周健平,謝云巧,廖雨虹,李昕洋,李一鳴,李淑萍,馬修國,雷詩敏,林 菲,

姜 偉2**,何勇強1,2**

(1.廣西大學農(nóng)學院,廣西南寧 530004;2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室(廣西大學),廣西大學生命科學與技術學院,廣西南寧 530004;3.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室(華南農(nóng)業(yè)大學),華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,廣東廣州 510642)

水稻(OryzasativaL.)是三大主要糧食作物之一,是全世界接近一半人口的主食,也是重要的工業(yè)原料之一[1]。水稻細菌性條斑病(Rice bacterial leaf streak)簡稱條斑病,俗稱紅葉病,是由稻黃單胞菌稻生致病變種[水稻細菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc)]侵染引起的一種細菌性病害。水稻發(fā)病后,造成條形葉斑、葉尖枯,光合作用下降,影響谷粒灌漿,一般減產(chǎn)15%-25%,嚴重時可達40%-60%[2]。該病已經(jīng)成為我國黃河以南多個稻區(qū)的主要水稻病害之一,嚴重影響水稻的安全生產(chǎn)。Xoc屬于外來入侵物種,是我國重要的檢疫對象之一[3]。鑒于目前尚缺少高抗細菌性條斑病的水稻品種[3],該病的防控主要依靠農(nóng)業(yè)措施和化學防治。盡管化學防治以其方便、快速、效果顯著等特點在水稻病害防治中發(fā)揮著重要作用,然而許多化學制劑有不可忽視的副作用,如化學殘留物、環(huán)境污染和害蟲抗性,顯然不符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。而生物防治是一種可持續(xù)的、實用的植物病害管理方法,是水稻病害防治的一種很有前途的替代策略[4]。

芽孢桿菌是一種厭氧或兼性厭氧、桿狀、內(nèi)生孢子的細菌,廣泛分布于整個環(huán)境中,是水稻生產(chǎn)中常用的生物防治劑,一般通過產(chǎn)生抑菌蛋白或抗菌肽等發(fā)揮其生防作用[5,6]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Lx-11能夠產(chǎn)生表面活性素(Surfactin)、桿菌霉素(Bacillomycin)和豐原素(Fengycin) 3類脂肽類抑菌物質(zhì),盆栽實驗證明Surfactin在控制Xoc侵染的過程中發(fā)揮了關鍵作用[7]。黃夢桑等[8]從辣椒根際土壤中分離篩選到對Xoc和水稻白葉枯病菌(X.oryzaepv.oryzae,Xoo)具有拮抗活性的高地芽孢桿菌(B.altitudinis) 181-7。AntiSMASH軟件預測結(jié)果顯示,181-7菌株中含有多個抑菌活性代謝產(chǎn)物基因簇,包括地衣桿菌素(Lichenysin)、溶桿菌素(Bacilysin)、Fengycin、細菌素(Bacteriocin)等。貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis) 504對黃單胞菌屬的細菌具有較好的抑菌活性,基因預測結(jié)果顯示,B.velezensis504含有fenA、dhbA、sfrAA、bmyA、beaS、dfnA及bacA等編碼脂肽類和聚酮糖類抑菌化合物的基因簇[5]。B.velezensis是芽孢桿菌屬的一個新種[9]。研究表明,B.velezensis的許多菌株具有抑制水稻病原菌生長和促進植物生長的能力。這些能力在很大程度上依賴于其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,如環(huán)脂肽(Surfactin、Bacillomycin D、Fengycin等)和聚酮類化合物[大環(huán)內(nèi)酰亞胺(Macrolactin)、桿菌烯(Bacillaene)和地非西丁(Difficidin)等][10-12]。

