梁思柔,李 杰,藍(lán)彩碧,許銘本,陸家昌,謝 芳,韋 維,賴(lài)俊翔**,王英輝

(1.廣西大學(xué)資源環(huán)境與材料學(xué)院,廣西南寧 530006;2.廣西科學(xué)院,廣西北部灣海洋研究中心,廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530007; 3.北部灣海洋產(chǎn)業(yè)研究院,廣西防城港 538000;4.廣西大學(xué)海洋學(xué)院,廣西南寧 530006)

球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)是一種在全球海域范圍內(nèi)廣泛分布的、可引發(fā)有害藻華的藻類(lèi),其生命周期主要由游離單細(xì)胞和膠質(zhì)囊體交替完成[1]。從游離單細(xì)胞到膠質(zhì)囊體的轉(zhuǎn)變是球形棕囊藻藻華暴發(fā)的關(guān)鍵。膠質(zhì)囊體對(duì)于惡劣環(huán)境的抵御能力更強(qiáng)。囊體獨(dú)有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)如體積較大和多糖外被能夠使其不易遭受浮游動(dòng)物的攝食,以及防御病毒的感染和細(xì)菌侵蝕,從而保護(hù)囊體表面眾多的單細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖[2]。自2011年以來(lái),中國(guó)北部灣沿海水域頻繁暴發(fā)球形棕囊藻藻華,嚴(yán)重破壞了海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡[3]。因其囊體體積巨大及含溶血性毒素的特點(diǎn),球形棕囊藻形成的藻華對(duì)漁業(yè)、旅游業(yè)等經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重打擊,核電站冷源取水系統(tǒng)也因此受到安全威脅[4,5]。因此,球形棕囊藻藻華發(fā)生、維持和消亡機(jī)制受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,許多科學(xué)問(wèn)題亟待解決。

海水溫度對(duì)于浮游植物正常的生長(zhǎng)繁殖有著重要的影響。球形棕囊藻藻華主要在水溫相對(duì)低的季節(jié)暴發(fā),一般為冬季和春季,在一定程度上受到沿海季風(fēng)的影響,具有明顯的季節(jié)性特征[6]。相較于高溫環(huán)境條件,低溫條件下球形棕囊藻和南極棕囊藻(P.antarctica)更多以囊體細(xì)胞形態(tài)存在。球形棕囊藻的囊體直徑隨溫度的升高而減小,而南極棕囊藻的囊體直徑對(duì)溫度無(wú)明顯的響應(yīng)[7]。Xu等[8]在研究42種不同溫度和鹽度組合條件對(duì)球形棕囊藻生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),海水溫度低于15 ℃時(shí)球形棕囊藻南海株失去活力并停止生長(zhǎng)。Wang等[7]的研究表明,在20 ℃時(shí)球形棕囊藻主要以囊體形態(tài)存在,當(dāng)海水溫度高于24 ℃時(shí),游離單細(xì)胞形態(tài)在藻液中占主體地位。此外,李波等[9]對(duì)2014年北部灣近岸海域的兩次球形棕囊藻藻華進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在藻華消亡過(guò)程中伴隨著明顯的海水溫度下降。球形棕囊藻從單細(xì)胞形態(tài)到囊體形態(tài)的轉(zhuǎn)變需要達(dá)到一定的密度條件,寒冷季節(jié)更有利于其完成形態(tài)的轉(zhuǎn)變,繼續(xù)繁殖從而形成棕囊藻藻華[10]。

