楊嘉敏 平淵

基因編輯是指特異性改變基因序列，利用酶來(lái)對(duì)DNA鏈進(jìn)行剪切，移除已有的DNA片段，或者插入代替的DNA片段的技術(shù)。在過(guò)去的20多年里，以核酸酶為基礎(chǔ)的基因編輯工具的出現(xiàn)，帶來(lái)了基因編輯技術(shù)的蓬勃發(fā)展。與傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)相比，基于核酸酶的基因編輯技術(shù)減少了外源基因的隨機(jī)插入，提高了對(duì)基因組特定片段進(jìn)行精確修飾的概率。

基于DNA核酸酶的基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，從第一代鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease， ZFN）基因編輯系統(tǒng)、第二代轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶[transcription activator-like （TAL） effector nuclease， TALEN]基因編輯系統(tǒng)，到第三代CRISPR/ Cas9系統(tǒng)，基因編輯效率不斷提高，成本不斷降低，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。

1996年，相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)將兩種不同的鋅指蛋白（zinc finger protein， ZFP）（負(fù)責(zé)識(shí)別DNA位點(diǎn)）和FokⅠ內(nèi)切酶的切割區(qū)域（負(fù)責(zé)切割DNA）連接在一起，構(gòu)建了ZFN基因編輯系統(tǒng)。該技術(shù)使人工定點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂成為現(xiàn)實(shí)，實(shí)現(xiàn)了基因編輯技術(shù)里程碑式的突破；2001年開(kāi)始陸續(xù)用于不同物種的基因編輯，不僅可構(gòu)建基因編輯模式生物，還可用于遺傳育種和基因治療。

然而，ZFN系統(tǒng)存在精準(zhǔn)性欠佳和細(xì)胞毒性等問(wèn)題，隨后出現(xiàn)的TALEN基因編輯系統(tǒng)在一定程度上改善了上述問(wèn)題。和ZFN系統(tǒng)類(lèi)似，TALEN系統(tǒng)由識(shí)別特異DNA序列的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)蛋白（TALEs）及Fok I內(nèi)切酶組成。該技術(shù)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，大大提高編程性能，自2011年建立后迅速用于構(gòu)建基因修飾動(dòng)物模型、遺傳育種和基因治療等領(lǐng)域。

第三代基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)很快掩蓋了ZFN和TALEN的光芒。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由核酸酶Cas9和特異性識(shí)別基因組序列的向?qū)NA（guiding RNA， gRNA）組成。發(fā)揮DNA剪切功能的Cas9元件是通用的，因此只需要根據(jù)靶基因的不同設(shè)計(jì)相應(yīng)的gRNA即可，其設(shè)計(jì)難度和復(fù)雜度遠(yuǎn)低于ZFN和TALEN，大大拓展了CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用前景[1]。2012年，系列體外實(shí)驗(yàn)證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于基因編輯的可能性[1]，2013年，該系統(tǒng)被應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因組的多位點(diǎn)精準(zhǔn)編輯[1]，這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)了基因編輯研究和應(yīng)用的爆炸性增長(zhǎng)。

基因編輯工具只有被遞送到靶點(diǎn)部位才能真正發(fā)揮作用，其在應(yīng)用于疾病治療時(shí)主要有兩種遞送形式：一是從患者體內(nèi)提取需要改造的細(xì)胞，在體外用基因編輯技術(shù)進(jìn)行工程化改造后，再回輸至患者體內(nèi)；二是通過(guò)各種形式的制劑實(shí)現(xiàn)基因編輯系統(tǒng)在體內(nèi)的遞送，把基因“手術(shù)刀”遞送至靶組織或靶細(xì)胞中進(jìn)行治療。