生防菌從研究成果轉(zhuǎn)化為應用產(chǎn)品需要階梯式的試驗與開發(fā)。發(fā)酵是影響生防菌研究與應用的重要因素,在微生物發(fā)酵過程中,不同的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件對其生長速度、菌體量及抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)出等具有顯著影響。石慧敏等[13]通過優(yōu)化發(fā)酵工藝,使B.velezensisYH-18的芽孢產(chǎn)量較LB (Luria-Bertani)初始培養(yǎng)基提高9.48倍。張曉云等[14]使用熊果苷作為菌株B.subtilisBAB-1產(chǎn)Surfactin的碳源,其Surfactin產(chǎn)量達到以葡萄糖為碳源時的3倍。喬俊卿等[15]利用響應曲面法優(yōu)化菌株B.subtilist-500的產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基后,成功檢測到菌株在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中不能生產(chǎn)的Fengycin。此外,即使是同一個種、屬的不同菌株,其最適發(fā)酵條件也往往因為菌株不同的遺傳背景、生理生化特性及環(huán)境適應性而存在差異[16,17]。以近年來報道的B.velezensis菌株最適發(fā)酵條件為例,楊可[18]優(yōu)化B.velezensisTCS001菌株的最佳發(fā)酵條件為溫度25 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)時間36 h;黎燕珊等[16]報道B.velezensisHC-8菌株的最佳發(fā)酵條件為溫度37 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)時間48 h;郭艷霞等[19]研究發(fā)現(xiàn)B.velezensisYB19菌株的最適培養(yǎng)溫度和時間分別為32 ℃和28 h。目前,國內(nèi)外已經(jīng)有許多關于生物防治水稻細菌性條斑病的研究,但是詳細的發(fā)酵條件研究還比較缺乏。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),從中藥材土貝母塊莖內(nèi)分離獲得的B.velezensisBR-01菌株對Xoc具有良好的拮抗效果,但還需要發(fā)酵數(shù)據(jù)支持下一步的研究與開發(fā)。本研究以B.velezensisBR-01菌株無菌發(fā)酵濾液對Xoc的抑菌圈直徑為因變量,通過提高發(fā)酵濾液的抑菌活性來間接提高抗菌肽的濃度,并使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometer,LC-MS)技術鑒定抗菌肽,為該菌株進一步的理論研究及后續(xù)的大田生防實驗提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

水稻細菌性條斑病菌(X.oryzaepv.oryzicola)GX01,由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室提供。貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)BR-01菌株分離自中藥土貝母的塊莖組織,在前期的實驗中已證明其對水稻細菌性條斑病菌具有較好的拮抗效果,菌株由本實驗室篩選、保存及鑒定。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L;NB (Nutrient Broth)培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g/L、酵母提取物 1.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L;PDB (Potato Dextrose Broth)培養(yǎng)基:馬鈴薯浸粉3.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L;Landy培養(yǎng)基:L-谷氨酸5.0 g/L、酵母提取物1.0 g/L、L-苯丙氨酸2 mg/L、葡萄糖20.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.15 g/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L、MnSO45 mg/L;YSP (Yeast Sucrose Peptone)培養(yǎng)基:蛋白胨2.0 g/L、酵母提取物1.0 g/L、蔗糖4.0 g/L;CM (Complete Medium)培養(yǎng)基:葡萄糖5.0 g/L、(NH4)2SO42.0 g/L、檸檬酸鈉1.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、K2HPO44.0 g/L、KH2PO46.0 g/L;NYBD (Nutrient Yeast Beef Dextrose)培養(yǎng)基:牛肉膏8.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L。以上培養(yǎng)基的pH值控制在7.0-7.2,固體培養(yǎng)基額外添加1.5%瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液離體抑菌活性測定

以Xoc為指示菌,采用牛津杯法和十字交叉法測定B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液離體抑菌活性[20]。取4 ℃低溫離心后獲得的B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵上清液,通過孔徑0.22 μm的細菌過濾器得到無菌發(fā)酵濾液。為保證培養(yǎng)皿底部平整,首先在培養(yǎng)皿底部鋪一層1 mm厚度的水瓊脂,再放置牛津杯。將加熱融化的NB固體培養(yǎng)基冷卻至45 ℃,以0.5%的體積分數(shù)加入108CFU/mL的指示菌液,搖晃均勻后倒入平皿中。冷卻后取出牛津杯,每孔加入0.1 mL無菌發(fā)酵濾液,以加入等量發(fā)酵培養(yǎng)基上清液為對照,重復3次處理。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d,觀察并測量抑菌圈直徑。