細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)[11]是受到外界環(huán)境的脅迫刺激時(shí)發(fā)生的受基因調(diào)控的自發(fā)性細(xì)胞死亡,外界脅迫包括營(yíng)養(yǎng)鹽、光照、溫度、有毒物質(zhì)脅迫等。目前在藍(lán)藻、綠藻、硅藻、甲藻及銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)等浮游植物中廣泛開(kāi)展了PCD的研究。Dingman等[12]發(fā)現(xiàn)在37 ℃和40 ℃時(shí),赤潮異灣藻(Heterosigmaakashiwo)會(huì)出現(xiàn)熱誘導(dǎo)PCD的生理響應(yīng),而溫度上升到50 ℃之后細(xì)胞壞死。熱應(yīng)激誘導(dǎo)嗜糖小球藻(Chlorellasaccharophila)細(xì)胞出現(xiàn)PCD,具體表現(xiàn)為染色質(zhì)濃縮、DNA碎片化、細(xì)胞收縮和質(zhì)膜分離,以及Caspase-3的激活[13]。在環(huán)境相關(guān)的熱應(yīng)激劑量下,?？c其共生藻蟲(chóng)黃藻(Zooxanthellae)同時(shí)發(fā)生PCD和壞死[14]?？梢?jiàn),熱脅迫能夠誘導(dǎo)一些藻類(lèi)發(fā)生PCD及其相關(guān)的生理響應(yīng)過(guò)程,而溫度因素在球形棕囊藻生活史的全過(guò)程中能夠產(chǎn)生一定的影響。基于此,本研究通過(guò)梯度升溫降溫實(shí)驗(yàn),研究不同培養(yǎng)溫度以及溫度變化下球形棕囊藻的生理生化響應(yīng)及PCD過(guò)程,為探究球形棕囊藻藻華的生消機(jī)制及其防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)球形棕囊藻藻株采自欽州灣近岸赤潮發(fā)生海域,純種培養(yǎng),保存于廣西北部灣海洋研究中心微藻種質(zhì)資源庫(kù),編號(hào)BBW-PG02。采用鹽度為30的f/2培養(yǎng)基[15],培養(yǎng)溫度為20 ℃,光照強(qiáng)度為100 μmol/(m2·s),光暗比為12 h∶12 h。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的球形棕囊藻通過(guò)20 μm的篩絹濾除囊體,收集游離單細(xì)胞用于梯度升溫降溫實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器設(shè)備

全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan GO,賽默飛世爾科技公司),倒置熒光顯微鏡[Nikon TS-100,尼康儀器(上海)有限公司],紫外分光光度計(jì)(T6,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),人工氣候箱(ZRG-450B,上海丙林電子科技有限公司),高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3-18K,德國(guó)Sigma公司)。

1.3 梯度升溫降溫實(shí)驗(yàn)

基于球形棕囊藻藻華季節(jié)性暴發(fā)的特征,設(shè)置梯度升溫降溫實(shí)驗(yàn)。球形棕囊藻藻華頻繁暴發(fā)的欽州灣海域的海水溫度年均變化范圍為14-30 ℃,因此設(shè)置梯度降溫最低降至12 ℃,梯度升溫最高升至32 ℃。對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)保持初始培養(yǎng)溫度不變。梯度升溫降溫實(shí)驗(yàn)的溫度設(shè)置如圖1所示。采用f/2培養(yǎng)基,初始培養(yǎng)溫度為20 ℃,濕度為50%RH,光照強(qiáng)度為100 μmol/(m2·s),光暗比為12 h∶12 h。將球形棕囊藻單細(xì)胞接種至玻璃錐形瓶中,初始密度為1×104cells/mL,培養(yǎng)液總體積為2 L,實(shí)驗(yàn)周期為20 d。每組各設(shè)3個(gè)平行。隔天定時(shí)采樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

圖1 梯度升溫降溫實(shí)驗(yàn)中溫度的變化

1.4 取樣與測(cè)定

1.4.1 細(xì)胞密度測(cè)定

取2 mL藻液,經(jīng)20 μm的篩絹過(guò)濾獲得球形棕囊藻游離單細(xì)胞,加入1.5%魯哥-碘溶液固定,于25 ℃室溫下避光保存。使用100 μL浮游植物計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行球形棕囊藻游離單細(xì)胞密度的測(cè)定。再取1 mL藻液置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,在顯微鏡下隨機(jī)選取視野中30個(gè)囊體,進(jìn)行囊體密度、囊體直徑、囊體表面單細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定。所有顯微鏡計(jì)數(shù)都使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.4.2 細(xì)胞生長(zhǎng)率測(cè)定