然而，在遞送過(guò)程中存在諸多挑戰(zhàn)。首先，為了防止不良反應(yīng)的產(chǎn)生，需要把基因編輯工具準(zhǔn)確遞送體到內(nèi)的特定部位。筆者團(tuán)隊(duì)曾在2021年開(kāi)發(fā)了一種具有炎癥靶向性的基因編輯前藥系統(tǒng)[3]，選用一種受小分子調(diào)控的Cas9變體，并將這種小分子設(shè)計(jì)成只有在炎癥環(huán)境中才能被激活的前藥，從而減少了基因編輯治療過(guò)程中的組織脫靶問(wèn)題。其次，基因編輯工具通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并非易事。對(duì)于CRISPR/ Cas系統(tǒng)而言，遞送主要分為gRNA的遞送和Cas蛋白的遞送。其中，gRNA可以直接以RNA形式遞送，或通過(guò)質(zhì)粒DNA形式遞送到體內(nèi)后再完成轉(zhuǎn)錄；而Cas蛋白有3種遞送形式：遞送對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒DNA、mRNA或直接遞送蛋白。這些生物大分子由于尺寸問(wèn)題和特殊的荷電性質(zhì)，往往需要特定的載體或物理方法來(lái)介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞[4]，如使用病毒載體和非病毒載體、采用顯微注射、電穿孔、基于微流控的技術(shù)等物理方法等[5]。

病毒系統(tǒng)是相對(duì)來(lái)說(shuō)比較成熟的基因編輯遞送系統(tǒng)，常用的載體有整合酶缺陷型慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和腺病毒載體。

整合酶缺陷型慢病毒載體

整合酶缺陷型慢病毒載體由慢病毒改造而來(lái)，由于整合酶缺陷而無(wú)法將目的基因整合入宿主的基因組中，具有一定的安全性。這類(lèi)系統(tǒng)可被用于遞送ZFN基因編輯工具。在體外，整合酶缺陷型慢病毒可通過(guò)遞送ZFN基因編輯工具的mRNA和供體DNA模板，在各種細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因編輯。然而在某些細(xì)胞系內(nèi)，該系統(tǒng)的編輯效率并不高，同時(shí)，其基因編輯效果會(huì)隨著靶點(diǎn)細(xì)胞的分裂而逐漸減弱[2]。

腺相關(guān)病毒載體

腺相關(guān)病毒載體是一種含有單鏈線狀DNA的小型無(wú)包膜病毒，其基因組中包含兩個(gè)反向末端重復(fù)序列，通常需要在輔助病毒的幫助下才能發(fā)揮作用。而重組腺相關(guān)病毒從野生型腺相關(guān)病毒改造而來(lái)，傳遞基因時(shí)不需要輔助病毒，已被廣泛用于基因編輯系統(tǒng)的體內(nèi)和體外遞送。有研究表明，在某些情況下，用腺相關(guān)病毒載體遞送基因編輯工具的效率高于整合酶缺陷型慢病毒載體[2]，且遞送CRISPR基因編輯工具時(shí)可以實(shí)現(xiàn)持久的編輯[6]。然而，這類(lèi)編輯系統(tǒng)的應(yīng)用也存在一系列的挑戰(zhàn)，如重組腺相關(guān)病毒載體所能荷載的基因組大小有限，僅5.0 kb左右，使用時(shí)需要控制“貨物”的大??；同時(shí)，它的持久編輯功能可能導(dǎo)致CRISPR/ Cas工具過(guò)表達(dá)，造成脫靶效應(yīng)；此外，還可能會(huì)帶來(lái)免疫原性問(wèn)題，引發(fā)一些免疫毒性[6]。

腺病毒載體

腺病毒載體是一種含雙鏈DNA的病毒，由于感染能力較強(qiáng)、基因不整合到宿主細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床上最常用的基因治療病毒載體。第一項(xiàng)用于人體的基因編輯臨床試驗(yàn)就是利用的腺病毒載體遞送系統(tǒng)。CCR5是存在于T細(xì)胞表面的一種可以協(xié)助HIV病毒入侵的受體，在體外用攜帶ZFN基因編輯工具的載體系統(tǒng)敲除CCR5基因后，產(chǎn)生不會(huì)被HIV感染的T細(xì)胞。自體移植后，抗HIV小分子藥物治療中斷后，CCR5敲除的T細(xì)胞比正常T細(xì)胞存活得更好[7]。

非病毒介導(dǎo)的基因編輯遞送系統(tǒng)盡管基因組編輯酶的效率不如病毒遞送方法，但其核酸酶活性具有瞬時(shí)優(yōu)勢(shì)。更重要的是，與病毒載體不同，非病毒載體可以重復(fù)給藥，從而提高基因編輯成功的機(jī)會(huì)。

