端國超,閻明軍,陳修報,,,姜 濤,劉洪波,侯詒然,楊 健

(1 南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院,無錫 214081;2 中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心,漁業(yè)微化學實驗室,無錫 214081;3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻漁綜合種養(yǎng)生態(tài)重點實驗室,無錫 214081)

淡水貝類背角無齒蚌(Anodontawoodiana)原產(chǎn)于中國長江和黑龍江流域[10],現(xiàn)已廣泛分布于中國各地區(qū)乃至亞洲、歐洲、北美洲和非洲[11-14],具有食用、藥用和培育珍珠等重要經(jīng)濟價值[11]。此外,因其具有濾水能力強、生長過程無需額外投飼、抗逆性強且對污染物具有高吸收和低代謝性等特點,被認為是優(yōu)良的水質凈化物種[11-12]。研究表明,背角無齒蚌能夠有效凈化水體中的微藻、懸浮顆粒物和重金屬(如銅、鎘、鋁、鉻)[15-17];對于氮、磷的凈化效果則受到蚌養(yǎng)殖密度、處理時間及水體富營養(yǎng)化程度等因素影響變動較大[16-18]。例如,陳修報等[18]和Kim等[19]通過構建微型生態(tài)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌對水體低含量亞硝酸鹽氮(0.001～0.008 mg/L)影響不明顯;李萍[20]研究結果顯示背角無齒蚌對水體較高含量亞硝酸鹽氮(0.43±0.04 mg/L)顯示出凈化作用,且去除率可達到55.8%。然而,背角無齒蚌的養(yǎng)殖密度、處理時間與亞硝酸鹽氮凈化效果之間的耦合關系尚不清楚。

本研究擬通過構建亞硝酸鹽氮污染的微型生態(tài)系統(tǒng),探究亞硝酸鹽氮脅迫下背角無齒蚌的濾水率變化,及其不同養(yǎng)殖密度和處理時間對亞硝酸鹽氮凈化效果的耦合效應,為養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮生物凈化以及養(yǎng)殖尾水達標排放提供參考。

1 材料與方法

1.1 背角無齒蚌來源

背角無齒蚌來自中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地,挑選24只同批繁養(yǎng)的規(guī)格相似的個體,殼長為11.8±0.5 cm,活體質量為117.5±29.0 g。其中,6只蚌用于測定濾水率,試驗前在曝氣72 h的自來水中暫養(yǎng)1周;其余18只蚌用于亞硝酸鹽氮凈化效果試驗,試驗前在200目紗絹過濾過的池塘水中暫養(yǎng)1周。暫養(yǎng)期間,水溫控制在25.0±1 ℃;每天投喂一次密度約為106cells/mL小球藻(Chlorellavulgaris),攝食3 h后進行全部換水。

1.2 濾水率的測定

將用于測定濾水率的6只背角無齒蚌隨機均分為空白組和亞硝酸鹽氮暴露組?？瞻捉M的養(yǎng)殖用水為曝氣72 h的自來水,亞硝酸鹽氮含量未檢出。鑒于江河、湖泊、水庫和池塘等養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮含量一般不超過1.0 mg/L[2],因此,亞硝酸鹽氮暴露組通過向曝氣自來水中加入亞硝酸鈉(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)配制成亞硝酸鹽氮理論質量濃度為1.0 mg/L的溶液。參考Zhang等[21]研究方法并略加改進,測定不同組別中背角無齒蚌的濾水率(Clearance rate,CR)。具體步驟如下:在2 L玻璃呼吸室中加入密度約為106cells/mL的小球藻,每個呼吸室中放入1只背角無齒蚌,攝食時間精準控制在1 h,顯微鏡檢攝食前后呼吸室中小球藻密度變化。試驗期間的水溫保持在25.0±1 ℃。每個組別設置3個平行試驗組。測定結束后,將蚌解剖取出軟組織,于80 ℃干燥24 h并稱重。濾水率的計算公式為[21]:

(1)