細(xì)胞生長(zhǎng)率(μ)按照式(1)進(jìn)行計(jì)算:

(1)

式中,t為球形棕囊藻細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間;t0為計(jì)算生長(zhǎng)率時(shí)球形棕囊藻細(xì)胞的初始培養(yǎng)時(shí)間;Nt為t時(shí)球形棕囊藻的細(xì)胞數(shù);N0為t0時(shí)球形棕囊藻的細(xì)胞數(shù)。

1.4.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定

取10 mL藻液,4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集藻細(xì)胞。用0.1 mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌并重懸細(xì)胞,在冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞(250 W,5 min,工作3 s,間歇3 s)。4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集上清液用于測(cè)定。利用SOD試劑盒(WST-1法,南京建成生物工程研究所)進(jìn)行酶活性的測(cè)定,具體方法參照SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

1.4.4 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定

獲得粗酶液的方法同1.4.3節(jié)中獲取SOD的處理。按照CAT試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶活性的測(cè)定。

1.4.5 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性測(cè)定

獲得粗酶液的方法同1.4.3節(jié)中獲取SOD的處理。按照Caspase-3試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶活性的測(cè)定。

1.4.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

先取10 mL藻液,4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集藻細(xì)胞并用0.1 mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌,加入500 μL通透液,混勻,室溫處理20 min;再離心去上清液并用0.1 mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌一次;最后加入500 μL固定液固定10 min,離心去上清液并洗滌后完成預(yù)處理。根據(jù)Annexin V-FITC試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)后在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞的陽(yáng)性率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異(LSD)檢驗(yàn)分析。使用軟件為SPSS 26.0,顯著水平設(shè)置為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 梯度升溫降溫對(duì)球形棕囊藻生長(zhǎng)的影響

球形棕囊藻的游離單細(xì)胞生長(zhǎng)曲線[圖2(a)]顯示,相比于對(duì)照組,在首次降溫至16 ℃(第8天)時(shí),游離單細(xì)胞的生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制,游離單細(xì)胞密度明顯降低,在第12天溫度繼續(xù)下降至12 ℃時(shí),低溫對(duì)游離單細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用減小;首次升溫至24 ℃(第8天)時(shí),游離單細(xì)胞密度開(kāi)始顯著增加,當(dāng)溫度繼續(xù)上升至28 ℃(第12天),升溫組的游離單細(xì)胞密度開(kāi)始顯著下降,游離單細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制,且在第14天后升溫組和降溫組的游離單細(xì)胞密度接近。在第10天和第14天升溫組的囊體密度分別達(dá)到兩個(gè)峰值,在第12天囊體密度處于兩個(gè)峰值間的低谷,此時(shí)游離單細(xì)胞密度最高;降溫組的囊體密度變化總體上與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異[圖2(b)]。隨著溫度升高,囊體單位表面積的細(xì)胞數(shù)量呈增加趨勢(shì),在第16天升溫組球形棕囊藻出現(xiàn)PCD現(xiàn)象,囊體破碎、消亡[圖2:(b)、(c)]。除升溫組球形棕囊藻在第14天囊體直徑出現(xiàn)一個(gè)峰值隨后逐漸減小外,對(duì)照組和降溫組的囊體直徑整體都呈增大的趨勢(shì),且兩組的球形棕囊藻囊體直徑均顯著大于升溫組[圖2(d)]。

圖2 梯度升溫降溫條件下球形棕囊藻的生長(zhǎng)變化趨勢(shì)

實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)不同溫度處理組的球形棕囊藻的細(xì)胞生長(zhǎng)率見(jiàn)表1。由表1可知,第10天升溫組的球形棕囊藻的細(xì)胞生長(zhǎng)率達(dá)到最大,為(0.65±0.39) d-1,遠(yuǎn)高于其他兩組,此時(shí)溫度升高促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。隨后升溫組的球形棕囊藻的細(xì)胞生長(zhǎng)速率放緩,在第14天率先進(jìn)入負(fù)增長(zhǎng)階段。從第16天開(kāi)始,3組球形棕囊藻都進(jìn)入了負(fù)增長(zhǎng)階段。在第18天,升溫組的球形棕囊藻的負(fù)生長(zhǎng)率達(dá)到最大,為(-0.68±0.16) d-1,遠(yuǎn)高于其他兩組。

