盧愛民，尹君，李春峰，龍大偉

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230000

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬太和中醫(yī)院 安徽太和 236600

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是以絕經(jīng)后女性為發(fā)病群體的全身性骨代謝性疾病[1]。骨形成和骨吸收失衡所導(dǎo)致的骨重塑負(fù)性平衡引起骨量的流失，骨組織微結(jié)構(gòu)被破壞，易發(fā)生脆性骨折[2]。流調(diào)顯示[3]我國(guó)50 歲以上女性群體骨質(zhì)疏松癥患病率達(dá)32.1%，顯著高于歐美國(guó)家。預(yù)測(cè)顯示[4]到2050 年中國(guó)≥50 歲人群骨質(zhì)疏松癥相關(guān)性骨折將達(dá)599 萬(wàn)例。而且骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重后果，特別是髖部骨折，具有高致死率及致殘率[5]。盡管鈣劑和骨吸收抑制劑雙磷酸鹽類是臨床基礎(chǔ)治療和一線用藥[6]，但其副作用也大大降低了患者的依從性。研究發(fā)現(xiàn)[7]補(bǔ)腎復(fù)方對(duì)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、激素或細(xì)胞因子表達(dá)、骨代謝及多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)效果顯著。凌家艷等通過補(bǔ)腎通絡(luò)方對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的研究顯示[8]補(bǔ)腎復(fù)方可有效改善去勢(shì)大鼠性激素水平及骨密度，且可通過上調(diào)去卵巢大鼠子宮內(nèi)膜雌激素受體（ERα）表達(dá)，調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，起到干預(yù)PMOP 的作用。而且馬陳等研究[9]發(fā)現(xiàn)青娥丸組PMOP 患者治療后β-catenin 蛋白水平較治療前顯著升高。此外韓學(xué)明等在對(duì)PMOP 患者與健康絕經(jīng)后女性的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)PMOP 組β-catenin 蛋白水平明顯低于健康絕經(jīng)后女性[10]。因此本研究基于“腎主骨生髓”理論觀察補(bǔ)腎活血湯聯(lián)合抗骨質(zhì)疏松癥藥物對(duì)β-catenin 蛋白表達(dá)的影響并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析。

資料與方法

1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]：①絕經(jīng)后女性；②髖部或椎體發(fā)生脆性骨折者；③中軸骨BMD 或橈 骨 遠(yuǎn) 端1/3BMD 的DXA 測(cè)T- 值≤-2.5；④BMD測(cè)量符合低骨量（-2.5＜T-值＜-1.0）同時(shí)伴脆性骨折（肱骨近端、骨盆或前臂遠(yuǎn)端）。（除①外另須符合②、③、④其中之一）

2 入組標(biāo)準(zhǔn)

2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合如上診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②辨證分型為腎虛血瘀證者；②患者年齡50 ～65 歲，且原發(fā)型絕經(jīng)時(shí)間≥1 年；③參與本研究半年前無(wú)抗骨質(zhì)疏松癥相關(guān)治療者；④自愿參與本研究并簽署知情同意書者。

2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①伴有較嚴(yán)重心肺功能性異?；蚱髻|(zhì)性病理改變者；②伴有肝腎代謝功能異?；蚪诜眉に刂苿┱撸虎郯橛屑谞钕俟δ墚惓Ｕ?；④伴有胃腸功能明顯異常者；⑤伴有精神障礙或認(rèn)知異常者；⑥治療周期內(nèi)由于依從性等問題未能完成有效治療者。

3 一般資料

2020 年9 月—2022 年6 月就診于安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬太和中醫(yī)院骨科門診或健康體檢中心的PMOP患者中篩選符合納入標(biāo)準(zhǔn)的72 例患者，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為觀察組36 例和對(duì)照組36 例。觀察組患者年齡50 ～62 歲，平均年齡（56.42±2.75）歲；絕經(jīng)時(shí)間1 ～7 年，平均時(shí)間（3.33±1.74）年；體重指 數(shù)20 ～30kg/m2，平 均 指 數(shù)（22.61±2.82）kg/m2。對(duì)照組患者年齡50 ～61 歲，平均年齡（55.72±2.78）歲；絕經(jīng)時(shí)間1 ～7 年，平均時(shí)間（3.78±1.69）年；體重指數(shù)20 ～31kg/m2，平均指數(shù)（23.25±2.97）kg/m2。2 組患者的一般資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療結(jié)果具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)研究批準(zhǔn)，且均獲得了入組PMOP 患者同意并簽署了知情同意書。

