數(shù)進(jìn)行計(jì)算,得到如表3所示結(jié)果。模型P<0.000 1說明模型極顯著,代表選取的各個(gè)條件對(duì)DAKP得率影響極顯著,失擬項(xiàng)P>0.05不顯著,說明模型正確且穩(wěn)定,可以用來預(yù)測(cè)DAKP提取工藝參數(shù)。F值表示的是單因素對(duì)DAKP得率的影響程度,F值越大,影響越顯著[27]。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

由3個(gè)因素F值大小可以看出其對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響排序?yàn)锽>A>C,且均為差異極顯著(P<0.01),AB、AC、BC對(duì)蛋白質(zhì)得率沒有顯著影響(P>0.05),A2、B2、C2對(duì)蛋白質(zhì)得率極顯著(P<0.01)。

表4 回歸方程可信度分析

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

提取溫度、NaOH百分比濃度、提取時(shí)間三因素交互作用對(duì)DAKP得率的影響如圖5～10所示,三維響應(yīng)面和二維等高線圖是回歸方程的圖形表示。它們展示了兩個(gè)被測(cè)變量之間的相互作用類型,以及每個(gè)變量的響應(yīng)與試驗(yàn)水平之間的關(guān)系[28]。等高線的形狀可以反映各個(gè)因素之間的交互是否顯著,橢圓表示兩因素之間的交互作用顯著,圓形表示兩因素之間的交互作用不顯著,響應(yīng)面越彎曲表明此因素對(duì)結(jié)果影響越大[29-30]。

圖5 提取溫度與NaOH百分比濃度影響DAKP得率的等高線圖

圖5等高線圖呈現(xiàn)圓形,表明提取溫度與NaOH百分比濃度之間交互作用不顯著,與表3顯著性分析結(jié)果一致(P>0.05)。

圖6三維響應(yīng)面圖可知,隨著提取溫度的增加、NaOH百分比濃度的增大,DAKP得率都呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì),在提取溫度70℃左右,NaOH百分比濃度在2.0%～2.5%之間蛋白質(zhì)得率最大。這與賀瑩[31]研究的溫度與pH的交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響趨勢(shì)一致。

圖6 提取溫度與NaOH百分比濃度影響DAKP得率的響應(yīng)面圖

圖7等高線圖為圓形,表示提取溫度與提取時(shí)間之間交互作用不顯著,與表3顯著性分析結(jié)果一致(P>0.05)。圖8可知隨著提取溫度、提取時(shí)間的增加,蛋白質(zhì)得率先增大后減小。得率最大值出現(xiàn)在提取溫度為70℃左右,提取時(shí)間在60～70 min。這與侯召華等[32]研究的溫度與時(shí)間的交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響變化趨勢(shì)一致。

圖7 提取溫度與提取時(shí)間影響DAKP得率的等高線圖

圖8 提取溫度與提取時(shí)間影響DAKP得率的響應(yīng)面圖

圖9圓形等高線圖表明,提取時(shí)間、NaOH百分比濃度之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響不顯著,符合表3的顯著性分析結(jié)果(P>0.05)。由圖10三維響應(yīng)面圖可知,隨著NaOH百分比濃度、提取時(shí)間的增加,蛋白質(zhì)得率同樣呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì),蛋白質(zhì)得率最大值出現(xiàn)在NaOH百分比濃度2.0%～2.5%。提取時(shí)間在60～70 min。在這兩個(gè)因素交互作用下對(duì)得率的影響趨勢(shì)與趙海霞等[33]研究的結(jié)果一致。

圖9 NaOH百分比濃度與提取時(shí)間影響DAKP得率的等高線圖

圖10 NaOH百分比濃度與提取時(shí)間影響DAKP得率的響應(yīng)面圖

2.3 模型的優(yōu)化與驗(yàn)證

通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果為提取溫度68.90 ℃,NaOH百分比濃度為2.21%,提取時(shí)間為65.29 min,此時(shí)DAKP理論得率為32.32%。為了驗(yàn)證回歸方程預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性,需要在上述研究得到的最佳提取條件(提取溫度68.90℃、NaOH百分比濃度為2.21%、提取時(shí)間為65.29 min)下試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[34]?？紤]到實(shí)際操作的可行性,將提取條件調(diào)整為提取溫度69℃,NaOH百分比濃度為2.2%,提取時(shí)間為65 min,重復(fù)試驗(yàn)3次,實(shí)際得率為31.93%±0.35%,與理論值32.32%的相對(duì)誤差為1.19%±1.01%,表明該模型對(duì)最優(yōu)工藝的預(yù)測(cè)是可行的。

2.4 討論

本研究的實(shí)際得率為31.93%±0.35%,要高于Wang等[8]的得率(28.66%),且本研究的提取工藝更為便捷,提取時(shí)間從其100 min減少到65 min;也高于高飛等[4]研究的南極磷蝦蛋白質(zhì)得率(10.91%),有很大可能與兩者之間所用原料及提取條件不同有關(guān)。從試驗(yàn)結(jié)果來看,提取時(shí)間、提取溫度、NaOH百分比濃度對(duì)蛋白質(zhì)得率有較大影響,由響應(yīng)面圖的趨勢(shì)可知,影響大小依次為NaOH百分比濃度>提取溫度>提取時(shí)間。因南極磷蝦蛋白質(zhì)提取優(yōu)化報(bào)道較少,與同為水產(chǎn)研究的候召華等[32]的各影響力大小一致。本研究的優(yōu)點(diǎn)在于以低附加值的脫脂南極磷蝦粉為原料提取蛋白質(zhì),有利于提高其附加值,充分利用南極磷蝦這一寶貴資源,且相較于其他同類研究,蛋白質(zhì)得率高、易操作、耗時(shí)短,有利于進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。但仍有改進(jìn)之處,比如將一次提取改為二次提取,進(jìn)一步提高得率,以及環(huán)境友好地處理產(chǎn)生的廢液。

3 結(jié)論

以脫脂南極磷蝦粉為原料,NaOH溶液作為堿溶溶液,通過單因素法與響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到了堿溶酸沉法提取DAKP的最優(yōu)條件?？紤]實(shí)際可操作性,確定最優(yōu)提取條件為堿溶溶液NaOH百分比濃度為2.2%,提取溫度為69℃,提取時(shí)間為65 min,料液比為1∶15,此條件下得到的DAKP得率為31.93%±0.35%,與理論值32.32%的相對(duì)誤差為1.19%±1.01%,且操作便捷。相較于其他脫脂南極磷蝦蛋白質(zhì)提取方法,本研究提取所需時(shí)間更短,更有利于規(guī)模化生產(chǎn)。期望本研究能促進(jìn)南極磷蝦附加值相關(guān)研究,推動(dòng)南極磷蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。