表1 不同溫度處理組的球形棕囊藻在不同時(shí)間的細(xì)胞生長(zhǎng)率

2.2 梯度升溫降溫對(duì)球形棕囊藻氧化系統(tǒng)的影響

在由24 ℃升溫至28 ℃的前4 h內(nèi),升溫組的SOD活性和CAT活性明顯高于其他兩組,且在0 h時(shí)達(dá)到24 h內(nèi)的一個(gè)峰值。4 h后,升溫組的SOD活性和CAT活性逐漸降低,但總體略高于其他兩組(圖3)。在0-2 h,降溫組的SOD活性低于對(duì)照組,之后兩組的SOD活性水平逐漸下降并趨于穩(wěn)定,且兩組SOD的活性水平大體相當(dāng)[圖3(a)]。在0 h,降溫組的CAT活性水平顯著高于對(duì)照組,2 h后降溫組的CAT活性水平開(kāi)始下降并逐漸表現(xiàn)出低于對(duì)照組的現(xiàn)象,對(duì)照組和降溫組的CAT活性水平變化呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)[圖3(b)]。

Letters are labeled as multiple comparison of LSD,the same letter indicates no significant difference between different treatment groups,and different letters indicate significant difference between different treatment groups,and the difference level is P<0.05.

2.3 梯度升溫降溫條件下Caspase-3活性的變化

在第8天首次出現(xiàn)溫度變化的前2 h內(nèi),降溫組和升溫組的Caspase-3活性水平都明顯高于對(duì)照組,其中降溫組的Caspase-3活性提高幅度略大于升溫組,表明升溫和降溫均使球形棕囊藻出現(xiàn)相應(yīng)的應(yīng)激響應(yīng)特征;隨后(24 h內(nèi))升溫組的Caspase-3活性保持在較高水平,而降溫組和對(duì)照組的活性水平都穩(wěn)定低于升溫組,沒(méi)有比較明顯的波動(dòng)[圖4(a)]。在第12天升溫組和降溫組的培養(yǎng)溫度繼續(xù)發(fā)生改變,0 h時(shí)升溫組的Caspase-3活性達(dá)到最高,其數(shù)值約是對(duì)照組和降溫組的20.2倍;隨后(24 h內(nèi))升溫組的Caspase-3水平相較于0 h有所下降,3個(gè)處理組的Caspase-3活性水平?jīng)]有較大的差異[圖4(b)]。由圖4可知,在第8-12天內(nèi)升溫組的Caspase-3活性持續(xù)升高。

Letters are labeled as multiple comparison of LSD,the same letter indicates no significant difference between different treatment groups,and different letters indicate significant difference between different treatment groups,and the difference level is P<0.05.

2.4 梯度升溫降溫對(duì)球形棕囊藻細(xì)胞凋亡的影響

早期細(xì)胞凋亡的特征之一就是細(xì)胞膜通透性增加,從而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)磷脂酰絲氨酸(PS)外翻現(xiàn)象,可通過(guò)Annexin V-FITC染色進(jìn)行特異性檢測(cè)。在第6、10、14、18天對(duì)3組藻細(xì)胞依次進(jìn)行Annexin V-FITC染色(圖5-7),升溫組在第14天最先出現(xiàn)綠色熒光陽(yáng)性反應(yīng),異硫氰酸熒光素(FITC)陽(yáng)性率為33.8%[圖6(c)],此時(shí)降溫組和對(duì)照組均尚未出現(xiàn)綠色熒光陽(yáng)性現(xiàn)象,即尚未檢測(cè)到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。在第18天 3組藻細(xì)胞都出現(xiàn)了綠色熒光陽(yáng)性反應(yīng)[圖5(d)、圖6(d)、圖7(d)],此時(shí)對(duì)照組、升溫組、降溫組的FITC陽(yáng)性率分別為30.77%、60.54%、38.14%。由圖5-7可以看出,雖然3組藻細(xì)胞都出現(xiàn)了細(xì)胞PS外翻現(xiàn)象,但是各組首次出現(xiàn)外翻現(xiàn)象的時(shí)間不同,外翻程度不同。升溫組的細(xì)胞PS外翻比例顯著高于其他兩組,該組出現(xiàn)細(xì)胞PS外翻的時(shí)間也早于其他兩組。降溫組與對(duì)照組出現(xiàn)細(xì)胞PS外翻的時(shí)間相同,均晚于升溫組,但降溫組細(xì)胞PS外翻比例略高于對(duì)照組。