4 治療方法

4.1 對(duì)照組 予以鈣劑，碳酸鈣片（珠海同源藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44024255，0.75g×30 片，片劑），每日3 次，每次1 片；骨吸收抑制劑，阿侖膦酸鈉（北京福元醫(yī)藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H20059029，70mg×4 片，片劑），每周1次，每次1 片。上述治療藥物連續(xù)服用周期3 個(gè)月，定期隨訪記錄不良反應(yīng)情況。

4.2 觀察組 在對(duì)照組用藥基礎(chǔ)上予以補(bǔ)腎活血湯。補(bǔ)腎活血湯出自《傷科大成》，組方包括熟地、補(bǔ)骨脂、菟絲子各10g，杜仲、枸杞、歸尾、山萸肉、蓯蓉、沒藥、獨(dú)活各3g，紅花2g，由我院中藥房統(tǒng)一煎煮，日1 劑，2 分服，連續(xù)服用3 個(gè)月。

5 觀察指標(biāo)與療效評(píng)估

5.1 觀察指標(biāo) 包括①骨密度：腰椎L1-4BMD、左側(cè)股骨頸BMD；②骨形成標(biāo)志物 PINP；③骨吸收標(biāo)志物S-CTX；④β-catenin 蛋白；⑤雌二醇E2；⑥中醫(yī)證候量表總積分[11]，見表1。

表1 中醫(yī)證候量表

5.2 檢測(cè)方法 使用康源國(guó)際醫(yī)療器械公司DEXA雙能X 線骨密度儀檢測(cè)2 組患者治療前后的腰椎L1-4BMD、左側(cè)股骨頸BMD；抽取2 組患者治療前后靜脈血5mL（禁食水6h 后空腹靜脈血），在3000 r/min 離心15 min 后收集血清，使用相應(yīng)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供）通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)PINP、S-CTX、β-catenin 蛋白水平；常規(guī)方法采血化驗(yàn)血清E2水平。

5.3 療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[12]將臨床療效劃分為痊愈、顯效、有效、無(wú)效四級(jí)，采用尼莫地平法進(jìn)行療效評(píng)定。癥狀療效指數(shù)（R）＝[（治療前證候總積分-治療后證候總積分）/治療前證候總積分]×100%。痊愈：R ≥90%；顯效：60%≤R＜90%；有效：30%≤R＜60%；無(wú)效：R＜30%。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，各組進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，符合條件采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合采用曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)（Mann-Whitney U test）；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)（四格表法）；相關(guān)性檢驗(yàn)采用 Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 2 組治療前后骨密度結(jié)果比較

2 組治療前患者腰椎L1-4BMD 和左側(cè)股骨頸BMD 進(jìn)行組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），數(shù)據(jù)具有可比性。2 組治療后患者腰椎L1-4BMD 和左側(cè)股骨頸BMD 均較治療前增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且觀察組指標(biāo)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 2 組腰椎L1-4BMD 和左側(cè)股骨頸BMD 比較（±s）

表2 2 組腰椎L1-4BMD 和左側(cè)股骨頸BMD 比較（±s）

BMD/g·cm-2 例數(shù) 觀察組 對(duì)照組 t組間 P組間治療前腰椎（L1-4） 36 0.664±0.039 0.659±0.033 -0.489 0.097治療后腰椎（L1-4） 36 0.818±0.052 0.774±0.039 -4.023 0.001 t組內(nèi) -60.216 -65.366 P組內(nèi) 0.000 0.000治療前左側(cè)股骨頸 36 0.709±0.044 0.708±0.039 -0.141 0.172治療后左側(cè)股骨頸 36 0.805±0.032 0.748±0.038 -6.869 0.000 t組內(nèi) -42.275 -25.690 P組內(nèi) 0.000 0.000

2 2 組治療前后骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)（BTM）結(jié)果比較

2 組治療前患者PINP 和S-CTX 表達(dá)水平進(jìn)行組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），數(shù)據(jù)具有可比性。2 組治療后患者PINP 和S-CTX 表達(dá)水平均較治療前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且治療后觀察組指標(biāo)水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 2 組骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)PINP、S-CTX 水平比較（±s）