1.2.2B.velezensisBR-01菌株初始發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

從-80 ℃冰箱中取出B.velezensisBR-01甘油保藏菌液,分別接種到1.1.2節(jié)各初始固體培養(yǎng)基平板上。28 ℃培養(yǎng)48 h后,挑取單菌落接種至對應的液體培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h。參照1.2.1節(jié)制備各初始培養(yǎng)基發(fā)酵濾液并測定其離體抑菌活性,各試驗重復3次處理。

1.2.3 單因素試驗

以1.2.2節(jié)最優(yōu)培養(yǎng)基為初始發(fā)酵培養(yǎng)基,通過改變各組分種類及濃度或設置不同的培養(yǎng)條件,試驗各因素對B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液抑菌活性的影響,每次優(yōu)化后的結(jié)果進入隨后的條件優(yōu)化試驗。(1)碳源:將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源(酵母提取物)分別等質(zhì)量替換為玉米粉、淀粉、蔗糖、麥芽糖、糊精和葡萄糖,并調(diào)整最適碳源濃度。(2)氮源:將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源(蛋白胨)分別等質(zhì)量替換為花生餅粉、牛肉膏、酵母提取物、豆粕粉、胰蛋白胨、尿素,并調(diào)整最適氮源濃度。(3)無機鹽:在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上分別添加CaCl2、MgCl2、CaCO3、MnSO4、K2HPO4,添加量為0.1%(W/V),以不添加無機鹽為對照。(4)pH值:設置初始發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為4-9,設置6個梯度。(5)發(fā)酵時間:設置發(fā)酵時間為12-72 h,設置6個梯度。(6)溫度:設置搖床培養(yǎng)溫度為26-36 ℃,設置6個梯度。上述培養(yǎng)基配制后按每瓶100 mL分裝到250 mL三角瓶中,初始發(fā)酵條件為28 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h。參照1.2.1節(jié)制備各處理組發(fā)酵濾液并測定其離體抑菌活性,各試驗重復3次處理。

1.2.4 Plackett-Burman (PB)試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,采用Design-Expert 12軟件PB設計法進行試驗設計,以B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液抑菌圈直徑為響應值,設置培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件中各個單因素的高(+1)、低(-1)兩個水平,每組處理重復3次。參照1.2.1節(jié)制備各處理組發(fā)酵濾液并測定其離體抑菌活性,使用Design-Expert 12軟件處理試驗數(shù)據(jù),通過方差分析判斷各因素對發(fā)酵結(jié)果的重要程度,試驗設計見表1。

表1 PB試驗因素與水平設計

1.2.5 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗得到影響發(fā)酵結(jié)果的顯著因素,根據(jù)前期單因素試驗數(shù)據(jù)設計步長。顯著因素步長方向應與其效應方向一致,非顯著因素取單因素最優(yōu)水平,通過最陡爬坡試驗逼近發(fā)酵結(jié)果最優(yōu)值。

1.2.6 響應面優(yōu)化試驗

通過最陡爬坡試驗確定主要影響因子的最優(yōu)組合,以B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對Xoc的抑菌圈直徑為響應值,通過Design-Expert 12軟件設計3因素3水平Box-Behnken試驗(表2),建立最優(yōu)發(fā)酵條件并驗證。

表2 Box-Behnken試驗因素與水平設計

1.2.7 抗菌肽合成相關基因的檢測

根據(jù)文獻[21-24]的方法,利用特異性引物檢測Iturin、Bacillomycin D、Surfactin、Fengycin、和Bacilysin 5種抗菌肽的合成相關基因。PCR反應體系:1 μL模板DNA,10 μL 5×PCR buffer,5 μL dNTPs (2 mmol/L),1.5 μL上下游引物(10 μmol/L),0.6 μL DNA polymerase,ddH2O補足最終體積為50 μL。PCR擴增條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢查大小。