3 討論

3.1 水溫變化與球形棕囊藻藻華生消的關(guān)系

海水溫度是浮游植物生長(zhǎng)的重要控制因子,從赤潮生物的細(xì)胞代謝到暴發(fā)性增殖均需要適宜的水溫條件,海水溫度是球形棕囊藻藻華生消過(guò)程中重要的影響因子之一。以北部灣近海為例,根據(jù)海洋監(jiān)測(cè)部門(mén)的文獻(xiàn)記錄,北部灣近岸海域球形棕囊藻藻華的暴發(fā)具有明顯的季節(jié)特征,近10年來(lái)北部灣近海球形棕囊藻藻華發(fā)生記錄均在氣溫相對(duì)較低的季節(jié)(10月至次年4月)[16]。王小冬[17]研究了溫度對(duì)球形棕囊藻囊體形成的影響,近10年欽州灣球形棕囊藻藻華期的水溫變化情況與其研究結(jié)果相符合。張棟[18]對(duì)2008-2018年欽州灣球形棕囊藻藻華的調(diào)查顯示,11月、12月發(fā)生藻華時(shí)的平均水溫主要為18.5-22.1 ℃;1月、2月發(fā)生藻華時(shí)的平均水溫相對(duì)較低,主要為15.6-18.5 ℃。球形棕囊藻藻華的暴發(fā)與季節(jié)變化密切相關(guān),而季節(jié)性變化不僅是溫度的變化,不同季節(jié)的干濕程度也各有不同。1月、2月降水量低于11月、12月,濕度較高時(shí),藻華暴發(fā)時(shí)的平均水溫也相應(yīng)較高;反之,濕度偏低時(shí),藻華暴發(fā)時(shí)的平均水溫也處于一個(gè)偏低的水平。雖然夏秋兩季降水量明顯提高,但平均水溫在24 ℃以上,不利于球形棕囊藻藻華暴發(fā)。

在梯度升溫降溫的實(shí)驗(yàn)中,濕度設(shè)置為50%RH,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在一個(gè)相對(duì)濕潤(rùn)的環(huán)境中,溫度升高到24 ℃時(shí)球形棕囊藻藻華暴發(fā),繼續(xù)升溫的過(guò)程中,過(guò)高的高溫脅迫壓力使得球形棕囊藻無(wú)法正常生長(zhǎng),發(fā)生大量消亡。在升溫到24、28 ℃時(shí),升溫組的球形棕囊藻藻細(xì)胞持續(xù)大量繁殖,在第16天其囊體表面細(xì)胞密度達(dá)到最高,遠(yuǎn)高于對(duì)照組與降溫組;隨后過(guò)高的高溫脅迫壓力使得球形棕囊藻囊體破裂,藻細(xì)胞開(kāi)始衰亡;在32 ℃時(shí)球形棕囊藻以游離單細(xì)胞形態(tài)存在,且數(shù)量較少,遠(yuǎn)低于相同培養(yǎng)周期的對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量。至此,升溫組的球形棕囊藻先于其他兩組出現(xiàn)藻細(xì)胞衰亡。在梯度降溫過(guò)程中,球形棕囊藻的生長(zhǎng)沒(méi)有出現(xiàn)暴發(fā)式增殖過(guò)程,且與對(duì)照組相比其生長(zhǎng)明顯受到抑制,藻細(xì)胞密度峰值明顯較低。低溫對(duì)球形棕囊藻生長(zhǎng)的抑制作用不可逆。在第16天,培養(yǎng)溫度由12 ℃回升到16 ℃后,降溫組的球形棕囊藻的生長(zhǎng)仍然受到抑制,但受抑制程度減小。