式中:V指呼吸室中水體的體積(L);C0指呼吸室中小球藻的初始密度(cells/mL);Ct指試驗結束后呼吸室中小球藻的密度(cells/mL);W指背角無齒蚌軟組織干重(g);T指試驗持續(xù)時間(h)。

1.3 微型生態(tài)系統(tǒng)的建立

在室內建立12個微型生態(tài)系統(tǒng)。向12個規(guī)格為100 cm × 45 cm × 50 cm(長×寬×高)的玻璃缸分別注入100 L經(jīng)75 μm孔徑紗絹過濾的池塘水(取自中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地池塘)。池塘水中亞硝酸鹽氮的背景含量為0.006±0.002 mg/L。向各個玻璃缸中分別加入0.15 g亞硝酸鈉(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)配制成亞硝酸鹽氮理論質量濃度為1.0 mg/L的養(yǎng)殖水體。之后,參考已報道的背角無齒蚌凈化水質的養(yǎng)殖密度[18,20]及預試驗結果,設置低(放入1只蚌;養(yǎng)殖密度為10只/m3)、中(放入2只蚌;養(yǎng)殖密度為20只/m3)和高(放入3只蚌;養(yǎng)殖密度為30只/m3)密度處理組,并設置對照組(不放蚌;養(yǎng)殖密度為0只/m3)。每個組別均設置3個平行試驗組。此外,依據(jù)魏小飛等[16]研究結果表明背角無齒蚌在短時間內(48 h)可有效凈化水體中的總氮,設定試驗周期為96 h。試驗過程中不投飼,不增氧,水溫控制在25±1 ℃。試驗期間無蚌死亡現(xiàn)象。

1.4 養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮含量的測定

在凈水試驗起始點(0 h)及開始后的24、48、72和96 h,分別于微型生態(tài)系統(tǒng)的中央位置虹吸50 mL養(yǎng)殖水體,儲存在聚丙烯采樣瓶中。之后,用去離子水補齊微型生態(tài)系統(tǒng)中的養(yǎng)殖水體至100 L。然后,使用DR6000型多參數(shù)水質分析儀(美國,哈希公司),應用重氮化方法,測定養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的含量。

1.5 去除率和凈化效率的計算方法

鑒于微型生態(tài)系統(tǒng)中亞硝酸鹽氮受到環(huán)境因素和背角無齒蚌作用的共同影響,因此,應用去除率(Removal efficiency,RE)[22]分析背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮的凈化程度:

(2)

式中:CB是各時間點對照組養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的含量(mg/L);CT是各時間點不同養(yǎng)殖密度蚌處理組養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的含量(mg/L)。RE>0表示蚌能夠對亞硝酸鹽氮起到去除作用,而RE<0表示亞硝酸鹽氮含量不降反升。

進而,應用凈化效率(Purification efficiency,PE)[23]分析背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮的凈化能力:

(3)

式中:CB是各時間點對照組養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的含量(mg/L);CT是各時間點不同養(yǎng)殖密度蚌處理組養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的含量(mg/L);V是指微型生態(tài)系統(tǒng)中水體積(L);t是指處理時間(h);W指蚌軟組織干重(g)。

1.6 統(tǒng)計分析

應用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件的獨立樣本T檢驗,比較空白組和亞硝酸鹽氮暴露組中背角無齒蚌的濾水率;用單因素方差分析(one-way ANOVA),比較微型生態(tài)系統(tǒng)的對照組和不同養(yǎng)殖密度蚌處理組中養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮含量,蚌對亞硝酸鹽氮的去除率(RE),以及蚌對亞硝酸鹽氮凈化效率(PE)之間的差異;用雙因素方差分析(two-way ANOVA),檢測RE、PE與蚌養(yǎng)殖密度和處理時間之間的關聯(lián)性。P<0.05表示差異水平顯著。此外,用Design-Expert 10.0統(tǒng)計軟件的最小二乘法擬合RE、PE與蚌養(yǎng)殖密度和處理時間之間的回歸關系,并用響應面分析法(response surface methodology)驗證RE和PE。