1.2.8 液相色譜質(zhì)譜法分析抑菌肽

參照Xu等[25]的方法從B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵上清液中純化獲得抗菌肽粗提物。采用LC-MS檢測和分析技術,利用Thermo Xcalibur 4.0軟件根據(jù)樣品的質(zhì)量-電荷比(m/z)測定目標物質(zhì)的相對分子量,并通過比較初步確定菌株產(chǎn)生的脂肽類型[26]。

色譜條件:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱溫30 ℃;自動進樣器溫度為10 ℃;正離子(ESI+)模式下流動相A為0.1%甲酸水,B為甲醇。樣品梯度洗脫程序:0.0-2.0 min,95% A-95% A;2.0-13.0 min,95% A-5% A;13.0-16.0 min,5% A-5% A;16.0-16.1 min,5% A-95% A;16.1-18.0 min,95% A-95% A,流速為0.3 mL/min,進樣體積為2 μL。質(zhì)譜條件:離子源為加熱型電噴霧(HESI),溫度為300 ℃;正離子模式下噴霧電壓為3.0 kV;傳輸毛細管溫度320 ℃,鞘氣壓力30 psi,輔助氣壓力10 psi;掃描模式為Full MS/dd-MS2,質(zhì)量為200-2 000 m/z,一級掃描和二級掃描分辨率分別為70 000 (FWHM)和17 500 (FWHM)。碰撞氣:高純氮氣。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

每個試驗至少獨立重復3次,結(jié)果以“平均值±標準差”表示。使用Design-Expert 12軟件進行PB試驗設計和Box-Behnken試驗設計并進行數(shù)據(jù)分析,得到擬合回歸方程,進行試驗方差分析。使用SPSS 20.0軟件對最佳初始培養(yǎng)基和單因素試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,并使用Duncan法進行顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適用于B.velezensis BR-01菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

B.velezensisBR-01菌株由不同的初始培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng),所獲得的發(fā)酵濾液的抑菌活性會有明顯的變化(圖1)。B.velezensisBR-01菌株以LB培養(yǎng)基和Landy培養(yǎng)基作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基時,其發(fā)酵濾液的抑菌活性顯著優(yōu)于其他培養(yǎng)基,抑菌圈直徑分別為(27.9±0.7) mm和(28.0±0.9) mm,兩者無顯著差異。綜合考慮成本因素,LB培養(yǎng)基為B.velezensisBR-01菌株最適初始發(fā)酵培養(yǎng)基。

Different letters show significant difference at 0.05 level.

2.2 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

在單因素試驗中,以麥芽糖為碳源、以酵母提取物為氮源時,B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對Xoc的抑菌圈直徑分別取得最大值[圖2:(a)、(b)],且隨著麥芽糖濃度和酵母提取物濃度的提高,抑菌圈直徑呈先增加后減小的趨勢[圖2:(c)、(d)]。與空白對照組(CK)相比,添加MgCl2對發(fā)酵濾液抑菌活性影響不顯著,添加CaCl2、MnSO4和CaCO3反而會不同程度地降低發(fā)酵濾液抑菌活性,只有添加KH2PO4可以略微提高發(fā)酵濾液抑菌活性[圖2(e)]。B.velezensisBR-01菌株在初始pH值為7、32 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h得到的發(fā)酵濾液對Xoc的抑菌圈直徑取得最大值[圖2:(f)、(g)、(h)]。單因素試驗結(jié)果表明,B.velezensisBR-01菌株的最適碳源為麥芽糖,最適碳源濃度為11 g/L,最適氮源為酵母提取物,最適氮源濃度為14 g/L,最適無機鹽為KH2PO4,最適pH值為7,最適發(fā)酵時間48 h,最適發(fā)酵溫度32 ℃。

2.3 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的響應面優(yōu)化

2.3.1 PB試驗結(jié)果

PB試驗設計與結(jié)果見表3。由方差分析可知,不同的因素對發(fā)酵結(jié)果的作用大小不同。其中麥芽糖(A)、酵母提取物(B)、溫度(F)影響作用顯著(P<0.05)且都為正效應,3因素按影響作用大小排序為溫度(F)>酵母提取物(B)>麥芽糖(A)(表4),選取這3個因素進入下一步試驗。