總體來(lái)看,溫度會(huì)影響球形棕囊藻的囊體大小。在本研究中,對(duì)照組的球形棕囊藻在培養(yǎng)周期中并沒(méi)有受到溫度變化帶來(lái)的壓力,其囊體直徑最大;低溫對(duì)藻細(xì)胞正常生長(zhǎng)的抑制使得降溫組的球形棕囊藻的囊體直徑較小;高溫脅迫壓力雖然能夠促使球形棕囊藻迅速生長(zhǎng)繁殖達(dá)到較高的細(xì)胞密度,但是也使其囊體的生長(zhǎng)受到限制,因此升溫組球形棕囊藻的囊體直徑最小。

3.2 梯度升溫降溫對(duì)球形棕囊藻生長(zhǎng)的影響

根據(jù)張棟[18]現(xiàn)場(chǎng)觀測(cè)結(jié)果,短期氣溫升高導(dǎo)致球形棕囊藻出現(xiàn)暴發(fā)式增長(zhǎng)后,表層水體和底層水體的球形棕囊藻囊體密度均達(dá)到峰值,底層水體的球形棕囊藻囊體密度遠(yuǎn)高于表層水體。這是由于表層水體易獲得太陽(yáng)光照,水面獲得的太陽(yáng)輻射能量多,水溫相比底層水體略高,在較小差異范圍內(nèi),溫度越高,球形棕囊藻受到的高溫脅迫壓力也隨之增大,所以球形棕囊藻的生長(zhǎng)開(kāi)始受到限制。

本研究結(jié)果顯示,在16 ℃和12 ℃時(shí)球形棕囊藻的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。在24 ℃時(shí),球形棕囊藻細(xì)胞出現(xiàn)暴發(fā)性增殖;在溫度繼續(xù)上升到28、32 ℃時(shí),球形棕囊藻的生長(zhǎng)受到明顯抑制甚至出現(xiàn)PCD現(xiàn)象。低溫脅迫會(huì)使浮游植物的光合作用速率下降,干擾其新陳代謝和正常的營(yíng)養(yǎng)吸收[19],與光合作用、呼吸作用等生理活動(dòng)有關(guān)的多種酶活性下降,嚴(yán)重影響生物體正常生長(zhǎng)發(fā)育[20]。與對(duì)照組相比,降溫組的球形棕囊藻生長(zhǎng)趨勢(shì)沒(méi)有明顯差異,但其培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞密度顯著低于對(duì)照組,同時(shí)低溫脅迫并未引發(fā)藻細(xì)胞PCD過(guò)程。