2 結果

2.1 背角無齒蚌濾水率變化

空白組中背角無齒蚌的濾水率為232.1±122.3 L/(h·kg),變化范圍為94.6～328.7 L/(h·kg)。在亞硝酸鹽氮暴露組中,背角無齒蚌的濾水率為69.0±17.7 L/(h·kg),變化范圍為58.0～89.5 L/(h·kg)。雖然亞硝酸鹽氮暴露組中背角無齒蚌的平均濾水率低于空白組,但是兩者并未達到顯著差異水平(P>0.05)。

2.2 背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮的凈化效果

2.2.1 亞硝酸鹽氮含量變化

表1所示,對照組亞硝酸鹽氮含量在試驗期間沒有發(fā)生顯著變化(P>0.05);低密度處理組(10只/m3)亞硝酸鹽氮含量在72 h和96 h顯著低于24 h和48 h(P<0.05);中密度處理組(20只/m3)亞硝酸鹽氮含量在試驗期間亦沒有發(fā)生顯著變化(P>0.05);而高密度處理組(30只/m3)亞硝酸鹽氮含量在72 h和96 h顯著低于24 h和48 h(P<0.05)。表1所示,24 h后不同組別之間亞硝酸鹽氮含量沒有顯著差異(P>0.05);48 h和72 h后低密度處理組亞硝酸鹽氮含量均顯著低于對照組(P<0.05)和中密度處理組(P<0.05);96 h后低密度處理組亞硝酸鹽氮含量與高密度處理組之間沒有顯著差異(P>0.05),但均顯著低于對照組(P<0.05)和中密度處理組(P<0.05)。綜合不同組別和處理時間可見,低密度組在處理96 h后亞硝酸鹽氮含量最低。

表1 背角無齒蚌對養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮的凈化效果

2.2.2 去除率變化

表1所示,低密度處理組和高密度處理組對亞硝酸鹽氮的去除率隨處理時間的增加而呈升高趨勢,在96 h的去除率均顯著高于24 h(P<0.05);中密度處理組對亞硝酸鹽氮的去除率總體保持不變(P>0.05)。表1所示,24 h后不同組別對亞硝酸鹽氮的去除率沒有顯著差別(P>0.05);48 h和72 h后低密度處理組的亞硝酸鹽氮去除率顯著高于中、高密度處理組(P<0.05);96 h后低、高密度處理組的亞硝酸鹽氮去除率顯著高于中密度處理組(P<0.05)。綜合不同組別和處理時間可見,低密度組在處理96 h后亞硝酸鹽氮去除率最高。

2.2.3 凈化效率變化

表1所示,低、中和高密度處理組在試驗期間對亞硝酸鹽氮的凈化效率均沒有發(fā)生顯著變化(P>0.05);24 h后低和高密度處理組的亞硝酸鹽氮凈化效率顯著高于中密度處理組(P<0.05);48 h、72 h和96 h后低密度處理組的亞硝酸鹽氮凈化效率顯著高于中、高密度處理組(P<0.05)。綜合不同組別和處理時間可見,低密度組在處理48 h和96 h后亞硝酸鹽氮凈化效率最高。

2.3 響應面分析法對去除率和凈化效率的驗證

應用響應面分析法建立亞硝酸鹽氮去除率(RE)、凈化效率(PE)與背角無齒蚌養(yǎng)殖密度(d)和處理時間(t)之間的回歸模型(圖1)。

圖1 背角無齒蚌對養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮的去除率

該模型P<0.05,表明其能夠有效耦合RE、PE與d和t之間的響應關系。相應的回歸方程為:

RE=166.671 17-168.944d-1.207 12t-0.037 058dt+40.830 5d2+0.016 07t2(R2=0.772 8)

PE=232.615 83-223.582 5d+0.493 82t-0.068 729dt+48.691 25d2-0.000 84t2(R2=0.956 0)