表3 PB試驗設計與結(jié)果

2.3.2 最陡爬坡試驗結(jié)果

最陡爬坡試驗結(jié)果見表5,最優(yōu)發(fā)酵條件組合為麥芽糖12 g/L、酵母提取物14 g/L、培養(yǎng)溫度32 ℃。在此發(fā)酵條件下,B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對Xoc的抑菌圈直徑最大,為42.1 mm,取該組合為響應中心點,進入下一步試驗。

表5 最陡爬坡路徑試驗設計與結(jié)果

2.3.3 Box-Behnken試驗結(jié)果

Box-Behnken試驗設計與結(jié)果見表6。使用Design-Expert 12軟件對Box-Behnken 試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液抑菌圈直徑(Y)對麥芽糖(X1)、酵母提取物(X2)、溫度(X3)的回歸方程:Y=42.07-0.58X1-0.26X2+0.71X3+0.43X1X2+0.13X1X3-0.50X2X3-2.23X12-0.41X22-1.76X32。方差分析結(jié)果顯示,該模型回歸擬合度P值<0.000 1,回歸顯著;模型失擬值P=0.240 0>0.05,失擬項不顯著,模型穩(wěn)定誤差小。該模型的決定系數(shù)R2=0.992 5,校正決定系數(shù)R2=0.979 0,模型擬合度較好,預測可信度較高(表7)。

表6 Box-Behnken試驗設計與結(jié)果

表7 Box-Behnken 試驗統(tǒng)計分析

采用Design-Expert 12軟件,根據(jù)上述擬合方程繪制顯著因子間相互作用的響應面曲線圖(圖3)。由結(jié)果可知,響應面曲線圖均為凸面圖,存在抑菌率獲得最大值的發(fā)酵條件組合。通過軟件求解回歸方程得到以下最優(yōu)解決方案:麥芽糖(X1)11.82 g/L、酵母提取物(X2)13.42 g/L、溫度(X3)32.3 ℃,最大抑菌圈直徑預測為42.3 mm。

圖3 各培養(yǎng)因素對抑菌圈直徑交互影響的響應面

2.4 響應面最優(yōu)條件驗證

按照Box-Behnken試驗預測值優(yōu)化發(fā)酵條件顯著因素,按照單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵條件非顯著因素,得到全部發(fā)酵條件如下:麥芽糖11.89 g/L、酵母提取物13.54 g/L、NaCl 5 g/L、KH2PO41 g/L、初始pH值為7、發(fā)酵時間48 h、培養(yǎng)溫度32.3 ℃。為驗證響應面最優(yōu)條件的可行性,在該優(yōu)化方案下制備B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液并測定其對Xoc的離體抑菌活性,試驗重復3次處理。結(jié)果顯示,B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對Xoc的抑菌圈直徑為(42.5±0.2) mm(圖4),與回歸模型預測的最大抑菌圈直徑42.3 mm相近,表明回歸模型合理、可信。

Values given are the means±standard deviations of triplicate measurements.

優(yōu)化前使用LB培養(yǎng)基制備的B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對Xoc的抑菌圈直徑為(28.0±0.9) mm,優(yōu)化后制備的B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液對Xoc的抑菌圈直徑相比優(yōu)化前增加了51.79%,表明采用優(yōu)化發(fā)酵方案可以有效提高B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性物質(zhì)濃度。

2.5 抗菌肽合成相關基因的檢測

本研究從B.velezensisBR-01菌株中成功擴增到與Iturin合成相關的基因ituA和ituD,與Bacillomycin D合成相關的基因bmyB和bmyC,與Surfactin合成相關的基因srfAA,與Fengycin合成相關的基因fenB和fenD,與Bacillysin合成相關的基因bacA和bacD(圖5)。結(jié)果表明,B.velezensisBR-01菌株具有產(chǎn)生多種抗菌肽的潛力。

Hole M represents Maker,hole 1-10 represent ituA,ituD,bmyC,bmyB,srfAA,fenB,fenD,bacD,bacA and non-template control in sequence.