溫度的升高能夠逐漸誘導(dǎo)球形棕囊藻細(xì)胞的應(yīng)激響應(yīng)。囊體不僅能夠抵御外界侵蝕和攝食,且其獨(dú)特的中空結(jié)構(gòu)還能夠調(diào)節(jié)自身浮力,單位囊體表面積的細(xì)胞越多,保持浮力的能力就越強(qiáng),使其能夠在淺層海水表面漂浮以獲得更多的光照,促進(jìn)光合作用[21]。海水溫度升高過(guò)程中球形棕囊藻藻華暴發(fā),24 ℃時(shí)溫度升高加快了藻細(xì)胞的新陳代謝,細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)暴發(fā)性增殖的趨勢(shì),升溫組的囊體數(shù)量明顯高于其他兩組。短期升溫的過(guò)程中,浮游植物為了適應(yīng)高溫需要快速合成有機(jī)物質(zhì),細(xì)胞生長(zhǎng)率會(huì)明顯降低[22]。環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)有限,球形棕囊藻的快速增殖會(huì)加速消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),隨后其生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制。由于囊體具有更好的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)策略,囊體形態(tài)可以對(duì)抗高溫脅迫以及隨之而來(lái)的營(yíng)養(yǎng)脅迫。而球形棕囊藻游離單細(xì)胞需要達(dá)到一定密度才能形成囊體[10]。本研究升溫組在第8-12天游離單細(xì)胞數(shù)量激增,與第10天囊體密度達(dá)到第一個(gè)峰值是相對(duì)應(yīng)的。隨后在持續(xù)升溫脅迫下,因?yàn)榍耙淮蔚谋┌l(fā)性增殖加速消耗了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),使得此時(shí)升溫組細(xì)胞受到了更大的高溫和營(yíng)養(yǎng)限制壓力,細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始驟降,導(dǎo)致第12天時(shí)囊體數(shù)量出現(xiàn)驟減。升溫組囊體表面細(xì)胞密度一直呈上升趨勢(shì),在第16天達(dá)到最大,顯著高于其他兩組,隨后在高溫脅迫下囊體破裂,球形棕囊藻細(xì)胞開(kāi)始大量凋亡,無(wú)法再形成新的囊體。在第14-16天,升溫組囊體表面細(xì)胞密度增長(zhǎng)比第10-14天更加劇烈,這也說(shuō)明此時(shí)球形棕囊藻受到的高溫脅迫壓力越來(lái)越大。

3.3 梯度升溫降溫條件下球形棕囊藻PCD過(guò)程的響應(yīng)

非生物脅迫會(huì)打破生物體細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的動(dòng)態(tài)平衡,ROS的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激,損傷氧化系統(tǒng),ROS還可作為信號(hào)分子激活PCD。植物中清除ROS的抗氧化酶包括SOD、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)。SOD是清除ROS的第一道防線,它將超氧化物歧化為H2O2,隨后CAT、GPX和APX將H2O2降解成無(wú)害物質(zhì)[23]。已有研究表明,提高SOD和CAT等抗氧化酶的活性,能夠有效清除ROS,從而減少溫度脅迫對(duì)藻類(lèi)膜的氧化損傷[24]。本研究中,升溫到28 ℃的前4 h內(nèi)升溫組的SOD活性和CAT活性明顯高于其他兩組,此時(shí)高溫脅迫使得球形棕囊藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生比較強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激,從而誘導(dǎo)相關(guān)抗氧化酶活性增加以維持藻細(xì)胞自身生理穩(wěn)定。在之后(24 h內(nèi)),升溫組的抗氧化酶活性水平逐漸下降并穩(wěn)定在一個(gè)略高于對(duì)照組的水平,這說(shuō)明藻細(xì)胞對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生的氧化應(yīng)激只能被調(diào)節(jié)而不能完全消除,高溫脅迫還是在一定程度上破壞氧化系統(tǒng)的平衡。在降溫過(guò)程中,除0 h時(shí)降溫組的球形棕囊藻的CAT活性明顯高于對(duì)照組,總體上呈現(xiàn)出降溫組的CAT活性水平低于對(duì)照組的趨勢(shì),在正常的生理水平波動(dòng)范圍內(nèi),有時(shí)與對(duì)照組CAT活性水平相當(dāng)。這表明低溫脅迫對(duì)球形棕囊藻的氧化系統(tǒng)的影響不大,低溫使得其酶活性水平下降,影響其正常生理響應(yīng)。