物理遞送方法

通過(guò)物理方法破壞細(xì)胞膜或使之變形，將基因編輯工具遞送到細(xì)胞內(nèi)，常用的物理遞送方法有顯微注射、電穿孔、微流控等。

顯微注射是轉(zhuǎn)染效率極高的一種遞送方法，且遞送的“貨物”大小不受限制，常用于遞送核酸類(lèi)大分子，如用微米級(jí)別的針頭穿破細(xì)胞膜，將可以編碼CRISPR/Cas工具的質(zhì)粒DNA直接注射到細(xì)胞中。該方法還可以用于遞送mRNA等，從而在胞內(nèi)表達(dá)基因編輯工具[5]。

同顯微注射一樣，電穿孔也是較為成熟的物理遞送方法，通過(guò)電場(chǎng)作用增加細(xì)胞膜的通透性，從而介導(dǎo)DNA、核糖核蛋白復(fù)合物等生物大分子進(jìn)入。研究顯示，與DNA相比，電穿孔方法導(dǎo)入核糖核蛋白復(fù)合物時(shí)具有更高的效率，且不易形成脫靶。但由于在體內(nèi)難以控制電穿孔需要的各種參數(shù)，該技術(shù)目前多被用于體外基因編輯。

基于微流控的技術(shù)通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入小孔徑的通道，造成細(xì)胞膜的瞬間形變，從而導(dǎo)入與基因編輯工具相關(guān)的生物大分子。相對(duì)于電穿孔法，這種通過(guò)機(jī)械變形來(lái)改變細(xì)胞膜通透性的方法具有更強(qiáng)的安全性，然而效率相對(duì)較低[8]。

合成納米粒遞送載體

除物理方法遞送基因編輯系統(tǒng)外，人工合成的納米材料也可以將基因編輯工具遞送進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，目前研究較多的納米粒載體有脂質(zhì)體類(lèi)、聚合物等。

脂質(zhì)納米粒是一種常見(jiàn)的人工合成基因編輯遞送系統(tǒng)，用于基因編輯遞送的陽(yáng)離子脂質(zhì)體通常由三部分組成：陽(yáng)離子頭部、疏水尾部和兩者之間的連接基團(tuán)[4]。一般情況下，呈電中性的物質(zhì)更易穿過(guò)細(xì)胞膜，而陽(yáng)離子脂質(zhì)納米粒不僅以靜電結(jié)合力將“貨物”成功裝載，還給“貨物”裝上了一層電中性的偽裝，使得這些生物大分子可以過(guò)細(xì)胞膜。和病毒載體相似，脂質(zhì)納米粒應(yīng)用范圍較廣，可用于體內(nèi)和體外的基因編輯；不同的是，脂質(zhì)納米粒免疫原性較弱，相對(duì)更為安全[5]。目前，已成功利用脂質(zhì)納米粒載體向哺乳動(dòng)物細(xì)胞遞送CRISPR/Cas9基因編輯工具。

然而，脂質(zhì)納米粒載體在遞送過(guò)程中也存在一些挑戰(zhàn)。首先，納米顆粒被轉(zhuǎn)入細(xì)胞時(shí)會(huì)被小泡包裹，進(jìn)一步發(fā)展成溶酶體，若所遞送的“貨物”無(wú)法“逃脫”，則會(huì)被分解，繼而失效。其次，基因編輯工具若無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核，則不能真正發(fā)揮作用。再次，基因治療需要在靶細(xì)胞中發(fā)揮作用[5]。因此，若要實(shí)現(xiàn)較高的基因編輯效率，需要對(duì)脂質(zhì)納米粒載體系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)修飾，如用聚乙烯亞胺改變其荷載能力、用二油?；字Ｒ掖及吩鰪?qiáng)脂質(zhì)體的膜融合能力，或用靶向肽增加其靶向能力等。