2.6 LC-MS技術分析抑菌肽

芽孢桿菌可以代謝多種類型的抗菌肽,相當數(shù)量的抗菌肽具體組成和相對分子質(zhì)量已經(jīng)確定[26-28]。本研究采用LC-MS檢測技術分析B.velezensisBR-01菌株抗菌肽粗提取物的成分,結(jié)合對應于質(zhì)譜的色譜圖中每個時間段出現(xiàn)的峰,根據(jù)相對分子質(zhì)量和“-CH2-”脂肪鏈的結(jié)構(gòu)特征分析質(zhì)譜中的一系列單峰,結(jié)合2.5節(jié)抗菌肽合成相關基因的檢測結(jié)果作出以下推測:(1)推測m/z271.15為抗菌二肽Bacilysin [圖6(a)];(2)推測m/z1 008.66、m/z1 022.67和m/z1 036.69為Surfactin同系物[圖6(b)];(3)推測m/z1 044.66、m/z1 058.67、m/z1 072.69和m/z1 086.70為Iturin同系物[圖6(c)];(4)推測m/z1 463.80、m/z1 477.82和m/z1 491.83為Fengycin同源物[圖6(d)]。基于上述結(jié)果,推測該菌株可能產(chǎn)生4種抗菌肽:Bacilysin、Surfactin、Iturin和Fengycin (表8)。

(a) Bacilysin,MS spectra of m/z 271.15; (b) Surfactin,MS spectra of m/z 1 008.66,m/z 1 022.67 and m/z 1 036.69;(c) Iturin,MS spectra of m/z 1 044.66,m/z 1 058.67,m/z 1 072.69 and m/z 1 086.70;(d) Fengycin,MS spectra of m/z 1 463.80,m/z 1 477.82 and m/z 1 491.83.

表8 抗菌肽脂粗提物的LC-MS分析

3 討論

貝萊斯芽孢桿菌因其豐富的抗菌肽產(chǎn)物被廣泛應用于多種植物病害的生物防治。Cao等[29]分析了對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和青枯菌(Ralstoniasolanacearum)有拮抗作用的兩株B.velezensis的抗菌代謝產(chǎn)物,共鑒定到3種脂肽化合物(Surfactin、Iturin和Fengycin),其中Iturin在防御病原真菌方面起主要作用。B.velezensisIP22菌株能夠顯著減輕野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種(X.campstrispv.vesicatoria)侵染造成的辣椒細菌性斑點病,利用高效液相色譜質(zhì)譜技術可檢測到該菌株抗菌代謝產(chǎn)物中的Fengycin和Locillomycin家族[30]。Wu等[31]報道B.velezensisFZB42中的Difficidin和Bacilysin對水稻黃單胞菌具有拮抗活性。本研究利用特異性引物PCR擴增B.velezensisBR-01菌株的基因組DNA,并使用LC-MS技術初步將B.velezensisBR-01菌株抗菌肽成分鑒定為Bacilysin、Surfactin、Iturin和Fengycin。其中Surfactin和Bacilysin被認為具有抗細菌的功能[32,33],可能對水稻細菌性條斑病菌具有拮抗活性。