據(jù)此得出d和t的配比為10只/m3和96 h時,RE和PE達到最大值,分別為67.215 7%和90.746 6 mg/(h·kg)。這與微型生態(tài)系統(tǒng)試驗結果一致。

2.4 影響凈化效果的因子分析

由表2可見,背角無齒蚌對養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮含量的影響與養(yǎng)殖密度和處理時間顯著相關(P<0.05),而與兩者的交互作用關系不顯著(P>0.05)。對亞硝酸鹽氮的去除率與養(yǎng)殖密度和處理時間顯著相關(P<0.05),而與其交互作用關系不顯著(P>0.05)。亞硝酸鹽氮的凈化效率與養(yǎng)殖密度顯著相關(P<0.05),而與處理時間及養(yǎng)殖密度和處理時間的交互作用相關性不顯著(P>0.05)。

表2 背角無齒蚌的養(yǎng)殖數(shù)量和處理時間對養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮凈化效果的影響

3 討論

3.1 背角無齒蚌濾水率的變化特征

背角無齒蚌具有強大的濾水能力。本研究中空白組背角無齒蚌的濾水率為232.1±122.3 L/(h·kg),與Zhou等[23]報道的背角無齒蚌平均濾水率為260 L/(h·kg)基本一致。此外,背角無齒蚌的濾水率顯著高于其他淡水貝類如三角帆蚌(Hyriopsiscuming)[24]。通過濾水作用,背角無齒蚌等水生動物能夠直接吸收水體中的溶解態(tài)污染物[2,5],也可以通過濾食藻類等間接吸收水環(huán)境中顆粒態(tài)/結合態(tài)污染物。因此,背角無齒蚌可以通過強大的濾水率發(fā)揮水質凈化作用。值得注意的是,背角無齒蚌的濾水率會受到環(huán)境因素(如水溫、污染脅迫)的影響[23-24]。本研究顯示背角無齒蚌受到亞硝酸鹽氮暴露后濾水率呈下降趨勢,這可能與亞硝酸鹽氮產(chǎn)生毒性作用致使背角無齒蚌啟動閉殼保護有關。盡管如此,可引起大部分養(yǎng)殖動物死亡的1.0 mg/L亞硝酸鹽氮[3],并未顯著降低背角無齒蚌的濾水率,說明背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮具有高耐受性。Soucek等[25]研究發(fā)現(xiàn)淡水貝類對亞硝酸鹽氮普遍具有高耐受性,如亞硝酸鹽氮對淡水麗蚌Lampsilissiliquoidea的96 h-LC50高達176.5 mg/L。背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮的耐受程度及其耐受機制有待進一步研究。

3.2 背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮的凈化效果

本研究中所有微型生態(tài)系統(tǒng)處于相同的時空環(huán)境中,試驗期間水體亞硝酸鹽氮含量表現(xiàn)出的差異應歸因于背角無齒蚌養(yǎng)殖密度和處理時間的不同。其中,亞硝酸鹽氮的最高含量(0.66±0.12 mg/L)出現(xiàn)在中密度組處理48 h后,盡管如此,與對照組亞硝酸鹽氮含量沒有顯著差異。而最低含量(0.20±0.06 mg/L)出現(xiàn)在低密度組處理96 h后,顯著低于對照組亞硝酸鹽氮含量,相應的去除率和凈化效率分別為(64.99±10.32)%和90.16±13.54 mg/(h·kg)。響應面分析法驗證了背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮去除率和凈化效率的可靠性。表明背角無齒蚌能夠對養(yǎng)殖水體較高的亞硝酸鹽氮起到凈化作用,這支持李萍[20]的研究結論。李萍[20]在背角無齒蚌的養(yǎng)殖密度為10只/m3、處理時間為43 d和58 d后,水體中的亞硝酸鹽氮含量顯著降低,且去除率可達到55.8%。值得注意的是,當養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮含量較低時(如0.001～0.008 mg/L),背角無齒蚌難以對亞硝酸鹽氮發(fā)揮凈化作用甚至還會引起亞硝酸鹽氮含量略微升高[18-19]。這應該是由于淡水貝類對水體中亞硝酸鹽氮等物質循環(huán)是吸收、轉化和排泄的動態(tài)過程[26],當水體中亞硝酸鹽氮含量低于背角無齒蚌的正常代謝時,代謝產(chǎn)物如氨氮經(jīng)氨氧化細菌硝化反應成亞硝酸鹽氮釋放到水體中導致的。在背角無齒蚌對水體總磷的凈化中也存在類似的現(xiàn)象。吳中奎等[17]就發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌對清水態(tài)水體中總磷難以起到凈化作用,但是能夠顯著降低富營養(yǎng)化水體中總磷含量。