高溫脅迫能夠觸發(fā)PCD通路,PCD的生理特征包括染色質(zhì)凝結(jié)、DNA碎片化、細(xì)胞收縮、質(zhì)膜從細(xì)胞壁分離和Caspase家族激活[12-14,25]。植物細(xì)胞的PCD過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)ROS的過(guò)度積累會(huì)改變線粒體結(jié)構(gòu)和功能,如線粒體形態(tài)改變、膜通透性增加、膜電位下降[26]。同時(shí)線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中與dATP結(jié)合觸發(fā)Caspase家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng),被激活的Caspase-9依次裂解并激活Caspase-3,這種級(jí)聯(lián)反應(yīng)會(huì)放大凋亡信號(hào),導(dǎo)致快速且不可逆的PCD過(guò)程[27,28]。浮游植物PCD的關(guān)鍵特征就是Caspase樣蛋白酶的激活[29]。在本研究中,高溫脅迫使球形棕囊藻的Caspase-3活性顯著提高,表明高溫脅迫使得PCD通路被激活,細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入PCD過(guò)程。膜通透性增加的表現(xiàn)就是PS外翻,這是細(xì)胞凋亡早期的顯著特征之一[30],其靶點(diǎn)是質(zhì)膜不對(duì)稱(chēng)性的喪失,細(xì)胞質(zhì)膜通透性增加導(dǎo)致外質(zhì)膜小葉PS殘基暴露,可以通過(guò)與PS有特異性結(jié)合作用的Annexin V來(lái)檢測(cè)出質(zhì)膜不對(duì)稱(chēng)性喪失的凋亡細(xì)胞[31,32]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象,在第14天升溫組的球形棕囊藻細(xì)胞先于對(duì)照組和降溫組檢測(cè)出細(xì)胞凋亡。在第18天3組球形棕囊藻細(xì)胞均檢測(cè)出細(xì)胞凋亡,但升溫組球形棕囊藻細(xì)胞的FITC陽(yáng)性率顯著高于其他兩組,細(xì)胞凋亡程度更大,這說(shuō)明高溫脅迫使得升溫組藻細(xì)胞進(jìn)入了早期PCD階段,隨后升溫組先于對(duì)照組發(fā)生大規(guī)模的細(xì)胞凋亡。低溫脅迫只能限制球形棕囊藻的正常生長(zhǎng)繁殖,但未誘導(dǎo)其出現(xiàn)PCD過(guò)程。

4 結(jié)論

梯度降溫條件下,球形棕囊藻的生長(zhǎng)受到抑制;梯度升溫條件下,球形棕囊藻出現(xiàn)暴發(fā)性增殖后發(fā)生PCD過(guò)程并大量消亡。低溫抑制了球形棕囊藻細(xì)胞內(nèi)與光合作用、呼吸作用等生理活動(dòng)有關(guān)的SOD和CAT的活性,影響其正常的生長(zhǎng)發(fā)育。球形棕囊藻可以通過(guò)大量形成囊體來(lái)抵抗高溫不利環(huán)境,但是囊體自身調(diào)節(jié)能力有限,最終高溫脅迫壓力和有限的營(yíng)養(yǎng)不僅限制球形棕囊藻的生長(zhǎng),而且誘導(dǎo)其進(jìn)入PCD過(guò)程。

梯度升溫過(guò)程中,球形棕囊藻出現(xiàn)氧化應(yīng)激,SOD和CAT的活性顯著升高。過(guò)量積累的ROS不能完全被球形棕囊藻自身清除,反而對(duì)其造成氧化損傷,且以此為信號(hào)激活PCD。梯度降溫抑制了球形棕囊藻抗氧化系統(tǒng)的正常生理響應(yīng),SOD和CAT的活性相比對(duì)照組略低。

高溫脅迫觸發(fā)PCD后,球形棕囊藻的Caspase-3活性顯著升高,部分藻細(xì)胞出現(xiàn)膜內(nèi)PS外翻的早期細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,最后球形棕囊藻通過(guò)PCD過(guò)程大量消亡。低溫條件下球形棕囊藻的生長(zhǎng)受到抑制,但不會(huì)出現(xiàn)PCD響應(yīng)。

本研究進(jìn)一步探究了球形棕囊藻對(duì)于環(huán)境溫度的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制,可以將高溫?zé)崦{迫引發(fā)的PCD響應(yīng)與球形棕囊藻藻華季節(jié)性暴發(fā)的特點(diǎn)相結(jié)合,從而為制定有效的有害藻華防治措施提供新的思路和理論依據(jù)。