抗菌肽在農(nóng)業(yè)病蟲害防控領域具有廣闊的應用前景,利用微生物生產(chǎn)抗菌肽是一個現(xiàn)實可行的選擇。但是微生物生產(chǎn)抗菌肽是一個復雜的發(fā)酵過程,只有合適的發(fā)酵環(huán)境,才能讓目標菌株的生產(chǎn)性能得到充分的釋放[34]。本研究以B.velezensisBR-01菌株無菌濾液對Xoc的抑菌圈直徑為因變量,通過提高發(fā)酵濾液的抑菌活性來間接提高抗菌肽的濃度。在碳源篩選試驗中B.velezensisBR-01菌株對麥芽糖、葡萄糖等速效碳源利用率較高,而對淀粉、玉米粉等遲效碳源利用率較低,這與黎燕珊等[16]研究結(jié)果相近,但與趙曉燕等[35]研究發(fā)現(xiàn)菌株B.amyloliquefaciensXLA03的最佳碳源為玉米淀粉不同。在氮源篩選試驗中B.velezensisBR-01菌株幾乎不能利用無機氮源尿素,在有機氮源范圍內(nèi)更偏好酵母提取物、蛋白胨等速效氮源,對遲效氮源花生餅粉利用效率較差,這與張曉勇等[36]的研究結(jié)果相近。肖靚等[37]研究報道菌株B.subtilisP5添加CaCl2時對辣椒炭疽病抑菌活性最強;張冬冬等[38]研究表明MnSO4、CaCl2對菌株B.malacitensisZ-5的生長有顯著的促進作用;侯美如等[39]發(fā)現(xiàn)菌株B.amyloliquefaciensSSYB以CaCO3為無機鹽時產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵中藥材黃芪的能力最強;張志焱等[40]報道添加KH2PO4后菌株B.subtilisBL0006的抗菌肽殺菌價效最高。本研究中只有KH2PO4對B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性有一定的促進作用,但效果不顯著,可能是因為培養(yǎng)基中的酵母提取物和NaCl已經(jīng)滿足B.velezensisBR-01菌株發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽對無機鹽的營養(yǎng)代謝需求。在發(fā)酵條件優(yōu)化方面,發(fā)現(xiàn)B.velezensisBR-01菌株最適pH值為7,其在中性偏弱堿性環(huán)境下抑菌活性較高,與張曉勇等[36]的研究結(jié)果相近,但與Ye等[41]研究發(fā)現(xiàn)菌株B.amyloliquefaciensS1適合在偏弱酸性或中性環(huán)境下生長不同。B.velezensisBR-01菌株在32.3 ℃條件下培養(yǎng)48 h后其抑菌活性最強,其中發(fā)酵時間與郭艷霞等[19]的研究結(jié)果相近,發(fā)酵溫度與黎燕珊等[16]的研究結(jié)果相近。

為提高B.velezensisBR-01菌株產(chǎn)抗菌肽的能力,增加其對水稻細菌性條斑病的生防價值,本研究在單因素試驗的基礎上,對培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件設計了多因素的組合試驗。微生物發(fā)酵因素優(yōu)化的常規(guī)方法是正交試驗設計,正交試驗設計能夠同時兼顧多因素對發(fā)酵結(jié)果的影響,尋求各因素最佳水平的組合。但正交試驗設計無法構(gòu)建微生物發(fā)酵響應值的回歸方程,從而無法通過數(shù)學模型獲得最優(yōu)解[42,43]。本研究利用響應面分析法優(yōu)化B.velezensisBR-01菌株產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基和發(fā)酵條件,與正交試驗設計相比,響應面分析法試驗次數(shù)少,試驗精度高,能夠綜合考慮多因素間的交互作用并構(gòu)建回歸方程,是近年來微生物發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化和工藝考察的首選[44-46]。

結(jié)合文獻分析和本研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)不同來源的貝萊斯芽孢桿菌菌株在不同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的抗菌肽的成分與含量存在一定差異,這種差異是貝萊斯芽孢桿菌菌株間拮抗能力、拮抗譜多樣性的基礎。B.velezensisBR-01菌株的分離與研究為水稻細菌性條斑病的生物防治提供了新的微生物資源與理論基礎。

4 結(jié)論

B.velezensisBR-01菌株高產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基配方為麥芽糖11.89 g/L、酵母提取物13.54 g/L、NaCl 5 g/L、KH2PO41 g/L。最適發(fā)酵條件為初始pH值7、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度32.3 ℃?？咕闹饕煞殖醪借b定為Bacilysin、Surfactin、Iturin和Fengycin。該方案可用于快速、批量發(fā)酵制備B.velezensisBR-01菌株生防菌液。本研究結(jié)果為該菌株抗菌肽的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及田間生防利用等后續(xù)研究提供了理論基礎。