表3 2 組骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)PINP、S-CTX 水平比較（±s）

指標(biāo) 治療前后 例數(shù) 觀察組 對(duì)照組 t組間 P組間PINP/ng·mL-1 治療前 36 64.39±15.868 63.97±16.184 -0.110 0.854治療后 36 43.78±8.333 49.56±10.840 2.535 0.017 t組內(nèi) 14.358 14.818 P組內(nèi) 0.000 0.000 S-CTX/ng·mL-1 治療前 36 0.886±0.144 0.897±0.140 0.332 0.705治療后 36 0.489±0.098 0.597±0.111 4.396 0.000 t組內(nèi) 30.741 34.225 P組內(nèi) 0.000 0.000

3 2 組治療前后中醫(yī)證候總積分比較

2 組治療前患者中醫(yī)證候總積分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），數(shù)據(jù)具有可比性。2 組治療后患者中醫(yī)證候總積分均較治療前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且觀察組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。中醫(yī)證候總積分 例數(shù) 治療前 治療后 t組內(nèi)P組內(nèi)

表4 2 組治療前后中醫(yī)證候總積分比較（±s）

表4 2 組治療前后中醫(yī)證候總積分比較（±s）

觀察組 36 15.56±4.01 7.58±3.64 27.109 0.000對(duì)照組 36 15.08±3.66 9.53±3.79 24.481 0.000 t組間 -0.522 2.221 P組間 0.303 0.018

4 2 組治療前后β-catenin 蛋白表達(dá)水平、血清E2 水平比較

2 組治療前患者β-catenin 蛋白水平、血清E2水平進(jìn)行組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），數(shù)據(jù)具有可比性。2 組治療后與治療前β-catenin 蛋白水平、血清E2水平進(jìn)行組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且治療后觀察組指標(biāo)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 2 組β-catenin 蛋白和血清E2 水平比較（±s）

表5 2 組β-catenin 蛋白和血清E2 水平比較（±s）

例數(shù) 觀察組 對(duì)照組 t組間 P組間治療前β-catenin/pg·mL-1 36 19.03±3.99 18.83±3.76 -0.213 0.780治療后β-catenin/pg·mL-1 36 26.67±3.94 23.14±3.61 -3.963 0.001 t組內(nèi) -28.223 -32.855 P組內(nèi) 0.000 0.000治療前E2/pg·mL-1 36 12.14±3.31 12.42±3.51 0.346 0.651治療后E2/pg·mL-1 36 18.64±4.66 16.19±4.29 -2.317 0.028 t組內(nèi) -25.026 -20.637 P組內(nèi) 0.000 0.000

5 2 組治療后有效率比較

2 組治療結(jié)束后有效率進(jìn)行比較，有效率包括痊愈率、顯效率和有效率。觀察組有效率為91.67%；對(duì)照組有效率為71.22%，觀察組有效率明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明觀察組療效更優(yōu)，見表6。

6 不良反應(yīng)情況

2 組患者治療期間均出現(xiàn)了兩例患者嘔吐不適的胃腸反應(yīng)，觀察組嘔吐患者考慮是由于空腹服用中藥湯劑引起的胃腸不適，且調(diào)整為餐后服用后未再出現(xiàn)；對(duì)照組嘔吐患者考慮是由于較長(zhǎng)期服用藥物引起的不適。其他不良反應(yīng)在治療期間無(wú)明顯表現(xiàn)。

7 β-catenin 蛋白與BMD、BTM、中醫(yī)證候總積分、血清E2 治療前后相關(guān)性分析

治療前后72 例患者β-catenin 蛋白表達(dá)水平與各觀察指標(biāo)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，與患者BMD、E2在治療前和治療后均呈正相關(guān)性（P＜0.01），與PINP、S-CTX、中醫(yī)證候總積分在治療前和治療后均呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.01），見表7。