在實際應用中,魚蚌混養(yǎng)能夠促進養(yǎng)殖循環(huán)經(jīng)濟發(fā)展,實現(xiàn)經(jīng)濟效益和生態(tài)效益“雙贏”[8-9]。例如,陳家長等[8]在循環(huán)水養(yǎng)魚池塘中吊養(yǎng)三角帆蚌,在收獲魚和蚌的同時,還將養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮含量降低16.95%～45.45%。因此,利用背角無齒蚌凈化養(yǎng)殖水體/尾水中亞硝酸鹽氮是可行的。

3.3 影響背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮凈化效果的因素

基于模擬現(xiàn)實中受亞硝酸鹽氮污染的養(yǎng)殖水體,本研究顯示背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮含量與去除率均受到養(yǎng)殖密度和處理時間的顯著影響,而凈化效率僅受到養(yǎng)殖密度的顯著影響,說明蚌養(yǎng)殖密度在養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮凈化效果中起到更為關鍵的作用。Geng等[27]研究結果也顯示養(yǎng)殖密度是三角帆蚌凈化水體氨氮和總磷的關鍵因素。目前,尚未見關于不同養(yǎng)殖密度背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮污染水體凈化效果的比較研究。李萍[20]將背角無齒蚌的養(yǎng)殖密度設置為10只/m3能夠將水體亞硝酸鹽氮去除55.8%。而本研究比較了低(10只/m3)、中(20只/m3)和高(30只/m3)養(yǎng)殖密度的背角無齒蚌及其不同處理時間對養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮的凈化效果,證實了低養(yǎng)殖密度對亞硝酸鹽氮的凈化效果最佳。需要注意的是,過高的養(yǎng)殖密度[28]及亞硝酸鹽氮產(chǎn)生的毒性作用[29],一方面可降低淡水貝類的濾水率[29],另一方面會增加淡水貝類的氮(包括氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮)排出率[30];氨氮和硝酸鹽氮可分別經(jīng)硝化反應和還原反應轉化為亞硝酸鹽氮[2];從而造成養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的吸收率甚至低于生成率的情形。因此,在利用背角無齒蚌凈化養(yǎng)殖水體/尾水亞硝酸鹽氮的過程中,要根據(jù)亞硝酸鹽氮含量的實際情況設定適宜的蚌養(yǎng)殖密度。綜合李萍[20]和本研究結果,建議將背角無齒蚌的養(yǎng)殖密度設定為10只/m3以凈化養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮。此外,本研究顯示背角無齒蚌在10只/m3的養(yǎng)殖密度下,對亞硝酸鹽氮凈化效果隨著處理時間的延長而逐步增強,提示延長處理時間應該會進一步增強背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮的凈化效果。

4 結論

本研究通過構建呼吸室和微型生態(tài)系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮具有高耐受性,并能起到有效凈化作用。背角無齒蚌對亞硝酸鹽氮的去除率和凈化效率分別可高達(64.99±10.32)%和90.16±13.54 mg/(h·kg)。在利用背角無齒蚌進行養(yǎng)殖水體/尾水的亞硝酸鹽氮的凈化過程中,建議將蚌養(yǎng)殖密度設定為10只/m3。