除了脂質(zhì)納米粒載體，以高分子水凝膠納米顆粒、金納米粒、石墨烯氧化物、黑磷納米薄片等材料為基礎(chǔ)的人工合成的聚合物也在基因編輯遞送方面有所應(yīng)用[9]。例如，合成能夠?qū)崿F(xiàn)多功能核定位的核殼人工病毒，利用其裝載表達(dá)CRISPR/Cas9質(zhì)粒，可實(shí)現(xiàn)特定基因的敲除；合成可生物降解的多肽和多糖雜交載體，利用其遞送CRISPR/Cas9質(zhì)?；騧RNA和sgRNA復(fù)合物，可靶向巨噬細(xì)胞進(jìn)行基因編輯等。然而，脂質(zhì)納米粒和聚合物納米粒易對(duì)細(xì)胞造成損害，且存在體內(nèi)基因編輯效率較低等問(wèn)題。

基因編輯效率高的病毒載體存在脫靶和安全性問(wèn)題，而安全性相對(duì)較高的非病毒載體的遞送效率又不高。因此近年來(lái)，科學(xué)家將目光放在了病毒樣顆粒上。

病毒樣顆粒是指保留了病毒的部分結(jié)構(gòu)（如包膜和衣殼），但不具有病毒基因組的載體系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)mRNA、蛋白質(zhì)及核糖核蛋白復(fù)合物的胞內(nèi)遞送。目前，病毒樣顆粒大多由慢病毒改造而來(lái)，其中HIV-1是最常用的慢病毒。Gag蛋白是HIV-1的主要結(jié)構(gòu)蛋白。研究人員用HIV-1蛋白酶剪切連接子將Cas9和Gag蛋白連接起來(lái)，利用病毒樣顆粒和T細(xì)胞之間的親和力，實(shí)現(xiàn)了對(duì)T細(xì)胞的靶向基因編輯。

相比于傳統(tǒng)的病毒載體，病毒樣顆粒不包含病毒的遺傳物質(zhì)，不會(huì)將外源DNA整合到宿主基因組，也不會(huì)引起感染，可能比其他使用實(shí)際病毒的遞送方法更安全。同時(shí)，這種遞送系統(tǒng)往往保留和病毒侵染、釋放相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以達(dá)到比較高的遞送效率，為基因編輯工具的體內(nèi)精準(zhǔn)應(yīng)用又增添了一絲曙光。

目前，大量基于基因編輯的治療方法正在全球范圍內(nèi)開(kāi)展臨床試驗(yàn)，為癌癥、心血管疾病、神經(jīng)病變、代謝類(lèi)疾病、眼部疾病等疑難雜癥提出了許多潛在的治療方案。美國(guó)研發(fā)的NTLA-2001基因編輯療法在治療轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性患者的臨床I期試驗(yàn)中，取得了令人振奮的結(jié)果；Editas公司開(kāi)發(fā)的基因編輯療法EDIT-301也在進(jìn)行人體臨床研究，有望治療鐮狀細(xì)胞病與輸血依賴(lài)性β地中海貧血癥；基于CRISPR技術(shù)改造的CAR-T細(xì)胞療法CTX110得到美國(guó)FDA授予的再生醫(yī)學(xué)先進(jìn)療法認(rèn)定，用于治療復(fù)發(fā)或難治性CD19+B細(xì)胞惡性腫瘤。

基因編輯技術(shù)有巨大的臨床應(yīng)用潛力，然而，想要將這把“手術(shù)刀”安全地用于治療時(shí)，仍有許多問(wèn)題需要解決。例如，有些疾病涉及的細(xì)胞更新速度很快，而目前的基因編輯技術(shù)多用于可以持久發(fā)揮療效的永生細(xì)胞；治療有些疾病時(shí)需要編輯大量的基因，而目前的基因編輯遞送技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)這樣的效率；基因編輯遞送方法眾多，但并沒(méi)有哪種方法是絕對(duì)完美的，仍需要去選擇平衡其編輯效率、安全性和靶向性。不過(guò)，基因編輯遞送系統(tǒng)的發(fā)展速度十分迅速，我們有理由相信，未來(lái)會(huì)有更多精準(zhǔn)、有效、安全的基因編輯療法出現(xiàn)，越來(lái)越多的疾病將找到合適的治療方法。

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關(guān)鍵詞：基因編輯 遞送系統(tǒng) 病毒 合成納米粒 ■