表7 治療前后β-catenin 蛋白相關(guān)性分析

討 論

PMOP 在中醫(yī)歸屬“骨痿、骨枯”范疇，中醫(yī)病機(jī)主要為“腎虛精虧、髓減骨枯、筋骨失養(yǎng)”，與腎臟關(guān)系密切[13]。《素問·上古天真論篇》記載：“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長(zhǎng)……四七，筋骨堅(jiān)，發(fā)長(zhǎng)極，身體盛壯?！标U明腎精充足，則髓充骨堅(jiān)。PMOP 的發(fā)病與腎精不足而致髓化乏源、骨失所養(yǎng)密切相關(guān)[14]。因此補(bǔ)腎填精是治療PMOP 的基本治療大法。此外研究顯示補(bǔ)腎活血湯配合常規(guī)抗骨質(zhì)疏松藥物，對(duì)于抑制骨量丟失，改善骨微結(jié)構(gòu)療效顯著，且具有高安全性、低副作用特點(diǎn)[15]。 本研究組方中熟地黃、山茱萸、杜仲、枸杞子、補(bǔ)骨脂、菟絲子補(bǔ)腎強(qiáng)筋而壯骨；當(dāng)歸、沒藥、紅花活血祛瘀而新。且本研究結(jié)果顯示補(bǔ)腎活血湯可顯著提高患者骨密度水平，改善患者中醫(yī)證候表現(xiàn)，這與王俊杰研究結(jié)果基本一致[16]。此外觀察組患者治療后血清E2水平較治療前明顯提高，表明補(bǔ)腎活血方可有效改善患者雌激素低水平狀態(tài)。李莉等在對(duì)OVX 大鼠模型研究[17]亦發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎法六味地黃湯可顯著提高其血清E2水平，改善骨密度，推測(cè)與其類激素樣作用密不可分。Wei 等通過對(duì)單味補(bǔ)腎藥淫羊藿有效成分淫羊藿苷的研究發(fā)現(xiàn)[18]其可以顯著上調(diào)成骨基因ERα 和Wnt 信號(hào)通路蛋白β-catenin 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)BMSCs 的成骨分化。這表明補(bǔ)腎類單味藥或復(fù)方對(duì)雌激素的正向調(diào)控作用。

此外骨轉(zhuǎn)換高速率的增加是骨量流失的主要原因[2]，而骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物（BTM）作為評(píng)估PMOP 治療效果的生化標(biāo)志物較BMD 而言更加敏感，此外還可以有效預(yù)測(cè)骨折風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)際骨質(zhì)疏松癥基金會(huì)（IOF）建議在骨質(zhì)疏松癥的臨床研究中使用骨形成指標(biāo)PINP 和骨吸收指標(biāo)S-CTX 作為療效參考指標(biāo)[19]。且本研究結(jié)果顯示補(bǔ)腎活血湯聯(lián)合療法顯著降低了BTM 表達(dá)水平。這與段俊紅等對(duì)肝腎陰虛型PMOP 患者的治療效果基本一致，均顯著改善了BMD 和BTM 水平[20]。

而β-catenin 蛋白作為經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白，其通過調(diào)控抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的脂肪分化，促進(jìn)成骨分化機(jī)制減少或抑制骨量流失[21]。Xia 等通過補(bǔ)腎活血方的研究發(fā)現(xiàn)與OVX 小鼠相比，灌胃補(bǔ)腎活血方小鼠的β-catenin 和ALP mRNA 表達(dá)顯著增強(qiáng)，而FABP4 mRNA 則顯著降低，呈現(xiàn)抑制骨量流失、改善骨微結(jié)構(gòu)、抑制脂肪分化效應(yīng)，但敲除β-catenin 表達(dá)基因的OVX 小鼠其β-catenin 蛋白表達(dá)量及成骨細(xì)胞增殖分化情況較未敲除小鼠顯著降低，表明補(bǔ)腎活血方的抗骨質(zhì)疏松作用主要通過β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)起作用[22]。本研究結(jié)果顯示觀察組β-catenin 蛋白表達(dá)水平效應(yīng)更明顯。此外許兵等通過補(bǔ)腎活血含藥血清培養(yǎng)體外成骨細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)[23]含藥血清組β-catenin、Runx2 及Osx mRNA 表達(dá)量顯著提高，且成骨細(xì)胞的增殖分化活性明顯高于對(duì)照組，可以推測(cè)補(bǔ)腎活血顆粒通過激活經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號(hào)通路增強(qiáng)了成骨細(xì)胞增值分化的效應(yīng)。這表明補(bǔ)腎活血方可有效改善PMOP患者體內(nèi)β-catenin 蛋白低表達(dá)水平，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)成骨分化。此外本研究通過對(duì)2 組患者治療前后體內(nèi)β-catenin 蛋白表達(dá)水平進(jìn)行的Pearson 相關(guān)性分析表明其作為Wnt 信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)水平的高低與降低PMOP 患者骨量流失，提高患者體內(nèi)雌激素水平，降低骨轉(zhuǎn)換率，改善患者中醫(yī)證候關(guān)系密切。

綜上，補(bǔ)腎活血湯聯(lián)合常規(guī)抗骨質(zhì)疏松藥物能夠有效增加PMOP 患者骨密度，促進(jìn)骨重塑正性平衡，提高患者體內(nèi)E2水平，改善患者中醫(yī)證候，促進(jìn)β-catenin 蛋白表達(dá)，有效調(diào)控Wnt 信號(hào)通路，有利于PMOP 的防治。